Name: Agrobacterium-vermittelte Virus-induced gene silencing Assay In Cotton (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Lernen Sie das Agrobacterium-vermittelte Virus-induced gene silencing (VIGS) in Baumwolle zur funktionellen Genanalyse. Diese Methode nutzt TRV-Vektoren zur Induktion von RNA-Silencing und ermöglicht schnelle Phänotypbeobachtungen.

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Wir sind dankbar, dass Drs. SP Dinesh Kumar-und Yule Liu für TRV-VIGS Vektoren und Drs. Chuck Kenerley, Terry Wheeler, Jim Starr und Bayer CropScience für die Bereitstellung von Baumwollsamen. Diese Arbeit wurde von der NSF, um LS und NIH zur PH finanziert

1. Wachsen Baumwolle Sämlinge <ol><li> Aussaat der Samen der Upland-Baumwolle (Gossypium hirsutum) Reihe Fibermax 832, PhytoGen 425RF, PhytoGen 480WR und Deltapine 90 in Töpfen (7 cm Durchmesser) mit Metro Mix 700 (SunGR, Beavile, WA). </li><li> Halten Sie die Töpfe in ein Tablett mit einer Plastikhaube abgedeckt bei 23 ° C, 120 uE m -2 s -1 Licht, mit einer 12 Stunden Licht/12 Stunden Dunkelheit Photoperiode in einem Wachstumsmarkt Raum. </li><li> Entfernen Sie die Kuppel, wenn zwei Keimblätter entstanden sind. </li><li> Etwa zwei Wochen später, verwenden Sie die Pflanzen mit zwei voll entfalteten Keimblättern für VIGS Assay. In diesem Stadium haben die Laubblätter noch nicht entstanden (Abbildung 1). </li></ol> 2. Construct VIGS Vektor, der GrCLA1 ​​Gen <ol><li> Amplify die Cloroplastos alterados 1-Gens aus Baumwolle (GrCLA1) durch PCR mit Primern GrCLA1-F, 5'-GCCCTTTGTGCATCTTC-3 'und GrCLA1-R, 5'-CTCTAGGGGCATTGAAG-3' aus einer cDNA-Bibliothek von G. raimondii Blattgewebe. </li><li> Digest der PCR-Produkte von GrCLA1 ​​mit EcoRI und KpnI und insert into pYL156 (pTRV-RNA2) Vektor durch Ligation. </li><li> Bildschirm die Klone auf LB-Agarplatten mit 50 pg / ml Kanamycin. Überprüfen Sie, ob die Konstrukte durch Restriktionsverdau und Sequenzierung. </li><li> Transform das Plasmid in Agrobacterium tumefaciens GV3101 durch Elektroporation und erholen in LB-Flüssigmedium bei 28 ° C. Wählen Sie die Transformanten auf Platten mit LB + Kanamycin (50 ug / mL) + Gentamycin (25 ug / mL). Die Bakterien können in 25% Glycerin bei -80 ° C für die langfristige Nutzung gespeichert werden. </li></ol> 3. Führen VIGS Impfung <ol><li> Drei Tage vor der Inokulation, Streifen gefrorenen Glycerin Aktien von Agrobacterium tumefaciens Durchführung pYL192 (TRV): RNA1, pYL156 (TRV): RNA2 (Vektor allein) und pYL156 (TRV): RNA2-GrCLA1 ​​auf LB-Agarplatten mit 50 pg / ml Kanamycin und 25 pg / ml Gentamycin. Die Inkubation bei 28 ° C für 24 Stunden. </li><li> Zwei Tage vor VIGS Infiltration, wählen Sie eine einzelne Kolonie für jedes Konstrukt aus den oben Platten und impfen sie in 5 ml LB-Medium mit 50 ug / ml Kanamycin und 25 pg / ml Gentamycin ergänzt; wachsen die Bakterienkultur bei 28 ° C über Nacht in einer Bandage mit einer Geschwindigkeit von 50 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Übertragen Sie die oben genannten Kultur in einen Kolben mit 50 ml LB-Medium mit 50 ug / ml Kanamycin und 25 pg / ml Gentamycin, plus 10 mM MES ergänzt (2 - (4 Morpholino)-ethansulfonsäure) und 20 uM Acetosyringon. Die Kultur bei 28 ° C über Nacht in einem Shaker mit einer Geschwindigkeit von 50 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Am folgenden Tag, Spin-down der Agrar-und Bakterienzellen bei 4000 rpm für 5 Minuten; resuspendieren die Kultur in die Infiltration Puffer mit 10 mM MgCl 2, 10 mM MES und 200 uM Acetosyringon. Passen