Name: GABA-aktivierten Single-Channel-und Tonic Currents in Hirnschnitten der Ratte (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-17T14:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Lernen Sie die Patch-Clamp-Technik zur Aufzeichnung GABA-aktivierter Einzelkanalströme in hippocampalen Rattenhirnschnitten. Diese Methode ermöglicht die Unterscheidung synaptischer und extrasynaptischer GABAA-Kanäle.

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Diese Arbeit wurde von der schwedischen Research Council, der Universität Uppsala und der Fredrik und Ingrid Thurings Foundation finanziert. ZJ hielt ein Postdoc-Stipendium aus EXODIAB und Svenska Sällskapet för Medicinsk Forskning. Wir bedanken uns bei Frank Lee für Technik Hilfe.

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</ol>

Die whole-cell aktuellen stellt das Ensemble von Strömen von aktiven Kanäle in der Zelle erzeugt. Die spezifische Pharmakologie und Chlorid Durchlässigkeit des GABAA-Kanälen ist es möglich, Ströme mit diesen Kanälen verbunden zu identifizieren. Die Vergänglichkeit der Aktivierung der synaptischen Kanäle und die tonische Aktivierung der extrasynaptische Kanälen ermöglicht die einfache Differenzierung zwischen diesen beiden Populationen von GABAA-Kanälen in einem Neuron zum Ausdruck gebracht. Es kann jedoch nur mit Ein-Kanal-Aufnahmen in einer Studie die kinetischen Eigenschaften des Kanals Moleküle, die Tonika Ströme erzeugen. Im Gegensatz zu synaptischen Kanäle, die innerhalb von 100 us aktivieren, werden die Tonika GABAA-Kanälen mit einer Latenzzeit im Bereich von Minuten ab dem Zeitpunkt GABA 4,7,15,16,17,18 angewendet wird aktiviert. Diese verzögerte Aktivierung der Kanäle führt dazu, dass viele Sender Eigenschaften können nicht studiert mit Ganzzellableitungen werden. Auf der Single-Channel-Ebene die verschiedenen Sub-Populationen von GABAA-Kanäle können auf der Basis unterschiedlicher funktionaler und pharmakologischen Eigenschaften identifiziert werden. So, indem sie ein Vorteil, was die verschiedenen Patch-Clamp-Konfigurationen zu bieten haben, ist es möglich, im Detail zu studieren die molekulare Funktion und Pharmakologie des GABA-aktivierten Kanäle, die der Tonika und synaptische Ströme in Neuronen erzeugen.

Mehrere Patch-Clamp-Hard-und Software-Systeme zur Verfügung stehen und sie alle arbeiten mit den gleichen Grundprinzipien. In unserem Labor verwenden wir die Axoclamp Verstärker und die PClamp Software (Molecular Devices, USA) zu erfassen und zu analysieren, unsere Experimente. Eine andere beliebte Marke ist HEKA Verstärker und Software (HEKA Elektronik, Deutschland) Microforge: Narishige MF-830 (Japan); Vibrotome: zB Leica VT1200S (Deutschland) oder Campden Instruments vibrotome (UK); Mikroskop: Nikon Eclipse E600FN; Wasserbad; Mikromanipulatoren: custom made und Narishige Mikromanipulatoren (Japan); Puller: DMZ- universal (Deutschland) oder Narishige PC-10 (Japan). Electrode Glas: GC150F-15 (Harvard Apparatus, UK).

