Vorbereitung von Adult Drosophila Augen für Thin Schnitte und mikroskopische Untersuchung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, adulte Drosophila-Augen für den Dünnschnitt vorzubereiten, um eine detaillierte Beurteilung mutierter Augenphänotypen, wie z. B. planare Zellpolaritätsdefekte, zu ermöglichen. Dies wird erreicht, indem man zuerst die Köpfe von betäubten Fliegen abschneidet. Anschließend wird das Augengewebe fixiert und in ein Epoxidharz eingebettet.

Sobald das Harz erstarrt ist, werden die eingebetteten Augen getrimmt. Für das Schneiden besteht der letzte Schritt darin, die Augen mit einem Mikrotom, das mit einem Diamantmesser ausgestattet ist, dünn zu schneiden. Letztendlich wird die Analyse der Augenpartie die Charakterisierung von Augenphänotypen neuartiger Mutanten oder die Quantifizierung genetischer Interaktionen zwischen Genen eines Signalwegs, wie z.B. des PCP-Signalwegs, ermöglichen.

Beide werden dazu beitragen, die physiologische Rolle neu identifizierter Gene zu charakterisieren. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Drosophila zu beantworten, z. B. wie sich neuartige Mutationen auf die Augenentwicklung auswirken oder wie Gene in genetischen Interaktionsassays zusammenspielen. Mehrere Schritte des Verfahrens der Augeneinbettung, wie z. B. das Ausrichten der Augen in Schnittformen, sind viel einfacher zu verstehen, was wirklich und nicht in Textform ist, um ein Paar Handschuhe anzuziehen, um sich auf die Fixierung der Fliegenköpfe vorzubereiten und Glutaraldehyd und Osmium, die beide giftige Chemikalien sind.

Als nächstes betäuben Sie die Fliegen mit CO2 und klopfen Sie sie unter einem Präpariermikroskop auf ein mit Watman-Papier geschütztes Fliegenpolster, sortieren Sie typischerweise sechs Fliegen plus eine zusätzliche Fliege aus, um sicherzustellen, dass sechs eingebettete Fliegenköpfe pro Genotyp den Brustkorb der Fliege halten und vorsichtig mit einer Pinzette drücken und dann den Kopf der Fliege mit einem Skalpell entfernen. Stabilisieren Sie den Fliegenkopf, indem Sie den Hals mit der Pinzette berühren und vorsichtig einen kleinen Teil eines Auges abschneiden, um das Eindringen des Fixiermittels zu verbessern. Berühren Sie den Kopf mit einer Pinzette oder dem Skalpell auf der Oberfläche des abgeschnittenen Auges, um den Kopf in das Glutaraldehydphosphat-Fixiermittel auf Eis zu übertragen. Achten Sie darauf, während des gesamten Fixiervorgangs Handschuhe zu tragen.

Beschriften Sie zunächst alle Formen, um den Überblick über die verschiedenen Genotypen zu behalten. Füllen Sie dann jede Form mit 100% Harz und achten Sie darauf, sie nicht zu überfüllen. Die Oberseite sollte flach über die Oberfläche sein.

Entfernen Sie mit einer Transferpipette das 50%ige Harz von den Köpfen. Durch 100%iges Harz ersetzen und drei bis vier Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Wenn sich die Köpfe im Laufe der Inkubation im Harz ausgleichen, sinken sie auf den Boden des Röhrchens.

Schlage einen Zahnstocher auf eine harte Oberfläche, um einen kleinen Haken zu machen. Übertragen Sie mit diesem Werkzeug einen einzelnen Fliegenkopf in jede Form. Legen Sie Aluminiumfolie auf den Arbeitsbereich des Präpariermikroskops, um es vor verschüttetem Harz zu schützen.

Hilfe des Präparierfernrohrs den Kopf mit der Präpariernadel leicht und vorsichtig schwenken. Bewege es an den Boden der Form, nahe an das spitze Ende. Richten Sie die Oberfläche des intakten Auges vorsichtig mit einem Hals nach unten an der Vorderwand der Form aus.

Achte darauf, dass die tangentiale Oberfläche des Auges etwa einen halben Kopfdurchmesser von der Formwand entfernt ist. Wenn sich die Augen beim Entfernen der Präpariernadel bewegen, positionieren Sie die Augen neu, ziehen Sie die Nadel schnell leicht vom Kopf weg und entfernen Sie die Nadel dann langsam vollständig. Sobald alle Köpfe ausgerichtet sind, überprüfen Sie alle Augen erneut, um sicherzustellen, dass sie sich nicht bewegt haben.

