Nachweis von infektiösen Viren aus Field-gesammelt Moskitos von Vero Cell Culture Assay

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, im Feld gesammelte Mücken mittels Vero-Zellkultur-Assay auf Virusinfektionen zu untersuchen. Zunächst werden die im Feld gesammelten Mücken nach Art sortiert. Anschließend werden die Mücken mit einem Mischmühle homogenisiert.

Nachdem die Mückenhomogenate hergestellt wurden, werden Vero-Zellen zur Vorbereitung auf die Virusuntersuchung kultiviert; anschließend wird jede Vero-Zellkultur mit einem einzelnen Mückenhomogenat infiziert, fünf Minuten lang auf einem Schüttler behandelt und danach bei 37 Grad Celsius inkubiert, um die Vermehrung von Viren zu ermöglichen. Abschließend werden die Kulturen visuell auf Anzeichen virusinduzierter zytopathischer Effekte untersucht. Der Hauptvorteil dieser Methode im Vergleich zu bestehenden Verfahren wie RT-PCR liegt darin, dass sie es ermöglicht, Mücken auf eine breite Vielfalt an Viruspartikeln zu untersuchen, die in Zellkulturen wachsen können.

Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der medizinischen Entomologie zu beantworten, beispielsweise welche Rollen unterschiedliche Mückenarten bei der Übertragung von Viren spielen. Führen Sie das folgende Verfahren in einer Sicherheitsstufe-2-Einrichtung durch. Legen Sie die Sammelbeutel mit lebenden Mücken zur Betäubung 15 Minuten lang bei minus 20 Grad Celsius.

Nachdem die Insekten anästhesiert wurden, den Beutel in einen isolierten Behälter mit Trockeneis überführen und die Mücken für eine bis drei Minuten Kohlendioxid aussetzen, um einen vollständigen Niederschlag sicherzustellen. Danach die Mücken auf eine vorab gekühlte Unterlage auf einem Bett aus Trockeneis legen. Mit feinen Spitzzangen die weiblichen Exemplare identifizieren und in Plastikportionsschälchen umsetzen.

Weibchen können von Männchen unterschieden werden, indem man die Mundteile und Fühler untersucht. Verschließen Sie die Becher und stellen Sie sie auf nasse Eis. Verwenden Sie ein stereoskopisches Auflichtmikroskop, das auf einem elektronischen Küchentisch montiert ist, sowie einen taxonomischen Schlüssel.

Identifizieren Sie die Art jedes Mückenpools, indem Sie Mücken derselben Art in beschriftete 2-ml-Schnappverschlussgefäße geben, die eine Kupferkugel enthalten. Bis zu 50 Individuen können in einem einzigen Röhrchen zusammengefasst werden, sobald diese gefüllt sind. Stellen Sie die Gefäße in beschrifteten Beuteln auf einen Styroporbehälter mit Trockeneis.

Nachdem alle Mücken identifiziert wurden, können sie bis zur Homogenisierung bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Führen Sie diesen Vorgang in einer Sicherheitsstufe-3-Biosicherheitsanlage durch und arbeiten Sie in einem Biosicherheitswerkbank der Klasse zwei. Geben Sie etwa ein Milliliter PBSG pro Röhrchen hinzu und stellen Sie die Röhrchen mit den Mücken in eine vorab gekühlte Mühlenkassette für den Mischmühlenzerkleinerer.

Den beladenen Kassettenbehälter in eine Mühle einsetzen und die Mückenpools vier Minuten lang bei 25 Zyklen pro Sekunde homogenisieren. Nach der Homogenisierung die Röhrchen in eine luftdicht verschließbare, gekühlte Mikrozentrifuge überführen und zentrifugieren. Die Mückenhomogenate bei 7.000 U/min sechs Minuten lang zentrifugieren.