Sie die OD 600 von der Kultur bis 1,5. </li><li> Verlassen Sie die Kultur auf der Bank bei Raumtemperatur für 3 Stunden. </li><li> Vor Agrobakterienkolonie Infiltration, Punsch der Unterseite der Keimblätter von Baumwollpflanzen mit einer 25 G Nadel ohne Piercing durch die Keimblätter. Ein oder zwei Löcher (abhängig von der Weichheit des Gewebes) wurden auf jedem Abschnitt des Keimblatt (Abbildung 2) gestanzt. </li><li> Mix Agrobakterienkultur Aussetzung der pYL192 (TRV): RNA1 und pYL156 (TRV): RNA2 oder pYL156 (TRV): RNA2-GrCLA1 ​​im Verhältnis 1:1; Hand zu infiltrieren das Gemisch von der Unterseite der Keimblätter durch die Verwundung Websites mit einem 1 mL nadellose Spritze (Abb. 3). </li><li> Decken Sie die Pflanzen mit einer Plastikhaube und lassen Sie den infiltrierten Pflanzen bei Raumtemperatur unter schwachem Licht Bedingung für die Übernachtung. </li><li> Transfer-Anlagen zu einem Wachstum Raum mit einer Temperatur von 23 ° C, 120 uE m -2 s -1 Licht mit einem 12 Stunden Licht / 12 Stunden Dunkel-Zyklus. </li></ol> Hinweis: VIGS funktioniert, wenn Pflanzen entweder unter 23 ° C oder im Gewächshaus (25-28 ° C) sind. Wenn die Temperatur relativ niedrig (23 bis 25 ° C) ist, ist es einfacher für die Impfung und Phänotyp ist gleichmäßiger im Vergleich zu höheren (28-30 ° C) oder schwankten Temperatur. Abdecken der Pflanzen mit einer Kuppel macht auch VIGS effizienter. <ol start="10"><li> Untersuchen Sie das Schweigen Phänotyp bei 7 ~ 8 Tage nach der Infiltration. Die Laubblätter von Pflanzen zum Schweigen gebracht, indem pYL156 (TRV): RNA2-GrCLA1 ​​begonnen, die Albino-Phänotyp (Abb. 4) anzuzeigen. Die Pflanzen mit Agrobakterien Durchführung pYL156 (TRV) infiltriert: RNA2 als Kontrolle dienen. </li><li> Überprüfen Sie die Gen-Silencing Effizienz durch die Untersuchung der Expression von endogenen Genen mittels Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) mit RNA aus Kontrolle und zum Schweigen gebracht Baumwolle Pflanzen isoliert. </li></ol> Hinweis: Die VIGS-ed Pflanzen sollten unter Quarantäne enthaltenen Bedingungen und Pflanzen gehalten werden sollten ordnungsgemäß autoklaviert und entsorgt werden, nachdem die Tests als TRV hat ein breites Wirtsspektrum und ist eine meldepflichtige Erreger. 4.Repräsentative Ergebnisse: Etwa zwei Wochen nach der Hand-Infiltration mit Agrobakterien Mischung wurde die Albino-Phänotyp durch GrCLA1 ​​Schweigen verursacht deutlich auf der Laubblätter beobachtet. Das Schweigen Effizienz erreicht fast 100% in mehreren Experimenten mit mehr als 50 Pflanzen. Das Schweigen Pflanzen zeigen eine gleichmäßig verteilte und sehr stark Albino-Phänotyp auf neu entstehenden Blätter mit einem Mosaik auf den älteren Blättern (Abb. 4). <img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Ein Baumwoll-Sämling in etwa zwei Wochen alten Bühne mit zwei voll entfalteten Keimblättern für Agrobakterienkolonie Infiltration eingesetzt. <img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Punching winzige Löcher auf der Unterseite der Keimblätter von Baumwollpflanzen mit einer 25 G Nadel Agrobakterienkolonie Infiltration zu erleichtern. <img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Hand Infiltration von Agrobakterien Mischung in den Kotyledonen von Baumwolle durch die Verwundung Websites mithilfe einer Spritze ohne Nadel <img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Albino-Phänotyp erschien auf VIGS Schweigen Baumwollpflanzen. Vier Sorten werden gezeigt. A) Fibermax 832; B) PhytoGen 480WR; C) PhytoGen 425RF; D) Deltapine 90.

