Zeitraffer-Mikroskopie der frühen Embryogenese in Caenorhabditis elegans

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, subzelluläre Ereignisse während der frühen Embryogenese Insino Ratu elegance aufzuzeichnen. Dies wird durch die Verwendung transgener Stämme mit mehreren fluoreszenzmarkierten Proteinen erreicht, die die Visualisierung von DNA sowie von Untergruppen von Vesikeln ermöglichen. Im frühen Embryo werden spezifische Organellen durch eine Mikroinjektion von Fluoreszenzfarbstoffen, wie z.B. Lyo tracker oder MIT tracker, in die Gonade des erwachsenen Wurms markiert. Als nächstes werden Embryonen aus adulten Würmern herausgeschnitten und mit einem konfokalen Mikroskop beobachtet, um Zeitrafferaufnahmen der Bewegungen der markierten Proteine in Organellen zu erhalten.

Letztendlich zeigt das Protokoll eine interessante Bewegung von Lysosomen und GFP-markierten Vesikeln während der frühen Entwicklung bei CL-Allerganen. Mein Name ist Connie Hedger, und heute zeige ich Ihnen, wie wir in unserem Labor, dem Boyd-Labor an der University of Alabama in Huntsville, Zeitraffermikroskopie durchführen. Für dieses Experiment pflücken Gro-Nematoden auf NGM-Agri-Platten, die am Tag vor dem Experiment mit einem OP 50-Bakterienrasen bei 25 Grad Celsius sitzen, mindestens 40 L vier Larven auf sitzende Platten und brüten sie über Nacht bei 25 Grad Celsius aus.

Diese Würmer werden junge Erwachsene sein. Für das Experiment. Stellen Sie ein Injektionspad her, indem Sie zwei Tropfen 2%aros in Wasser aus einer früheren Pipette zwischen zwei Deckglasscheiben legen und Druck ausüben, um das Agros zu einem Kreis mit einem Durchmesser von 1,5 Zentimetern zu formen.

Entfernen Sie den oberen Abdeckbezug und trocknen Sie das Pad aus, indem Sie es eine Stunde lang in einen 80 Grad Celsius heißen Ofen legen oder über Nacht auf der Arbeitsplatte ruhen lassen. Bereiten Sie am Tag der Injektion eine verdünnte MIT-Tracker- oder Lyo-Tracker-Farbstofflösung vor und ziehen Sie Injektionsnadeln aus einer Glaskapillare mit 1,2 od. Füllen Sie die Nadeln mit einer verdünnten Farbstofflösung auf und lagern Sie sie in einer dunkel befeuchteten Kammer, montieren Sie die Injektionsnadel auf dem Mikromanipulator und verbinden Sie die Nadel mit einem Druckregler mit einem Schlauch mit einem Innendurchmesser von 1,2 Millimetern.

Geben Sie nun zwei Tropfen schweres Mineralöl auf das Injektionskissen. Legen Sie das Injektionskissen auf das Mikroskop und senken Sie die Nadel in das Öl. Üben Sie Injektionsdruck aus und beobachten Sie, ob Flüssigkeit aus der Nadel fließt.

Wenn nicht, musst du das Ende der Nadel vorsichtig brechen, indem du die Spitze vorsichtig in ein kleines Stück zerbrochenes Deckglas treibst, das auf dem Injektionspad platziert ist. Nachdem die Nadel fließt, fahren Sie mit der Injektion eine Stunde vor der Betrachtung der Embryonen fort. Verwenden Sie ein Bild, um junge erwachsene Würmer in den Öltropfen auf dem Injektionskissen zu übertragen.

Ordnen Sie drei bis 10 Würmer parallel und etwas weniger als eine Wurmlänge voneinander entfernt an. Jetzt ist es wichtig, die Würmer schnell zu injizieren, bevor die Würmer austrocknen. Bewegen Sie das Pad mit den Würmern auf den Mikroskoptisch.

Fokussieren Sie sich auf den zentralen Teil der distalen Gonade. Bewegen Sie dann mit dem Mikromanipulator die Spitze der Nadel in die gleiche Fokusebene. Durchstechen Sie den Wurm, indem Sie den Tisch horizontal bewegen.

