Herstellung von Organoiden aus Tumoren: Ein 3D-In-vitro-Tumormodell

Zerkleinern Sie das Tumorgewebe in kleine Stücke. Übertragen Sie die Stücke in ein Röhrchen mit Aufschlusspuffer. Kollagenfasern, die die Zellen umgeben, werden abgebaut, wodurch die Matrix des Gewebes abgebaut wird. Pelletieren Sie dann die verdauten Stücke und entsorgen Sie den größten Teil des Verdauungspuffers. Schnippe mit dem Rohr, um das Pellet aufzubrechen.

Die Lösung besteht nun aus Zellklumpen unterschiedlicher Größe. Resuspendieren Sie die Zellklumpen in einer Lösung aus Trypsin und einem ROCK-Inhibitor. Das Trypsin baut den Tumor weiter ab und der Hemmstoff verhindert den Zelltod. Pipettieren Sie die Lösung in regelmäßigen Abständen, um die Klumpen aufzubrechen und die Zellen zu dispergieren. Dann resuspendieren Sie die Zellen in Matrixlösung in der entsprechenden Konzentration.

Tropfen der Lösung in eine Kulturplatte geben, um Matrixkuppeln zu bilden. Legen Sie die Platten kopfüber in einen Inkubator und lassen Sie die Matrix vollständig erstarren. Fügen Sie dann Zellkulturmedien hinzu und inkubieren Sie mit der rechten Seite nach oben. Die Matrix bietet ein Gerüst, um das dreidimensionale Wachstum des Organoids zu unterstützen.

Nach dem Zerkleinern geben Sie die Tumorstücke in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit Verdauungspuffer für 1,5 bis 2 Stunden Verdauung bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Verdauung wird das verdaute Gewebe durch Zentrifugation sedimentiert und der Überstand verworfen.

Schnippen Sie mit dem Rohr, um das Zellpellet zu lösen. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 Milliliter vorgewärmtem Trypsin, das mit 10 mikromolaren Y-27632 ROCK-Inhibitor ergänzt ist, für 5 Minuten bei 37 Grad Celsius.

Am Ende der Inkubation verreiben Sie die Gewebeaufschlämmung fünfmal mit der Standard-Pipettenspitze P1000. Bringen Sie das Röhrchen für eine weitere 5-minütige Inkubation und Verreibung wieder in das Wasserbad.

Für die Matrixkuppelbeschichtung waschen Sie die verdauten Zellen in 9 Millilitern kaltem Medium und sammeln Sie die Zellen dann durch Zentrifugation. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 Milliliter frischem Medium für die Zählung und sammeln Sie die Zellen nach der Zählung erneut durch Zentrifugation. Verdünnen Sie die Tumorzellen in dem entsprechenden Matrixvolumen.

Lassen Sie vorsichtig 200 Mikroliter Matrixzelllösung in jede Vertiefung einer auf 55 Grad Celsius erwärmten 6-Well-Platte fallen. Lassen Sie die Kuppeln 2 Minuten lang bei Raumtemperatur erstarren, bevor Sie die Platte kopfüber für 20 Minuten in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator legen.

Wenn die Kuppeln vollständig erstarrt sind, fügen Sie 2 Milliliter Prostata-Organoid-Medium hinzu, das mit Androgen R1881 und ROCK-Inhibitor ergänzt ist. Stellen Sie die Platte wieder in den Zellkultur-Inkubator.

• In vitro tumor models - Methods for studying tumor behavior in lab-controlled conditions.
• PeproTech Noggin - A protein used to regulate cellular processes in tissue culture.
• Tumor model - A method or process used to replicate tumor environment and behavior for scientific studies.
• Cell pellet - Cluster of cells collected at the bottom of a tube after centrifugation.
• ROCK inhibitor organoids - Compounds that prevent cell apoptosis during organoid creation.
• Noggin conditioned media - Media enriched with Noggin protein, used in cellular culture and experiments.
• Cell pellet in tube - Term refers to cells that have been concentrated by centrifugation in a sample tube.

• Introduce In vitro tumor models by defining this as a replicate of tumor behavior (e.g., in vitro tumor models).
• Key Concepts by summarizing principles involved in cell pellet creation (e.g., cell pellet).
• Underlying Mechanisms through visualizing the process of using ROCK inhibitor in organoid creation.
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• Practical Applications - Tumor models help study cancer growth and potential cures (e.g., in vitro tumor models).
• Industry Impact - Lab studies benefit the healthcare industry and the field of oncology (e.g., ROCK inhibitor organoids).
• Societal Importance - The research contributes to advancements in cancer treatment options (e.g., Noggin conditioned media).
• Link to Scientific Advancements - Understanding tumor behavior facilitates innovative treatment approaches.