Die folgenden Zentrifugenröhrchen können bis zur Virusprüfung bei minus 80 Grad Celsius aufbewahrt werden. Gießen Sie das Kulturmedium aus einem T175-Fläschchen mit konfluenten Ferkelzellen in einen Abfallbecher, der Bleichmittel enthält. Geben Sie fünf Milliliter PBS in das Fläschchen und waschen Sie die Zellen gleichmäßig, bevor Sie das PBS in den Abfallbecher abgießen.

Nach dem Waschen der Zellen 2,5 Milliliter Trypsin-EDTA hinzufügen und das Kolbenpräparat fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 inkubieren, um die Zellen zu lösen. Sobald die Zellen gelöst sind, 5 Milliliter MEM hinzufügen und die Zellen mehrmals auf- und abpipettieren, um eventuelle Klumpen aufzubrechen. Danach weitere 15 Milliliter MEM hinzufügen.

Platzieren Sie 40 T-25-Flaschen auf zwei Gestellen innerhalb des Sicherheitswerks und entfernen Sie die Kolbenverschlüsse. Geben Sie mit einer sterilen Pipette je vier Milliliter MEM in jede Flasche. Fügen Sie anschließend 0,5 Milliliter suspendierte Vari-Zellen hinzu und verschließen Sie die Flaschen. Stapeln Sie die Flaschen auf einem Tablett und schwenken Sie sie vorsichtig, um sicherzustellen, dass das Medium den Boden der Flaschen gleichmäßig bedeckt.

Inkubieren Sie die Kulturen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 oder bis die Zellen zu 80 bis 90 % konfluent sind. Entnehmen Sie 20 kleine Kolben aus dem Inkubator und beschriften Sie diese mit der entsprechenden Zugriffsnummer aus jedem Mückenpool. Gießen Sie das meiste Medium von jedem Kolben in den Abfallsammler ab, sodass gerade genug Medium verbleibt, um die Zellmonoschicht zu bedecken.

Übertragen Sie 100 Mikroliter Überstand von jedem Mückenhomogenat in das entsprechend beschriftete Gefäß und verschließen Sie die Gefäße fest. Nach dem Übertragen der Überstände stellen Sie die Gefäße auf einen Schüttler, der auf 35 bis 40 U/min eingestellt ist, und schütteln sie fünf Minuten lang. Bringen Sie die Gefäße anschließend zurück in den Sicherheitswerkbank und geben Sie vier Milliliter Wachstumsmedium zu jedem hinzu.

Die Kolben erneut verschließen und sie drei bis sieben Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 inkubieren. Sobald die Kulturen zur Untersuchung bereitstehen, überprüfen Sie zunächst visuell das Medium. Trübes Medium weist auf virusinduzierte zytopathische Effekte oder eine Kontamination mit anderen Mikroben hin, oder auf beides. Untersuchen Sie die Kulturen mit trübem Medium unter einem invertierten Lichtmikroskop.

Viren verursachen typischerweise, dass Zellen deformiert werden und sich von den Kulturflaschen ablösen. Falls eine Kontamination mit Bakterien, Hefen oder Pilzen festgestellt wird oder falls die Kultur starke Mückenrückstände enthält, erneut den ursprünglichen Mückenschwarm nach Filtration durch eine 0,22-Mikron-Spritze testen. Aseptisch ein bis zwei Milliliter Medium aus viruspositiven Kulturen, die nicht mit anderen Mikroorganismen kontaminiert sind, in beschriftete Kryoröhrchen abfüllen.

Lagern Sie die virushaltigen Proben bei minus 80 Grad Celsius, bis die Identifizierung mithilfe geeigneter diagnostischer Tests unter Verwendung dieses Assays erfolgt. Neun verschiedene Viren aus vier taxonomischen Familien wurden aus Mücken gewonnen, die während einer kontinuierlichen landesweiten Überwachungsphase von 1997 bis 2010 in Connecticut gesammelt wurden. Mehrere dieser Viren, darunter das Eastern equine encephalitis virus und das West Nile Virus, sind dafür bekannt, beim Menschen Krankheiten auszulösen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Mücken hinsichtlich einer Virusinfektion durch einen Viruszellkulturtest sortiert, aufbereitet und untersucht.