Wenn du die Nadel aus dem Harz genommen hast, richte den Kopf neu aus, gib die Formen in einen Ofen und backe sie über Nacht bei 70 Grad. Nach dem Backen über Nacht die ausgehärteten Blöcke aus den Formen entfernen, indem du die Formen biegst. Behalten Sie den Überblick, welcher Block welchem Genotyp entspricht, indem Sie sie in beschrifteten Behältern aufbewahren.

Um die Blöcke zu trimmen, montieren Sie einen Block so auf ein Mikrotomfutter, dass das Auge unter dem Präparierfernrohr nach oben zeigt. Schneide mit einer teflonbeschichteten Rasierklinge vorsichtig nur die oberste Schicht des Blocks ab. Dadurch entsteht eine klare Oberfläche, durch die das Auge gesehen werden kann und die Schnittebene festgelegt werden kann.

Schneiden Sie als Nächstes überschüssiges Plastik auf beiden Seiten des Kopfes und auf der Vorderseite ab, bis der größte Teil des Plastiks um den Kopf herum abgeschnitten ist. Am besten näherst du dich langsam dem Kopf, indem du mit einer sauberen Rasierklinge mehrere dünne Schichten Kunststoff abschneidest. Entfernen Sie vorsichtig dünne Schichten von der Oberseite des Auges in genau der gewünschten Schnittebene.

Achten Sie darauf, für jeden Schnitt frische Bereiche der Rasierklinge zu verwenden und fahren Sie fort, bis die Außenseite des Auges erreicht ist. Der resultierende beschnittene Block ist eine dreiseitige Pyramide mit einer leicht geneigten Cutoff-Spitze, die der Schnittebene entspricht. Montieren Sie den Block in das Mikrotom und beginnen Sie mit dem Schneiden.

Bis 20 bis 30 Abschnitte erzeugt sind, schwimmen die resultierenden Abschnitte auf der Wasseroberfläche des Reservoirs. Legen Sie einen Objektträger auf eine Heizplatte, die auf 100 Grad Celsius eingestellt ist. Heben Sie dann die erste Charge von Abschnitten mit einem abgeflachten Ende eines hölzernen Wattestäbchens mit einer Drehbewegung unter der Wasseroberfläche hervor und geben Sie sie dann in einen Wassertropfen.

Warten Sie auf der Folie, bis das Wasser verdunstet ist und die Abschnitte an der Folie kleben, und wiederholen Sie dann mit weiteren 20 bis 30 Abschnitten. Normalerweise passen Abschnitte von drei Augen, die in sechs Wassertropfen positioniert sind, gut auf eine Folie. Sobald alle Schnitte auf dem Objektträger gesammelt sind, können sie gefärbt und für die Mikroskopie montiert werden In einem tangentialen Schnitt durch das Auge einer wilden Augenfliege.

Die TIA weisen eine normale Polarität auf und sind in Bezug auf die dorsale ventrale Symmetrielinie gut ausgerichtet, was im Schema unten durch eine gelbe Linie dargestellt ist. Im Gegensatz zu den gut orientierten Tia des Wildtyp-Auges geht hier in einem Strabismus-Mutantenauge die tiale Polarität verloren, und obwohl das volle Photorezeptorkomplement vorhanden ist, sind Rotation und Alität randomisiert. Beachten Sie auch das Fehlen des Pigments des Pigmentzellgitters und der einzelnen Photorezeptorzellen.

Da sich die Strabismus-Mutante in einem weißen minus genetischen Hintergrund befand, handelt es sich bei der Drosophila ro Kinase oder Tropfen um eine homozygote letale Mutation, die daher eine klonale Analyse erfordert. Hier sind Dr.Homozygote mutierte Klone durch das Fehlen von Pigmenten gekennzeichnet und zeigen Rotationsdefekte sowie strukturelle Defekte, einschließlich fehlender oder übermäßiger Anzahl von Photorezeptorzellen auf Einzelzellebene. Beispiele für mutierte und Wildtyp-Photorezeptoren sind durch offene bzw. gefüllte blaue Pfeilspitzen gekennzeichnet.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Fliegenaugen einbetten und abtrennen. Innerhalb von etwa drei Tagen. Sie sollten in der Lage sein, Augenphänotypen routinemäßig im Detail zu analysieren, um die Funktion neuer Gene während der Augenentwicklung zu untersuchen.