gaba-aktivierten single-channel-und tonic currents in hirnschnitten der ratte

GABA-activated Single-channel and Tonic Currents in Rat Brain Slices

Der GABA A-Kanäle sind in allen Neuronen und sind sowohl an den Synapsen und außerhalb von Synapsen befinden, wo sie phasischen und tonischen Ströme erzeugen bzw. 4,5,6,7 Der GABA A-Kanal ist ein pentameren GABA-gesteuerte Chlorid-Kanal. Der Kanal-Untereinheiten sind in 8 Familien (α1-6, β1-3, γ1-3, δ, ε, θ, π und ρ) zusammengefasst. Zwei Alphas, zwei Betas und einem 3 rd-Untereinheit bilden die funktionalen Kanal 8. Durch die Kombination von Studium der Subtyp spezifischer GABA-aktivierte Einkanal-Moleküle mit Studien einschließlich aller Populationen von GABA A-Kanäle in den Neuronen wird es möglich, die grundlegenden Mechanismen der neuronalen Hemmung und wie es moduliert durch pharmakologische Wirkstoffe zu verstehen. Wir nutzen die Patch-Clamp-Technik 9,10 auf die funktionellen Eigenschaften des GABA A-Kanäle in lebendig Neuronen im Hippocampus Hirnschnitten Studie und notieren Sie die Single-Channel-und whole-cell Ströme. Wir eingehender untersuchen, wie die Kanäle von verschiedenen GABA-Konzentrationen, andere Drogen und intra-und extrazelluläre Faktoren betroffen sind. Für detaillierte theoretische und praktische Beschreibung der Patch-Clamp-Methode finden Sie in der Single-Channel-Recordings von B Sakman und E Neher 10 bearbeitet werden.

Wir nutzen die Patch-Clamp-Technik, um GABA-aktivierte Einkanal-Ströme (GABAA-Kanälen, GABAA-Rezeptoren) und die synaptischen und Tonic Ströme erzeugen sie in Neuronen zu messen. Aktivierung der Kanäle sinkt neuronale Erregbarkeit in Gesundheit und Krankheit<sup&gt; 1,2,3,4</sup&gt;.

