ReAsH / Flash Labeling und Bildanalyse von Tetracysteinmotiv Sensor Proteinen in Zellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Zellen, die ein Tetra-Cystein und ein fluoreszenzmarkiertes Protein exprimieren, mit den Farbstoffen Flash oder Asche zu markieren und die Ergebnisse quantitativ zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Plasmid, das ein fluoreszierendes Protein trägt, und das Zielprotein, das einen Tetra-Cystein-Tag enthält, in die interessierende Zelllinie transeziert wird. Als nächstes wird das exprimierte Protein mit R oder Flash markiert, und die unspezifisch gebundene Nahrung wird durch Waschen mit BAL entfernt, um die mikroskopische Bildgebung vorzubereiten.

Dann wird ein konfokales Mikroskop verwendet, um Fluoreszenzbilder der Zellen mit der Asche oder dem Blitz und fluoreszierenden Proteinkanälen zu sammeln. Schließlich werden die Bilder mit Bild J analysiert, um die Bindung von Asche oder Flash an das Zielprotein zu quantifizieren. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die durch die Korrelation der Aschefluoreszenz mit der fluoreszierenden Proteinfluoreszenz das Ausmaß der Asche- oder Blitzbindung an das Zielprotein in Zellen zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z.B. der einfachen Einnahme des Zielproteins mit GFP, besteht darin, dass neben seiner Lokalisation auch eine zweite Eigenschaft des Proteins verfolgt werden kann, wie z.B. die Konformationsänderung. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Proteinsubstruktur und -funktion zu beantworten, wie z. B. Isierungsereignisse, Konformationsänderungen und LI-Bindungsereignisse, die die Fähigkeit des TAC verändern, Asche oder Grat zu bannen. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals, als wir untersuchen wollten, wie sich kleine submikroskopische Polygame von Huntington in Zellen bilden.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte der Datenanalyse schwer zu erlernen sind, da sie technisch komplex sind. Demonstration der experimentellen Verfahren. In den Schritten eins bis drei wird Yasmin Ranson, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin aus unserem Labor, die Datenanalyse demonstrieren. Schritt vier wird Sevki GaN sein, ein Doktorand aus unserem Labor, der Standard-Zellkulturmethoden für Ihre Zelllinie von Interesse und einen lebenden Zell-Imaging-Objektträger verwendet, der für die Transfektion bereit ist.

Bereiten Sie eine Kultur mit Adhärenzzellen vor, die Ihr Plasmid transfizieren, das das gewünschte TC-Tag-Gen enthält. Entsprechend einer Transfektionsmethode der Wahl ist es wichtig, Positiv- und Negativkontrollen zu haben, um das Ausmaß der spezifischen Bindung an die TC-Tags zu beurteilen, sowie um den Bleichfluss der Fluenz zwischen den Kanälen bei der Aufnahme konfokaler Mikroskopaufnahmen zu beurteilen. Stellen Sie daher für zwei Farben sicher, dass die Proben für einzelne Farben vorbereitet sind, entweder das fluoreszierende Protein allein und, wenn möglich, ein T-ctech-Protein, das an das Fleisch gebunden ist, oder vs.Aber

ohne fluoreszierendes Protein. Ein bis zwei Tage nach der Transfektion spülen Sie die Zellen vorsichtig mit 300 Mikrolitern Hank's Balance Salzlösung oder HBSS aus der Vorkriegszeit, bereiten Sie frisches vorwarmes HBSS mit 10 Mikromolaren, einem, zwei et Ethan Dia Thiol oder EDT und einem mikromolaren Blitz oder Asche vor. Und nachdem Sie das HBSS aus den Zellen entfernt haben, ersetzen Sie es vorsichtig mit 300 Mikrolitern des Aschemediums und inkubieren Sie genau 30 Minuten bei 37 Grad Celsius in einem Gewebekultur-Inkubator.

Unserer Erfahrung nach erhöhen längere Inkubationszeiten die Hintergrundfluoreszenz deutlich. Saugen Sie die Markierungslösung vorsichtig aus den Zellen ab und ersetzen Sie sie durch 300 Mikroliter vorgewärmtes HBSS mit 250 Mikromolaren, zwei Drei-Dimeren, Kappenpropanol oder BAL für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie die Waschlösung durch sanftes Absaugen und ersetzen Sie sie durch 300 Mikroliter vorgewärmtes HBSS.