<ol><li>Chen, Z. J., Scheffler, B. E., Dennis, E., Triplett, B. A., Zhang, T., Guo, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+sequencing+cotton+%28Gossypium%29+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Toward sequencing cotton (Gossypium) genomes.</a> Plant Physiol. 145, 1303-1310 (2007).</li>
<li>Dinesh-Kumar, S. P., Anandalakshmi, R., Marathe, R., Schiff, M., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-induced+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Virus-induced gene silencing.</a> Methods Mol Biol. 236, 287-294 (2003).</li>
<li>Hamilton, A. J., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+species+of+small+antisense+RNA+in+posttranscriptional+gene+silencing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants.</a> Science. 286, 950-952 (1999).</li>
<li>Burch-Smith, T. M., Anderson, J. C., Martin, G. B., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+and+advantages+of+virus-induced+gene+silencing+for+gene+function+studies+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants.</a> Plant J. 39, 734-746 (2004).</li>
<li>Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-induced+gene+silencing+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Virus-induced gene silencing in tomato.</a> Plant J. 31, 777-786 (2002).</li>
<li>Estevez, J. M., Cantero, A., Romero, C., Kawaide, H., Jimenez, L. F., Kuzuyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+expression+of+CLA1%2C+a+gene+that+encodes+the+1-deoxyxylulose+5-phosphate+synthase+of+the+2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate+pathway+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the expression of CLA1, a gene that encodes the 1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase of the 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 124, 95-104 (2000).</li>
<li>Mandel, M. A., Feldmann, K. A., Herrera-Estrella, L., Rocha-Sosa, M., Leon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLA1%2C+a+novel+gene+required+for+chloroplast+development%2C+is+highly+conserved+in+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">CLA1, a novel gene required for chloroplast development, is highly conserved in evolution.</a> Plant J. 9, 649-658 (1996).</li>
<li>Gao, X., Wheeler, T., Li, Z., Kenerley, C., He, P., Shan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+GhNDR1+and+GhMKK2+compromised+cotton+resistance+to+Verticillium+wilt%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Silencing GhNDR1 and GhMKK2 compromised cotton resistance to Verticillium wilt.</a> Plant J. 66, 293-305 (2011).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

VIGS ist nachgewiesen worden, ein mächtiges Werkzeug in der funktionellen Genomanalyse werden durch transiente umzuwerfen der Expression endogener Gene. In dieser Studie entwickelten wir eine Agrobacterium-vermittelte VIGS durch die Verwendung eines TRV-basierten binären Vektor. Die Baumwolle Cla1 (GrCLA1)-Gen wurde als visuelle Marker entwickelt, um die Wirksamkeit beim Verstummen zu überwachen. Wir haben immer 100% der Gen-Silencing Effizienz, durch die Albino-Phänotyp, die auf der echten Blätter in allen Var...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name der Reagenzien und Geräte </th><th> Firma </th><th> Katalog / Seriennummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Roller Trommel </td><td> Glas-Col, LLC. </td><td> 099A TC108 </td><td> Agro-Bakterium Kultur </td></tr><tr><td> Inkubator </td><td> Sheldon Manufacturing, Inc. </td><td> 01046209 </td><td> Agro-Bakterium Kultur </td></tr><tr><td> UV / Vis-Spektralphotometer </td><td> Beckman Coulter </td><td> Model: DU530 </td><td> Mess-OD </td></tr><tr><td> Gene Pulser </td><td> BioRad </td><td> Model: 1652076; Serial: 154BR3880 </td><td> Elektroporation </td></tr><tr><td> Pulser-Controller </td><td> BioRad </td><td> Model: 1652098; Serial: 232BR4833 </td><td> Elektroporation </td></tr><tr><td> Micropulser Elektroporationsküvette </td><td> BioRad </td><td> 165-2081 </td><td> Elektroporation </td></tr><tr><td> 1 ml Spritze </td><td> BD Biosciences </td><td> 30962 </td><td> Inokulation von agro-Bakterium </td></tr><tr><td> Metro Mix 700 </td><td> SUNGR </td><td> SKU # 553001 </td><td> Wachsende Sämling </td></tr><tr><td> Terra Cotta Topf </td><td> TOPlastics </td><td> GPS 3001B2 </td><td> Wachsende Sämling </td></tr><tr><td> MES-Monohydrat </td><td> USB </td><td> 18886 </td><td> Infiltration Puffer </td></tr><tr><td> Acetosyringon </td><td> Sigma </td><td> D134406 </td><td> Infiltration Puffer </td></tr></tbody></table>