GABA-aktivierten Single-Channel-und Tonic Currents in Hirnschnitten der Ratte

Die GABA$_{A}$-Kanäle sind in allen Neuronen vorhanden und befinden sich sowohl an Synapsen als auch außerhalb von Synapsen, wo sie phasische und tonische Ströme erzeugen, ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, durch GABA aktivierte Ströme aufzuzeichnen, die von einzelnen Molekülen – dem Einzelkanalstrom – sowie von spezifischen Kanalpopulationen erzeugt werden, die sich an Synapsen oder außerhalb von Synapsen befinden. Dies wird erreicht, indem zunächst hippocampale Rattenhirnschnitte präpariert und Pipetten für die Patch-Clamp-Technik hergestellt werden. Im zweiten Schritt wird eine Pipette an die neuronale Membran angeheftet.Nach der Bildung eines Giga-Seals wird die an die Zelle angeheftete Patch-Clamp-Konfiguration erreicht. Anschließend wird Saugdruck auf die Pipette ausgeübt. Sobald diese in die Zelle eindringt, ist die Ganzzell-Patch-Clamp-Konfiguration hergestellt.Es werden Ergebnisse erzielt, die zwischen synaptischen und extrasynaptischen GABAA-Kanälen unterscheiden. Der Hauptvorteil der Patch-Clamp-Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie der Emissionsmessung besteht darin, dass man die funktionellen Eigenschaften der Kanäle untersuchen kann. Die Patch-Clamp-Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, beispielsweise welche Faktoren die Erregbarkeit von Neuronen bestimmen und wie diese moduliert und feinabgestimmt wird.Die Auswirkungen dieser Technologie reichen bis in die Therapie und Diagnose zahlreicher Erkrankungen hinein, da jede lebende Zelle für ihr Überleben und ihre spezialisierte zelluläre Funktion auf ein einwandfrei funktionierendes Ionenkanal abhängt. Den Ablauf demonstrieren wird ein großer Postdoktorand im Labor und Young Yin, eine Doktorandin im Labor. Um mit dem Verfahren zu beginnen, opfern Sie eine 16 bis 22 Tage alte Wistar-Ratte nach der Geburt durch Enthauptung und entfernen das Gehirn rasch mit einem Spatel. Schneiden Sie das Gehirn mit einer chirurgischen Klinge entlang der Mittellinie durch.Als Nächstes wird jedes Hemisphäre auf ein Watman-Filterpapier mit der Schnittfläche zur Papierseite hin platziert. Geben Sie einen Tropfen Sekundenkleber auf die Präparatscheibe und setzen Sie das Hemisphäre mit der Schnittfläche nach unten darauf. Anschließend wird die Präparatscheibe in die Schneidkammer des Vibroschneiders eingebracht, die mit eiskaltem [Inhalt] gefüllt ist.Eine CSF. Stellen Sie die Schnattdicke auf 400 Mikrometer ein und beginnen Sie, das Gehirn zu schneiden. Schneiden Sie etwa zwei Millimeter Gehirngewebe ab, bis Sie zum Hippocampus gelangen.Als Nächstes werden die hippocampalen Schnitte in eine Glaspetrischale mit einer CSF gegeben. Die Schale wird auf einen schwarzen Hintergrund gestellt, um eine einfache Sichtbarmachung des Hippocampus zu ermöglichen. Im nächsten Schritt wird der Hippocampus mit einem scharfen chirurgischen Skalpell von dem umgebenden Gewebe isoliert.Vermeiden Sie es danach, das Gewebe zu drücken oder zu ziehen. Inkubieren Sie die Schnitte und die A-CSF-Lösung eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und bewahren Sie sie anschließend bei Raumtemperatur auf, bis die Experimente abgeschlossen sind. Borosilikatglas-Kapillaren werden für die Patch-Pipetten verwendet.Ziehen Sie die Patch-Pipetten mit einem automatischen oder manuellen Pipettenzieher, sodass ein Widerstand von zwei bis vier Megaohm für Ganzzell-Aufnahmen oder acht bis 20 Megaohm für Einzelkanalaufnahmen resultiert. Polieren Sie die Pipette mit demselben Borosilikatglas für die Einzelkanalaufnahme. Verwenden Sie eine Mikroschweißvorrichtung, um das Borosilikatglas auf dem Platindraht zu schmelzen und die Spitze glatter zu machen.Das Polieren der Pipetten auf diese Weise erzeugt Pipetten, die im Vergleich zu Pipetten, die mit der Hitze eines unbeschichteten Drahtes oder in einem Polierschritt des automatisierten Ziehgeräts poliert wurden, stabilere und höher widerstandsfähige Versiegelungen bilden. Die Patch-Clamp-Ausrüstung besteht aus einem Mikroskop auf einem schwimmenden Tisch, das in einer Faraday-Kabine untergebracht ist, einem Verstärker, einem Digitalisierer und einem Computer. Zusammen werden diese Geräte oft als Patch-Clamp-Anlage bezeichnet.Setzen Sie nun eine Pipette in den Pipettenhalter ein und drehen Sie die Kappe fest, um die Pipette zu befestigen. Als Software für die Patch-Clamp-Technik wird P-Clamp verwendet. Stellen Sie den OC-Clamp-Verstärker 200B auf Spannungs-Clamp (V-Clamp), den Verstärkungsfaktor auf zwei, den Filter auf zwei Kilohertz und das Haltepotential auf null Millivolt ein. Um positiven Druck in der Pipette zu erzeugen, blasen Sie Luft in das Mundstück, das an dem Schlauch befestigt ist, der mit dem Pipettenhalter verbunden ist.Danach schließen Sie das Ventil zwischen Mundstück und