Nach dieser Wäsche können die Zellen mit der Paraform-Höhe fixiert werden, obwohl wir festgestellt haben, dass dies die unspezifische zynische Fluoreszenz erhöht. Daher bilden wir die Zellen in der Regel live bei Raumtemperatur ab. Darüber hinaus verhindert die Fixierung der Zellen vor der Markierung die Bindung von Bialfarbstoffen.

Um mit der Abbildung von Zellen am konfokalen Mikroskop zu beginnen, stellen Sie die Parameter für die Abbildung der einzelnen Fluorophore ein und stellen Sie sicher, dass zwischen den Kanälen ein vernachlässigbares Durchscheinen vorhanden ist. Passen Sie als Nächstes die Einstellungen des Fotomultiplikators so an, dass die maximale Fluoreszenz in der Probe den Detektor nicht sättigt. Sobald die besten Bildgebungseinstellungen bestimmt sind, ändern Sie keine davon zwischen den Proben.

Verwenden Sie eine Abtastrate von 200 Hertz, erfassen Sie vier Linienmittelwerte, und stellen Sie den Lochblendendurchmesser auf eine Flächeneinheit ein. Der Lochblendendurchmesser kann erweitert werden, wenn das Signal-Rausch-Verhältnis ein Problem darstellt. Dies kann jedoch zu einem gewissen Verlust der Bildauflösung führen.

Sammeln Sie die konfokalen Bilder nach Möglichkeit in einem 12-Bit-Format oder höher. Um die Qualität der quantitativen Datenanalyse zu maximieren. Sammeln Sie Bilder für den fluoreszierenden Proteinkanal und auch für den BI-Arsenal-Die-Kanal für alle Proben.

Um die Daten zu analysieren, verwenden Sie die Image J-Software mit den folgenden Plugins. Wenn Sie eine Version von Image J verwenden, die älter als Version 1.32 C ist, klicken Sie auf die folgenden Optionen. Um das gleichzeitige Öffnen mehrerer Bilder zu ermöglichen, bearbeiten Sie die Eingabeoptionen für die Ausgabe und klicken Sie auf das Kontrollkästchen, um die Schrägstrichfreigabe mit der J-Dateiauswahl zu öffnen.

Klicken Sie auf OK. Öffnen Sie die Bilder, die Sie interessieren. Bild J definiert automatisch die maximale und minimale Pixelintensität, die für jedes Bild separat auf dem Bildschirm angezeigt werden, da verschiedene Bilder unterschiedliche Pixelintensitäten haben.

Das bedeutet, dass die angezeigten Bilder nicht mit den betrachteten Bildern vergleichbar sind. Um sicherzustellen, dass die geöffneten Bilder alle denselben Maßstab haben, definieren Sie physisch die obere und untere Pixelintensität, die angezeigt werden sollen. Um diese Werte festzulegen, wählen Sie "Bild" und passen Sie den Kontrast des Helligkeitsschrägstrichs an.

Klicken Sie auf Einstellen, definieren Sie die minimalen und maximal angezeigten Werte. Wählen Sie dann Auf alle geöffneten Bilder übertragen und klicken Sie auf OK. Alternativ können Sie alle Bilder für einen bestimmten Kanal zusammen in einer einzigen Datei oder einem Stapel platzieren.

Image J passt dann automatisch alle Bilder an den gleichen Maßstab an. Wählen Sie dazu Bildstapel Bilder zum Stapeln aus, geben Sie einen gemeinsamen Namen für jede Datei ein und wählen Sie verwendete Titel als Beschriftungen. Klicken Sie auf OK.

Konvertieren Sie alle geöffneten Bilder für die Analyse in acht Bit. Wenn Sie den Bildtyp acht Bit auswählen, wird der angezeigte Bereich in ein Intervall von null bis 255 skaliert. Es ist wichtig, nicht über das ursprüngliche 12-Bit-Format oder höher zu speichern, da dadurch Informationsinhalte verloren gehen.

Speichern Sie eine Kopie in einem neuen Ordner mit dem Namen "Acht Bit" konvertiert mit der Option "Speichern unter". Eine Methode, um das Ausmaß der bi arsalen Die-Bindung in einem ganzen Bild zu untersuchen, besteht darin, ein Pixelintensitätskorrelationsdiagramm durchzuführen. In diesem Diagramm wird jeder Pixelwert in einem Kanal relativ zum entsprechenden Pixelwert in einem zweiten Kanal dargestellt.