agrobacterium-vermittelte virus-induced gene silencing assay in cotton

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Baumwolle (Gossypium hirsutum) ist eine der wichtigsten Kulturpflanzen weltweit. Erhebliche Anstrengungen wurden auf molekularer Züchtung neuer Sorten gemacht worden. Die groß angelegte Gen funktionelle Analyse in Baumwolle hat hinter den meisten der modernen Pflanzenarten, wahrscheinlich aufgrund seiner Größe von Genom, Gen-Duplikation und Polyploidie, lange Wachstumszyklus und Widerspenstigkeit zu genetischen Transformation 1 wurde zurückgeblieben. Zur Erleichterung der hohen Durchsatz funktionelle genetische / genomische Studie in Baumwolle, versuchen wir eine schnelle und effiziente transienten Assays zu entwickeln, um Baumwolle Genfunktionen zu beurteilen. Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) ist eine mächtige Technik, basierend auf dem Host-post-transkriptionelle Gene Silencing (PTGS), um die Vermehrung der Viren 2,3 unterdrücken entwickelt wurde. Agrobacterium-vermittelte VIGS wurde erfolgreich in einer Vielzahl von Dikotyledonen Arten wie Solanaceae, Arabidopsis und Leguminosen angewandt und Monokotyledonen Arten, darunter Gerste, Weizen und Mais, die aus verschiedenen funktionellen Genomik Studien 3,4. Da dies eine schnelle und effiziente Ansatz vermeidet Transformation von Pflanzen und überwindet funktionale Redundanz ist es besonders attraktiv und geeignet für funktionelle Genomik Studie in Nutzpflanzen wie Baumwolle nicht zugänglich für die Transformation. In dieser Studie berichten wir über die detaillierte Protokoll der Agrobacterium-vermittelte VIGS System in Baumwolle. Unter den verschiedenen viralen Vektoren VIGS, dringt der Tabak Rassel-Virus (TRV) eine breite Palette von Hosts und ist in der Lage, kräftig ausgebreitet über den gesamten Anlagen noch produzieren milde Symptome auf der hosts5. Um die Wirksamkeit beim Verstummen, GrCLA1, ein Homologes Gen aus Arabidopsis Cloroplastos alterados 1-Gen (AtCLA1) in Baumwolle, wurde kloniert und in die VIGS Binärvektor pYL156. Cla1 Gen in Chloroplasten Entwicklung 6 beteiligt sind, und frühere Studien haben gezeigt, Monitor, loss-of-Funktion AtCLA1 führte zu einem Albino-Phänotyp auf Laubblätter 7, bietet eine exzellente visuelle Marker für silencing Effizienz. Bei etwa zwei Wochen nach Agrobacterium Infiltration begann die Albino-Phänotyp auf der Laubblätter erscheinen, mit 100% silencing Effizienz in allen wiederholten Experimenten. Das Schweigen der endogenen Genexpression wurde auch durch RT-PCR-Analyse bestätigt. Bezeichnenderweise konnte silencing potently in allen Sorten haben wir getestet, darunter verschiedene kommerziell angebauten Sorten in Texas auftreten. Diese schnelle und effiziente Agrobacterium-vermittelte VIGS Test liefert ein sehr mächtiges Werkzeug für die schnelle großflächige Analyse von Genfunktionen in Genom-weiten Ebene in Baumwolle.