Wenn sich die Nadelspitze in der Kusse befindet, üben Sie Druck aus, um die Gonade mit der Farbmischung zu füllen. Die Gonade dehnt sich mit dem Volumen der Injektion aus. Fahren Sie mit der Injektion fort.

Beide gehen nach der Injektion in die Netzarme jedes Wurms. Bedecken Sie die Würmer mit 0,5 Millilitern aufgetragenem Eipuffer. Lassen Sie die Würmer dann mit einer gezogenen Weidepipette ein bis zwei Stunden bei Raumtemperatur in einer lichtfreien, befeuchteten Kammer erholen.

Beginnen Sie mit der Vorbereitung eines neuen Agros-Pads, um die injizierten Embryonen mit einer früheren Pipette zu betrachten. Geben Sie drei Tropfen geschmolzenes Agros auf einen sauberen Objektträger und platzieren Sie diesen Objektträger zwischen zwei anderen Objektträgern, die in eine Beschriftungsschicht eingewickelt sind. Mit Klebeband steuert das Klebeband die Dicke des Pads.

Drücken Sie dann den sauberen Objektträger auf die Agros-Tropfen, so dass er auf den Objektträgern aufliegt. Entfernen Sie den oberen Objektträger erst, wenn die Embryonen bereit sind, sich zu montieren. Lassen Sie nun 20 Mikroliter Eipuffer auf die Mitte eines Deckglases fallen und übertragen Sie die injizierten Würmer in den Puffer. Schneiden Sie unter einem Präpariermikroskop die Würmer in der Nähe der Vulva auf.

Mit einer 26-Gauge-Injektionsnadel werden die Embryonen aus dem Wurm herausgequollen. Entfernen Sie nun den oberen Objektträger des Objektträgers und senken Sie das aros pad kopfüber auf das Deckglas mit den Embryonen. Wenn die Embryonen über einen längeren Zeitraum abgebildet werden, versiegeln Sie die Ränder des Deckglases mit Vaseline, um ein Austrocknen zu verhindern.

Beginnen Sie nun mit der Bildgebung, indem Sie Embryonen unter dem 10-fach-Ziel lokalisieren, um Embryonen im Frühstadium zu finden, suchen Sie nach Embryonen, die gerade dabei sind, die mütterliche Meiose abzuschließen. Myotische Embryonen können von späteren Embryonen dadurch unterschieden werden, dass sie nicht verkürzt wurden. Nach Abschluss der Meiose entsteht am vorderen Ende des Embryos eine signifikante Lücke zwischen der Zellmembran und der Eischale.

Sobald ein geeigneter Embryo identifiziert ist, wechseln Sie zu einer Linse mit höherer Vergrößerung, um die Embryogenese aufzuzeichnen. Dieser Embryo exprimiert sowohl M-Kirsch-Histon, zwei B- als auch GFP-Ubiquitin-markierte Proteine. Die mütterliche und väterliche DNA ist über die M-Kirsche H zwei B sichtbar und zeigt somit die Stadien der frühen Entwicklung.

Dieser Embryo wurde mit OC Tracker blue injiziert und exprimiert GFP Ubiquitin. Die Bilder wurden mit einem 63 x 1,4 NA-Objektiv mit 4 88 und 5 55 Lasern aufgenommen, die auf minimale Leistung und maximale Verstärkung eingestellt waren. In der Regel werden Zacks alle 10 bis 15 Sekunden für bis zu 60 Zeitpunkte gesammelt, bevor es zum Photobleaching kommt.

Für dieses Zeitraffervideo wurden die Z-Stapel während des Zeitraffers in maximale Projektionsbilder reduziert. Mikroskopie-Embryonen sollten innerhalb weniger Minuten nach Abschluss der zweiten Myose und innerhalb von 20 Minuten mit der pronukleären Migration beginnen. Die erste Zytokinese sollte beginnen.

Wenn Sie einen Entwicklungsstillstand Ihrer Embryonen beobachten, versuchen Sie, die Laserintensität zu verringern oder verwenden Sie ein dickeres Augura-Pad-Pad.