Röhre. Achten Sie darauf, dass keine Luft austritt. Senken Sie anschließend die Pipette in die Badlösung ab.Auf dem Computerbildschirm, auf dem der Pipettenwiderstand gemessen wird, sehen Sie einen Impuls, der durch eine Fünf-Millivolt-Impulsfolge erzeugt wird, sowie eine Zahl, die den Widerstand der Pipette angibt. Kleinere Zahlen entsprechen größeren Öffnungen an der Pipettenspitze und größeren Pipetten. Stellen Sie den Pipetten-Offset am Verstärker auf Null ein.Verwenden Sie eine 10-fache Vergrößerung am Mikroskop, um die Region zu identifizieren, oder eine 60-fache Vergrößerung. Um ein parazelluläres Neuron in hippocampalen Schnitten, das Sie anpatchen möchten, zu identifizieren, erscheinen die Granulazellen des Gyrus dentatus, der parazelluläre Zellkörperbereich von CA1 und der parazelluläre Zellkörperbereich von CA3 jeweils als helle Band. Bringen Sie die Pipette in den Fokus, sodass Sie sowohl die Region oder Zelle als auch die Pipette sehen können.Wenn Sie durch die Mikroskopokulare schauen, platzieren Sie die Pipette mithilfe des Grobverstellers über der Mitte des Bereichs und senken Sie die Pipette so weit ab, bis sie sich knapp über dem Gewebe befindet, es jedoch leicht berührt. Senken Sie die Pipette anschließend mit den Feinverstellungseinstellungen des Manipulators sehr vorsichtig auf das Zentrum der Zelle oder des Bereichs ab. Gleichzeitig beobachten Sie den Bildschirm des Computers, um den Pipettenwiderstand zu überwachen.Verringern Sie weiterhin die Pipette, bis der Widerstand der Pipette größer wird. Lösen Sie den positiven Druck in der Pipette, indem Sie das Ventil öffnen. Dadurch entsteht ein sanfter Sog, wodurch automatisch die Giga-Dichtung gebildet wird.Wenn die Giga-Seal nicht gebildet wird, wenden Sie Saugdruck auf das Mundstück an, an dem zuvor positiver Druck angewendet wurde. Sie haben nun die sogenannte cell-attached-Patch-Clamp-Konfiguration erreicht. Stellen Sie die schnelle und langsame Kapazitätskompensation so ein, dass der transiente Strom von der Pipette und dem Pipettenhalter kompensiert wird.Auf dem Computerschirm sehen Sie eine flache Stromspur. Je höher der GigE-Wert ist, desto besser ist das Signal-Rausch-Verhältnis bei den Einzelkanalaufnahmen, um Einzelkanalströme mit einer an die Zelle angehefteten Patch-Clamp-Konfiguration aufzuzeichnen. Stellen Sie die Verstärkung auf 500 und die Datenerfassungsrate auf nicht langsamer als 100 Mikrosekunden ein.Zeichnen Sie dann die Ströme auf. Halten Sie das Volumen der Badlösung gering, sodass sie gerade die Schnitte bedeckt, um das Rauschen in den Aufnahmen zu minimieren und Ganzzell-Aufnahmen durchzuführen. Ändern Sie das Pipetttenpotential auf minus 60 Millivolt oder nahe dem Ruhe-Membranpotential.Wenden Sie im „cell attached“-Konfiguration Sog über den Schlauch an die Pipette an, der mit dem Pipettenhalter verbunden ist. Beobachten Sie gleichzeitig die Änderungen des Widerstands und der Kapazitätstransienten auf dem Computerbildschirm. Sobald Sie in die Zelle eingedrungen sind.Wenn dies geschieht, befinden Sie sich in der sogenannten Ganzzell-Konfiguration oder Ganzzell-Modus. Lassen Sie die Pipettierungslösung fünf bis zehn Minuten lang mit dem Zellinneren equilibrieren. Verfolgen Sie in der Zwischenzeit den Wert des Serienwiderstands.Der Strom wird durch die Populationen offener Kanäle in der Zellmembran getragen. Um GABA-aktivierte Einzelkanäle zu demonstrieren, wird GABA der Pipetttenlösung hinzugefügt, da es die Zellmembran nicht durchdringen kann. Gezeigt sind hier die durch eine GABA-Konzentration von 20 Nanomolar in einem an die Zelle angehefteten Patch an einem Granulaneuron des Gyrus dentatus aktivierten Einzelkanalströme.Der Patch wurde um 40 Millivolt depolarisiert. Die maximale Leitfähigkeit des Kanals betrug 44 Pikosiemens und seine Aktivierungslatenz lag bei 2,63 Minuten. Hier ist ein Beispiel, wie man GABA, aktivierte synaptische und extrasynaptische Ströme anhand der phasischen und tonischen Natur der Ströme unterscheidet.Der Strom durch Kanalpopulationen wurde von hippocampalen Neuronen der Ratte mit der Ganzzell-Spannungsclamp-Methode aufgezeichnet, um tonische und phasische Ströme zu identifizieren. 100 Mikromolar des GABAA-Antagonisten SR 95531 wurden auf ein Granulosum-Neuron, wie in BA dargestellt, und auf ein insulinbehandeltes CA1-Neuron, wie in BB dargestellt, appliziert. SR 95531 blockierte die extrasynaptischen Kanäle und induzierte eine Verschiebung des Basisstroms, wodurch der tonische Strom sichtbar wurde.Wenn man einmal die Technik beherrscht, kann das Anlegen einer Zell-angehefteten Aufzeichnung und anschließende Durchbruch in die Zelle zur Herstellung einer Ganzzell-Aufzeichnung innerhalb von zwei Minuten erfolgen. Mit dieser Methode kann man auch an andere Gewebe wie intakte Pankreasinseln oder isolierte Zellen wie Lymphozyten oder Zellen in Kultur andocken.