Wir präsentieren Ihnen die ausführlichen Protokoll für Agrobacterium-vermittelten Virus-induzierte Gen-Silencing (VIGS)-Assay in Baumwolle. Der Tabak Rassel-Virus (TRV)-abgeleiteten Vektoren VIGS wurden eingesetzt, um RNA-Silencing von Baumwolle GrCLA1, Cloroplastos alterados 1-Gens zu induzieren. Der Albino-Phänotyp durch Schweigen GrCLA1 ​​verursacht wurde am Keimlingsstadium innerhalb von 2 Wochen nach der Impfung beobachtet.

Agrobacterium-vermittelte Virus-induced gene silencing Assay In Cotton

Baumwolle (Gossypium hirsutum) ist eine der weltweit wichtigsten Nutzpflanzen. Es wurden beträchtliche Anstrengungen bei der molekularen Züchtung neuer Sorten unternommen. Die ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen auf Agrobakterien basierenden, virusinduzierten Genstilllegungs-Assay in Baumwolle zu etablieren, um die Genfunktion zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst Baumwollsämlinge bis zum Alter von 10 Tagen bis zwei Wochen kultiviert werden. Anschließend wird das Gen rados aus den Baumwollchloroplasten in einen auf dem Tabak-Rattle-Virus basierenden VIGS-Vektor kloniert.Der dritte Schritt besteht darin, Agrobacterium-Kulturen vorzubereiten, die P-T-R-V-R-N-A eins und P-T-R-V-G-R-C-A eins enthalten. Der letzte Schritt ist die manuelle Inokulation der Agrobacterium-Kulturen in Baumwollkeimlingsblätter. Letztendlich können die Ergebnisse für die Genstilllegung beobachtet werden, indem das Albino-Phänotyp auf den echten Blättern der Baumwollpflanzen etwa zwei Wochen später sichtbar wird.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Transformation besteht darin, dass VIGS eine schnelle und effiziente Plattform für die Untersuchung der Genfunktion in Baumwolle bietet. Obwohl diese Methode sich als leistungsfähiges Werkzeug für die schnelle, großskalige Analyse der Genfunktion auf genomweiter Ebene in Baumwolle erweisen kann, ist sie ebenfalls auf andere wichtige Kulturpflanzenarten anwendbar. In der Regel haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da es schwierig ist, die Agrobakterium-Kulturen und die Baumwollpflanzen manuell zu infizieren.Mithilfe dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im Bereich der Baumwollgenetik und -genomik beantworten, beispielsweise die Erforschung von Genfunktionen, um Baumwollsämlinge für die virusinduzierte Genstummschaltung anzuziehen. Geben Sie Metro-Mix 700 in mehrere sieben Zentimeter durchmessende Töpfe und stellen Sie die befüllten Töpfe in eine Gießschale. Pflanzen Sie anschließend die Samen mehrerer Oberland-Baumwollsorten wie Fiber Max 8 3 2 Phyto, Gen 4, 2 5, RF Phyto, Gen four 80 WR und Delta Pine 90 aus.In den vorbereiteten Töpfen die Schale mit dem Topf mit einer Plastikkuppel abdecken und die Schale in einen Wachstumsraum stellen, bei 23 Grad Celsius und einer Lichtintensität von 120 Mikro-Einsteins pro Quadratmeter pro Sekunde mit einem Licht-Dunkel-Wechsel von 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit. Nach drei bis vier Tagen, sobald zwei Keimblätter erschienen sind, die Plastikkuppel entfernen. Die Baumwollpflanzen etwa 10 Tage lang weiterwachsen lassen, bis die Pflanzen den Entwicklungsstand erreicht haben, bei dem sich zwei vollständig entfaltete Keimblätter gebildet haben, jedoch bevor echte