Daher ist eine Pixelposition mit hoher GFP-Fluoreszenz auch hoch in der Aschefluoreszenz, wenn eine hohe Bindung vorhanden ist. Um die Pixel-Co-Korrelation zu analysieren, stellen Sie sicher, dass die Acht-Bit-REA- und GFP-Bilder in Bild J geöffnet sind.Öffnen Sie als Nächstes das Bildkorrelator-Plugin, indem Sie Plugins Bildkorrelator auswählen. Ordnen Sie die Bilddateien Bild eins und Bild zwei zu.

Klicken Sie dann auf OK. Der resultierende Stack zeigt möglicherweise keine detaillierten Informationen an. Das ist normal.

Speichern Sie den Stapel in einem neuen Ordner mit dem Namen scatterplots, und geben Sie ihm den gleichen Dateinamen wie das Beispiel, auf das er sich bezieht. Beispiel: Asche-GFP-Korrelationsdiagramm. Um die Daten anzuzeigen, wählen Sie eine von zwei Optionen aus.

Transformieren Sie zunächst die Daten so, dass es sich um ein Protokollformat handelt, indem Sie process math log auto auswählen. Um die Daten visuell neu zu skalieren, klicken Sie dann auf Bild anpassen, Helligkeit, Schrägstrich, Kontrast und wählen Sie Auto. Zweitens, skalieren Sie die Daten visuell neu, um nur niedrige Werte anzuzeigen, und zeigen Sie die Daten mit einer speziellen Nachschlagetabelle oder LUT an, um eine benutzerdefinierte LUT zu erstellen.

Klicken Sie auf Bildfarbe LUT bearbeiten, um eine sehr einfache LUT zu erhalten. Klicken Sie auf das obere linke Pixel und wählen Sie die Farbe Schwarz. Wählen Sie dann das nächste Pixel rechts aus und wählen Sie die Farbe Rot.

Klicken Sie anschließend auf das dritte Pixel und ziehen Sie die Auswahl bei gedrückter Maustaste auf das untere rechte Pixel. Wählen Sie die Farbe Rot aus, klicken Sie auf OK, wählen Sie dann die Farbe Weiß aus, und klicken Sie auf OK. Wählen Sie den Kontrastbereich für den Helligkeitsschrägstrich von null bis 255 aus, wie zuvor beschrieben, um das Bild an das auf dem Bildschirm angezeigte Bild zu binden.

Konvertieren Sie es in das RGB-Format, um Bilder zu kopieren und in andere Programme einzufügen. Öffnen Sie zunächst die Acht-Bit- oder 16-Bit-Bilder, wie zuvor beschrieben. Weisen Sie den Bildern für GFP ein LUT-Farbschema zu.

Weisen Sie die grüne LUT zu, indem Sie auf das Bild klicken. Tische grün nachschlagen. Wählen Sie abschließend das zu kopierende Bild aus und kopieren Sie es in die Zwischenablage Mit der Option Kopieren in System bearbeiten zeigt diese Abbildung ein typisches Ergebnis für die verschmolzene Kinase-Socke, das GFP und ein TC-Tag, das 30 Minuten lang gefärbt wurde.

Mit Asche in HEC 2 9 3 Zellen scheint es, dass ASH effizient an das Zielprotein bindet, das einen TC-Tag mit hoher Affinität trägt. Im Gegensatz dazu zeigt diese Abbildung die entsprechende Kontrollprobe von SARK, die mit GFP fusioniert ist, aber ohne den TC-Tag, der für die Überprüfung sowohl der Spezifität des TC-Tags als auch des Grades der Hintergrundfärbung unerlässlich ist. Dieses Ergebnis zeigt, dass RH keine Reaktivität mit dem Zielprotein aufweist, da der TC-Tag fehlt, was auf die Spezifität des TC-Tags für die SSH-Bindung hinweist.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass die Zellen nicht zusammenfließen und ruhig sein dürfen, da dies die V-Bindung in den Zellen beeinträchtigt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Ihre Daten einfach quantitativ analysieren können, und Sie können diese Methoden verfeinern, um Ihr eigenes einzigartiges IUTS für die Datenvisualisierung zu entwickeln.