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Research

Forschung

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Neurowissenschaften

Dieser Bericht zeigt eine Technik zur mechanischen Isolation von einzelnen Neuronen lebensfähig halten befestigt präsynaptischen boutons. Vibrodissociated Neuronen haben die Vorteile der schnellen Produktion, ausgezeichnete pharmakologische Kontrolle und verbesserten Raum-Klemme, ohne Einfluss von benachbarten Zellen. Diese Methode kann für die Bildgebung der synaptischen Elementen und Patch-Clamp-Aufzeichnung verwendet werden.

Vibrodissociation von Neuronen aus Nager Hirnschnitten zu Study Synaptic Transmission and Image präsynaptischen

Dieses Video zeigt die Aufzeichnung von Ganzzellströmen, die durch Gamma-Aminobuttersäure oder GABA induziert werden, in einem präfrontalen kortikalen Hirnschnitt der Maus. Die kontrollierte Verabreichung von GABA öffnet Chloridkanäle in einem postsynaptischen Neuron und erzeugt inhibitorische postsynaptische Ströme oder IPSCs. Diese IPSCs nehmen mit höheren GABA-Konzentrationen zu, was die hemmende Wirkung von GABA auf die synaptische Übertragung widerspiegelt.

Aufzeichnung von Ganzzellströmen mit GABA-Puffing in einer Gehirnscheibe einer Maus

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Analyse der synaptischen Konnektivität zwischen dem medialen präfrontalen Kortex (mPFC) und Amygdala-Neuronen anhand von akuten Amygdala-Hirnschnitten von Mäusen. Die mPFC-Neuronen in diesen Mäusen exprimieren Channelrhodopsin, das mit einem fluoreszierenden Protein fusioniert ist. Die Kanalrhodopsine erleichtern den Ioneneinstrom und die Generierung von Aktionspotentialen in den mPFC-Neuronen nach Lichtaktivierung. Folglich setzen mPFC-Neuronen...

Visualisierung und Kartierung neuronaler Signalwege in einem Amygdala-Hirnschnitt

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Untersuchung der synaptischen Effizienz im lateralen entorhinalen Kortex (LEC) durch optogenetische Stimulation der medialen präfrontalen Kortex (mPFC) Axone und Aufzeichnung der Reaktionen von Pyramidenneuronen im LEC. Diese Methode kombiniert Patch-Clamp-Aufzeichnungen mit synaptischer Aktivierung durch Lichtstimulation, um die synaptische Plastizität zu untersuchen.