Blätter hervorgetreten sind. Anschließend sind die Pflanzen bereit, für den virusinduzierten Gen-Silencing-Test verwendet zu werden.Diese Klonierungsverfahren sollten während des zweiwöchigen Zeitraums durchgeführt werden, in dem die Baumwollpflanzen das Stadium der vollständigen Ausdehnung erreichen. Amplifizieren Sie zunächst mithilfe der im schriftlichen Protokoll bereitgestellten Primer gemäß Standard-PCR-Verfahren ein Gen der Baumwollchloroplasten aus einer cDNA-Bibliothek von CACI remondi-Blattgeweben. Verdauen Sie anschließend das GCA1-PCR-Produkt mit EcoRI und KpnI gemäß den Anweisungen des Enzymherstellers.Visualisieren Sie das 500 Basenpaar lange PCR-Produkt in einem Athene-Bromid-Gel. Schneiden Sie das Band aus und extrahieren Sie das DNA-Ligat, das gereinigte PCR-Produkt, in den PYL 1 56-Vektor. Transformieren Sie kompetente E. coli-Zellen mit dem ligierten Vektor unter Verwendung von T4-DNA-Ligase und streichen Sie anschließend 10 bis 50 Mikroliter der transformierten Zellen auf LBA-Agarplatten, die 50 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin enthalten.Inkubieren Sie die Platte am nächsten Tag über Nacht bei 37 Grad Celsius. Picken Sie Kolonien von der Platte und kultivieren Sie sie über Nacht in zwei Millilitern LB-Brühe, die 50 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin enthalten. Gewinnen Sie die Bakterien durch Zentrifugation und führen Sie DNA-Präparationen gemäß Standardverfahren durch. Zur Reinigung der Plasmid-DNA überprüfen Sie die Konstrukte durch Restriktionsenzymverdauung und Sequenzierung.Nachdem die Präsenz und Orientierung des Inserts im PYL 1 56-Vektor bestätigt wurde, elektroporieren Sie das Plasmid in Agrobacterium tumefaciens GV3101 und führen die Zellen in flüssigem LB-Medium bei 28 °C wieder her. Selektieren Sie die Transformanten auf LB-Agarplatten, die 50 µg/mL Kanamycin und 25 µg/mL Gentamycin enthalten. Falls gewünscht, können die Bakterien in 25 % Glycerin bei −80 °C gelagert werden.Drei Tage vor der Inokulation Striche aus Glycerinbeständen von Agrobacterium tumefaciens, die PYL 1 9 2 RNA eins PY, 1 56 RNA zwei und PY 1 56 RNA zwei GLA eins tragen, auf LB-Antibiotika-Agarplatten. Inkubieren Sie die Platten 24 Stunden bei 28 Grad Celsius. Am nächsten Tag einen einzelnen Kolonie für jeden Konstrukt auswählen und jede Kolonie in fünf Milliliter LB-Medium, ergänzt mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin und 25 Mikrogramm pro Milliliter Gentamycin, inokulieren.Züchten Sie die Bakterienkultur über Nacht bei 28 Grad Celsius in einem Schüttler mit einer Geschwindigkeit von 50 Umdrehungen pro Minute. Überführen Sie die PYL 1 56 RNA zwei GLA eins Kultur und die Kontrollkulturen in separate Kolben mit jeweils 50 Milliliter LB-Medium, das mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin und 25 Mikrogramm pro Milliliter Gentamycin sowie 10 Millimolar MES und 20 Mikromolar Aceto. Cy Ringy Züchten Sie die Kultur über Nacht bei 28 Grad Celsius in einem Schüttler mit einer Geschwindigkeit von 50 Umdrehungen pro Minute.Am nächsten Tag überführen Sie die Kulturen in Zentrifugenröhrchen und pelletieren die Agrobakterienzellen bei 4.000 Umdrehungen pro Minute für fünf Minuten. Resuspendieren Sie die Kultur in Infiltrationspuffer, der 10 Millimolar