Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling und anschließende Fluorescence Activated Cell Sorting für Kultur-unabhängige Identifizierung von gelöstem organischem Kohlenstoff abbauenden Bakterioplankton

Mikroben vermitteln den Abbau zahlreicher gelöster organischer Kohlenstoffsubstrate oder DOC-Verbindungen, wie z. B. Racine und aquatische Umgebungen. Um die Rolle von Mikroben bei der DOC-Transformation vollständig zu verstehen, ist die gleichzeitige Identifizierung ihrer Taxonomie und Funktion erforderlich. Dieses Video zeigt ein Verfahren zur taxonomischen Identifizierung von frei lebenden Bakterien oder bakteriellem Plankton, das bestimmte Pools von DOC und aquatischen Umgebungen verändert.

Wasserproben, die in einer Testumgebung entnommen werden, werden verarbeitet und mit einer Verbindung von Interesse und Bromdesoxyuridin, BRDU, inkubiert, die in neu synthetisierte DNA und aktiv wachsende Zellen eingebaut wird. Als nächstes wird BRDU-markiertes Bakterienplankton mit ZI-konjugierten Anti-BRDU-Antikörpern markiert. Bakterielles Plankton mit einem hohen Grad an BRDU-Markierung wird durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung isoliert.

Anschließend wird die DNA aus den sortierten Zellen extrahiert und die taxonomische Identifizierung auf der Grundlage der Ergebnisse der PCR-basierten 16-s-ribosomalen RNA-Genanalyse durchgeführt. Hallo, mein Name ist Steven Robbins aus dem Labor von Dr. Chen Mao am Department of Biological Sciences an der Kent State University. Heute zeigen wir Ihnen eine kulturunabhängige Methode zur Identifizierung von DOC-abbauendem bakteriellem Plankton in aquatischen Umgebungen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Nährstoffänderungen, gefolgt von der Analyse der DNA der Bakteriengemeinschaft, besteht darin, dass sie sich auf die Analyse auf hochaktive Bakterien konzentriert und ruhende und langsam wachsende Zellen ausschließt. Wir zeigen hier die Identifizierung von Bakterien, die eine bestimmte DOC-Verbindung verwenden. Diese Methode kann aber auch angewendet werden, um das Plankton der Bakterien zu untersuchen, die andere einzelne DOC-Verbindungen oder eine Gruppe von DLCs wie Algenexsudate verwenden.

Holen wir uns also ein paar Wasserproben und legen wir los. Bevor Wasserproben auf DOC-abbauendes bakterielles Plankton entnommen werden, müssen die Wasserproben entsprechend aufbereitet werden. Die hier gezeigten Proben wurden an der Küste Georgiens entnommen, um große Partikel und ER-VREs aus der Wasserprobe zu entfernen.

Verwenden Sie eine Schlauchpumpe, um Wasser aus der Ballonflasche zu einer Filtereinheit mit einem Filter mit einer Porengröße von einem Mikrometer zu befördern. Als nächstes werden 36 Milliliter Aliquots des Filtrats in drei sterile 50-Milliliter-Polypropylenröhrchen überführt. Jeweils vier Milliliter frisch zubereitete 10%ige Paraform-Aldehydlösung enthaltend: Zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren, um die Zellen nach der Inkubation zu konservieren.

Gießen Sie das Wasser in den Filterturm einer Glasvakuumfiltrationseinheit mit weißen Membranfiltern mit einer Porengröße von 0,22 Mikrometern und wenden Sie das Vakuum an, um die Lösung durchzuziehen. Waschen Sie den Filter, indem Sie 10 Milliliter PBS durch den Vakuumfilter geben. Beschriften Sie die Filter als Negativregler und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius.

Um ein experimentelles Ökosystem oder einen Mikrokosmos zu etablieren, füllen Sie zunächst sechs vorgespülte Ein-Liter-Glaskolben mit 800 Millilitern der vorgefilterten Wasserprobe. Geben Sie BRDU zu jedem Mikrokosmos bis zu einer Endkonzentration von 10 Mikromolaren. Drehen Sie den Kolben zum Mischen schnell von Hand.

Jede Probe wird untersucht und dreifach ausgefertigt. Füge also zu drei der Mikrokosmen die Modell-DOC-Verbindung hinzu. Hier wird Reine in einer Endkonzentration von 100 Nanomolar in den Mikrokosmos gegeben.