Optogenetische Stimulation und elektrophysiologische Aufzeichnung synaptischer Ereignisse in Hirnschnitten von Ratten

Kortikaler Netzwerke werden von einem kleinen, aber vielfältige Reihe von hemmenden Inter gesteuert. Funktionelle Untersuchung von Inter erfordert daher gezielte Aufnahme und strenge Identifizierung. Hier beschrieben wird, ist ein kombinierter Ansatz, der Ganzzellableitungen von einzelnen oder synaptisch gekoppelten Paare von Neuronen mit intrazelluläre Markierung, Post-hoc-morphologische und immunzytochemische Analyse.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen aus Morphologically- und neurochemisch identifizierten Hippocampus Inter

Schwingungen sind grundlegende Netzeigenschaften und sind von Krankheiten und Arzneimittel moduliert. Studieren Gehirn-slice Schwingungen ermöglicht Charakterisierung der isolierten Netze unter kontrollierten Bedingungen. Protokolle sind für die Herstellung von akuten Gehirnscheiben zum Hervorrufen CA1 γ Schwingungen vorgesehen.

Generation of Local CA1 γ Schwingungen durch tetanische Stimulation

Wir beschreiben die Blätterteig-Technik, durch die pharmakologische Reagenzien können während der gesamten Zelle Patch-Clamp-Aufnahme verabreicht werden, und verschiedene Aspekte der Funktionen, die für den Erfolg entscheidend sind.

Whole-Cell Ströme induziert durch Blätterteig Anwendung von GABA im Gehirnscheiben

Hier präsentieren wir Ihnen Protokolle, um Verbindungen zu GABA-A -Rezeptoren von der Bindung an die Physiologie und Pharmakologie aktiv zu entdecken.

Methoden für die Entdeckung der neuartige Substanzen modulieren einen Gamma - Aminobuttersäure-Rezeptor geben eine Neurotransmission

Akuter Anfall Modelle sind wichtig für die Untersuchung der Mechanismen, die epileptiformen Veranstaltungen. Darüber hinaus bietet die Möglichkeit, epileptiformen Ereignisse auf Abruf erzeugen eine äußerst effiziente Methode um die genaue Abfolge der Ereignisse zugrunde liegen ihre Einleitung zu studieren. Hier beschreiben wir die akute 4-Aminopyridine kortikalen Beschlagnahme Modelle Maus und menschlichem Gewebe gegründet.

Generation und On-Demand Einleitung der akuten iktale Aktivität in Nagetier und menschlichem Gewebe

Ex-vivo-Gehirnschnitte können verwendet werden, um die Auswirkungen von flüchtigen Anästhetika auf evozierte Reaktionen auf afferente Inputs zu untersuchen. Optogenetik wird eingesetzt, um thalamokortikale und kortikokkortikale Afferenzen für nicht-primären Neokortex unabhängig zu aktivieren, und synaptische und Netzwerkantworten werden mit Isofluran moduliert.

Optogenetische Aktivierung afferenter Signalwege in Hirnschnitten und Modulation von Reaktionen durch flüchtige Anästhetika

Dieser Artikel zielt darauf ab, ein systematisches Protokoll zu beschreiben, um horizontale Hippocampus-Gehirnscheiben bei Mäusen zu erhalten. Das Ziel dieser Methode ist es, die Integrität von Hippocampus-Faserwegen zu erhalten, wie dem Perforantenweg und dem moosigen Fasertrakt, um dentate Gyrus-bezogene neurologische Prozesse zu bewerten.

Horizontale Hippocampal Scheiben der Maus Gehirn

Lernen Sie die Patch-Clamp-Technik zur Aufzeichnung GABA-aktivierter Einzelkanalströme in hippocampalen Rattenhirnschnitten. Diese Methode ermöglicht die Unterscheidung synaptischer und extrasynaptischer GABAA-Kanäle.

GABA-aktivierten Single-Channel-und Tonic Currents in Hirnschnitten der Ratte

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