Magnesiumchlorid, 10 Millimolar MES und 200 Mikromolar Acetosyringon enthält. Messen Sie den OD600 der Kultur und stellen Sie ihn mit Infiltrationspuffer auf 1,5 ein. Inkubieren Sie die Kultur drei Stunden lang bei Raumtemperatur auf dem Laborpult, bevor die Agrobakterien-Infiltration der Blätter erfolgt.Stanzen Sie die Unterseite der Baumwollknospe mit einer 25-Gauge-Nadel, ohne die Baumwollknospe zu durchbohren. An jedem Abschnitt der Baumwollknospe werden ein oder zwei Löcher gestanzt. Mischen Sie anschließend die PYL 1 92 RNA one Agrobakterienkultur entweder im Verhältnis 1:1 mit PYL 1 56 RNA two oder mit PY 1 56 RNA two GRCA one.Danach mithilfe einer Ein-Milliliter-Spritze oder eines Ein-Milliliter-Spritzenkanülen-Systems die Mischung von der Unterseite in die Cott-Leitstrukturen durch die gestanzten Löcher einführen. Die Pflanzen mit einer Plastikhaube abdecken und die infiltrierte Pflanzen über Nacht bei Raumtemperatur unter schwachen Lichtbedingungen belassen.Überführen Sie die Pflanzen in einen Wachstumsraum mit einer Temperatur von 23 Grad Celsius und einer Beleuchtungsstärke von 120 Mikro-Einstein pro Quadratmeter pro Sekunde bei einem 12-Stunden-Licht-12-Stunden-Dunkel-Wechsel. Untersuchen Sie das Silencing-Phänotyp sieben bis acht Tage nach der Infiltration. Zu diesem Zeitpunkt beginnen die echten Blätter der durch PY 1 56 RNA zwei GLA eins stillgelegten Pflanzen, das Albino-Phänotyp anzuzeigen.Die mit Agrobakterien, die PYL 1 56 RNA zwei tragen, infiltrierten Pflanzen dienen als Kontrolle. Überprüfen Sie die Effizienz der Genstilllegung, indem Sie die Expressionslevel endogener Gene mittels reverser Transkription-PCR mit aus kontrollierten und stummen Baumwollpflanzen gemäß Standardverfahren isolierter RNA untersuchen.Dieses Bild zeigt eine Fiber Max 8 3 2-Kultursorte nach virusinduzierter Genstilllegung des GLA-one-Gens. Beachten Sie die weiß gefärbten Blätter, wo die Genstilllegung stattgefunden hat. Eine PHYTO four 80 WR-Kultursorte zeigt ebenfalls das Albino-Phänotyp nach virusinduzierter Genstilllegung.Ebenso zeigt dieser Phyto 4 2 5 RF-Sorte weiße Blätter, wo eine virusinduzierte Genstilllegung stattgefunden hat. Schließlich zeigt dieses Bild ein weiteres erfolgreiches Experiment zur virusinduzierten Genstilllegung, diesmal in Delta PINE 90-Sorten. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, Aceton in die Agrobakterienkulturen hinzuzufügen, bevor man sie für die drei Stunden nach diesem Verfahren auf dem Laborpult stehen lässt.Andere Methoden wie VIG, CD NA-Bibliotheksklonierung können anschließend durchgeführt werden, um weitere Fragen zu beantworten, beispielsweise die Erforschung neuartiger Genfunktionen nach deren Entwicklung. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Pflanzengenetik den Weg, um die Genfunktion und die Abwehrreaktion auf antibiotische und biotische Stressfaktoren in ökonomisch wichtigen Kulturpflanzen zu untersuchen. Einmal vorliegende Maskendaten, kann diese Technik in zwei bis drei Tagen durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die virusinduzierte Genstilllegung in Baumwolle durchführt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Beschreibung eines Virus-induzierte Gen-Silencing (VIGS)-Methode für knock-down der Genexpression...