Zu den anderen drei Mikrokosmen kommt dann steriles PBS. Diese dienen als Nicht-DOC-Kontrollen, bei denen alle Mikrokosmen in einem 100 U/min Schüttelinkubator im Dunkeln bei der Insitu-Temperatur, die 25 Grad Celsius beträgt, platziert werden. Hier zu Zeitpunkten von 0, 8, 16 und 24 Uhr.

Sammeln Sie 36 Milliliter aus jedem Mikrokosmos in einem sterilen 50-Milliliter-Polypropylen-Röhrchen mit vier Millilitern frischem 10%-Paraformaldehyd und inkubieren Sie zwei Stunden lang bei Raumtemperatur, um die Zellen zu fixieren. Filtrieren Sie anschließend konservierte Zellen durch weiße Membranfilter mit einer Porengröße von 0,22 Mikrometern. Tragen Sie 10 Milliliter PBS durch den Vakuumfilter auf, um die Rückstände von PFA abzuwaschen.

Fahren Sie sofort mit der INS-situ-Immundetektion fort oder lagern Sie die Filter bei minus 20 Grad Celsius, um den BRDU-Einbau in bakterielles Plankton zu testen. Werfen Sie die Probenfilter zunächst bei Raumtemperatur, um die bakterielle Zellwand zu beeinträchtigen. Setzen Sie den Filter auf eine Filtrationseinheit, pipettieren Sie dann einen Milliliter Lysozymlösung auf den Filter, um die Zellen abzudecken und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur zu inkubieren.

Wenden Sie nach der Inkubation ein Vakuum an, um die Lösung zu entfernen. Sobald die Lösung den Filter passiert hat, waschen Sie die Zellen, indem Sie 10 Milliliter PBS hinzufügen und ein Vakuum anwenden. Um die Zellwand weiter zu beeinträchtigen, fügen Sie dem Filter einen Milliliter Proteinase-K-Lösung hinzu, um die Zellen zu bedecken.

30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Mit PBS waschen, um Einzelschicht-DNA herzustellen. Fügen Sie einen Milliliter Exonuklease-Lösung hinzu, um die Zellen auf dem Filter zu bedecken.

Inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie den Filter nach der Inkubation, indem Sie 10 Milliliter PBS durch den Vakuumfilter leiten. Schneiden Sie als Nächstes die Ränder des Filters ab, um den Teil zu entfernen, der keine Zellen enthält.

Schneiden Sie dann den Filter auf einer mit Alkohol gereinigten, trockenen Oberfläche mit einer sterilen Klinge in acht gleich große Stücke. Für jede Probe werden acht Inkubationskammern mit Rahmendichtung benötigt, wobei ein Achtel des Filters mit der Probenseite nach oben in die zusammengebaute Inkubationskammer mit der Rahmendichtung gelegt wird. Sobald die Kammern zusammengebaut sind, verwenden Sie das Roche Intu Zellproliferationskit flus, um A-B-R-D-U-markierte Zellen in situ nachzuweisen.

Sobald die stehenden Verfahren abgeschlossen sind, nehmen Sie den Filterabschnitt aus der Inkubationskammer und legen Sie ihn mit einer sterilen Klinge auf eine sterile Oberfläche, schneiden Sie den Filterabschnitt in kleine Stücke. Füllen Sie die Filterstücke in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Milliliter PBS um, verschließen Sie das Röhrchen fest und verschließen Sie es mit Paraform. Dann inkubieren Sie das Röhrchen in einem Schüttelinkubator bei 37 Grad Celsius und 200 U/min für 10 Minuten.

Sichern Sie nach der Inkubation das Röhrchen und wirbeln Sie es mit maximaler Geschwindigkeit ein. Pipettieren Sie das SUP-Natant fünf Minuten lang in ein steriles 15-Milliliter-Polypropylen-Röhrchen. Setzen Sie dann den Filter in PBS wieder auf und wiederholen Sie die Vortex- und Inkubationsschritte jeweils zwei weitere Male, indem Sie die Snat für jede Probe in dasselbe 15-Milliliter-Röhrchen geben.

Lagern Sie die resuspendierten Zellen bei vier Grad Celsius. Die Probe sollte innerhalb von zwei Tagen per Fax analysiert werden. Sortieren Sie schließlich die Zellen, um die Population mit einem hohen Grad an BRDU-Inkorporation zu erhalten.