Virus-induzierten Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana Und Tomaten

Quelle: Shi, J. et al. Screening und Identifizierung von RNA-Silencing-Suppressoren aus sekretierten Effektoren pflanzlicher Krankheitserreger. J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video demonstriert einen Co-Infiltrationstest zur Identifizierung von Pathogen-Effektorproteinen, die die RNA-Silencing in Nicotiana benthamiana 16c unterdrücken. Ein fluoreszierender Reporter und ein Kandidat-Effektorgen werden über Agrobacterium in Pflanzenblätter abgegeben. Normalerweise degradiert RNA-Silencing die...

Co-Infiltrationstest zur Untersuchung von Erregereffektoren, die die Abschaltung von Pflanzen-RNA unterdrücken

Quelle: Shi, J. et al., Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens. J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video demonstriert das Verfahren zur Herstellung einer Agrobacterium tumefaciens-Kultur , indem eine Virulenzgenexpression mit Acetosyringon induziert wird, gefolgt von der Antibiotikaentfernung durch Waschen und Resuspension, um eine transformationsbereite Suspension für die Genlieferung in Pflanzengewebe zu erzeugen.

Herstellung einer Agrobakterienkultur zur Genlieferung in Pflanzenzellen

Quelle: Beernink, B. M. et al. Direkte Agroinokulation von Maissetzlingen durch Injektion mit rekombinanten Fuchsschwanzmosaikvirus- und Zuckerrohrmosaikvirus-infektiösen Klonen. J. Vis. Exp. (2021)Dieses Video demonstriert die durch Agrobacterium vermittelte Abgabe rekombinanter viraler Klone in Maissetzlinge zur Gen-Silencing. Es beschreibt den Prozess der Agrobacterium-Infektion , systemische virale Ausbreitung und phänotypische Veränderungen durch RNA-Interferenz.

Agrobakterienvermittelte Abgabe rekombinanter viraler Klone in Maissetzlinge zur Gen-Silencing

Virus-induzierte Gen-Silencing ist ein nützliches Instrument zur Identifizierung von Genen in Nichtwirtresistenz von Pflanzen beteiligt. Wir demonstrieren die Verwendung von bakteriellen Erregern exprimieren GFPuv identifizieren Gen stumm Pflanzen anfällig Nichtwirt Krankheitserreger. Dieser Ansatz ist einfach, schnell und erleichtert groß angelegte Screening und ähnliches Protokoll zu studieren verschiedene andere Pflanzen-Mikroben-Interaktionen angewendet werden kann.

VIGS-vermittelte Stürmer Genetics Screening zur Identifizierung von Genen in Nichtwirtresistenz Beteiligte

Transient Proteinproduktion in Pflanzen Nicotiana basierend auf Vakuum-Infiltration mit Agrobakterien Buchstart-Vektoren (Tabak-Mosaik-Virus-basierten) ist ein schneller und wirtschaftlicher Ansatz für Impfstoff-Antigene und therapeutische Proteine ​​zu produzieren. Wir vereinfacht das Verfahren und die verbesserte Ziel Akkumulation durch die Optimierung der Bedingungen von Bakterien Anbau, Auswahl Wirtsarten, und Co-Einführung von RNA-Silencing Unterdrücker.

Optimierung und Nutzung von<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Transient-vermittelte Proteinproduktion in<em&gt; Nicotiana</em

Wir entwickelten ein einfaches und effizientes Protokoll für die Herstellung großer Mengen von Soja Protoplasten, komplexe regulatorische und Signalisierung Mechanismen in lebenden Zellen zu studieren.

Eine einfache Methode zur Isolierung der Sojabohne Protoplasten und Anwendung auf vorübergehende Genexpressionsanalysen

Hier stellen wir ein modifiziertes Screening-Verfahren vor, das ausgiebig eingesetzt werden kann, um RNA-Silencing-Suppressoren bei Pflanzenpathogenen schnell zu überprüfen.

Screening und Identifizierung von RNA-Silencing Suppressoren von sezernierten Effektoren von Pflanzenpathogenen

Ein Agrobacterium-basiertes Injektionsprotokoll (Agroinjektion) wird für die Impfung von Fuchsschwanzmosaikvirus und Zuckerrohrmosaikvirusclone in Maissämlinge vorgestellt. Die Impfung auf diese Weise führt zu einer Virusinfektion, einem virusinduzierten Gen-Silencing von Markergenen und einer viralen Überexpression von GFP.

Direkte Agroinokulation von Maissämlingen durch Injektion mit rekombinanten Foxtail Mosaic Virus und Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones

Hier stellen wir ein Protokoll für die hocheffiziente Produktion von transgenen Sojabohnen-Haarwurzeln vor.

Sojabohnen-Haarwurzeltransformation zur Analyse der Genfunktion

Hier stellen wir das erste Protokoll für die lokalisierte Vakuuminfiltration für in vivo-Studien zur genetischen Transformation von Großpflanzen vor. Mit dieser Methodik haben wir zum ersten Mal die Agrobacterium-vermittelte transiente Transformation von  Kakao erreicht.

Vakuumforcierte Agroinfiltration zur In-planta-Transformation widerspenstiger Pflanzen: Kakao als Fallstudie

Lernen Sie das Agrobacterium-vermittelte Virus-induced gene silencing (VIGS) in Baumwolle zur funktionellen Genanalyse. Diese Methode nutzt TRV-Vektoren zur Induktion von RNA-Silencing und ermöglicht schnelle Phänotypbeobachtungen.

Agrobacterium-vermittelte Virus-induced gene silencing Assay In Cotton

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