Hier kommen ein BD Faxbereich Durchflusszytometer und entsprechende Software zum Einsatz. Sobald die Zellen sortiert sind, kann die mit BRDU angereicherte Population untersucht werden, um ihre taxonomische Identität zu bestimmen. Um die 16 s ribosomalen RNA-Gene von Bakterienfilter-PCRs zu amplifizieren, pipettieren Sie die sortierten Zellen auf einen weißen Polycarbonat-Membranfilter mit einer Porengröße von 0,22 und schalten Sie die Vakuumpumpe mit einer sterilen Klinge ein, indem Sie die zellfreien Ränder des Filters abschneiden.

Schneiden Sie den Filter für jede Bedingung in vier gleich große Stücke und setzen Sie jeweils ein einzelnes Filterstück in jedes der drei PCR-Reaktionsröhrchen ein, wobei die Zellen nach innen zeigen. Fügen Sie 45 Mikroliter Wasser in PCR-Qualität hinzu. Lassen Sie die Filtersektion vollständig in das Wasser eintauchen.

Fügen Sie als Nächstes zwei Roche illustra pure T ready to go PCR-Kügelchen kurz vortexen hinzu, um das Auflösen der Kügelchen zu unterstützen. Fügen Sie dann jeweils zwei Mikroliter Vorwärts- und Rückwärts-16-s-Ribosomal hinzu. RNA-Gen-Primer.

Fügen Sie entweder einen Mikroliter BSA hinzu, um die Amplifikationsinhibitoren zu absorbieren, oder einen Mikroliter Wasser. Führen Sie die PCR-Amplifikation auf einem Thermocycler durch. Empfohlen wird ein Touchdown-PCR-Programm, bei dem die A-Knietemperatur sequenziell von 62 auf 52 Grad Celsius um ein Grad Celsius pro Zyklus sinkt, gefolgt von 15 Zyklen bei 52 Grad Celsius.

Bestätigen Sie die PCR-Amplifikation durch Elektrophorese auf einem C Bromid-gefärbten 1%Agros-Gelen, entfernen Sie die PCR-Amplikons aus dem Gel und reinigen Sie sie mit einem KaiGen Cayo-Schnellgel-Extraktionskit. Ziehen Sie nach der PCR-Gelreinigung die Amplikons derselben Probe zusammen. Aufgereinigte 16 s ribosomale DNA-Amplikons sind nun bereit für eine Reihe von molekularen Analysen.

Die Proben wurden an einem Küstenort in Georgia entnommen und verarbeitet, um Racine-abbauende Bakterien nach den in diesem Video beschriebenen Verfahren zu untersuchen. Racine ist eine polyamore Verbindung, die allgegenwärtig in der Meeresumwelt vorkommt. Es kann als Nährstoff- und Energiequelle für Meeresbakterien dienen, wie hier gezeigt.

Die Analyse der Proben ergab, dass nach einer 24-stündigen Inkubation eine Gruppe von Bakterien mit höherer FXI-Fluoreszenzintensität entwickelt wurde, die positiv mit dem Ausmaß der BRDU-Inkorporation zusammenhing, in den von Racine modifizierten Mikrokosmen. Diese Zellen wurden als High-BRDU-Inkorporationszellen oder HI bezeichnet und es wurde erwartet, dass sie hauptsächlich Racine-abbauende Bakterien enthielten. Kein Hallo.

Es wurde erwartet, dass Zellen in den Kontrollen ohne Zugabe nur Zellen mit geringerem BRDU-Einbau enthielten, die als Lii-Zellen bezeichnet wurden, hauptsächlich bakterielles Plankton enthielten, das nicht in der Lage war, es zu verwenden. Zugegebene Racine-HI-Zellen wurden in getrennte Röhrchen sortiert und dann auf Membranfiltern gesammelt. Partielle 16 ribosomale RNA-Genamplikons wurden nach Filter-PCR gewonnen und durch Gelelektrophorese bestätigt.

Nach dem Sortierfilter kann auch eine PCR-Amplifikation von funktionellen Genen durchgeführt werden, um die funktionelle Diversität zwischen den sortierten Zellen zu untersuchen. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie funktionsfähige Bakterienzellen in der aquatischen Umwelt physisch trennen und identifizieren können, indem Sie einen Ansatz verwenden, der die Sortierung fluoreszierender aktivierter Zellen und den BRDU-Einbau kombiniert. Denken Sie daran, dass BIDU Kopf Erde ist, ein Laborkittel und ein Glos sollten immer getragen werden, wenn Sie diesen Eingriff durchführen.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.