Isolierung von Mesothelzellen: Eine Technik zur Isolierung primärer Mesothelzellen aus menschlichen Omentumgewebeproben

Menschliche primäre Mesothelzellen (HPMCs) kleiden viele viszerale Organe wie das Omentum oder die Fettgewebeschicht in der Bauchhöhle aus.

Um die Mesothelzellen zu isolieren, tauchen Sie zunächst eine menschliche Omentumprobe in einen geeigneten Puffer, um die überschüssigen roten Blutkörperchen oder Erythrozyten zu entfernen. Anschließend das Omentum in eine Glasschale geben und in Stücke hacken. Dadurch wird das Gewebe dissoziiert und HPMCs zusammen mit den kontaminierenden Erythrozyten freigesetzt.

Übertragen Sie die Stücke in eine konische Röhre und lassen Sie sie für die gewünschte Zeit ruhig stehen. Das zerkleinerte Gewebe, das reich an Fett geringer Dichte ist, steigt nach oben, während sich die dichten Zellbestandteile unten absetzen. Als nächstes saugen Sie die Flüssigkeit am Boden, die HPMCs und RBCs enthält, in ein frisches Röhrchen ab.

Zentrifuge, um die Zellen zu sammeln. Entfernen Sie den pufferhaltigen Überstand. Resuspendieren Sie das Pellet in einem mesothelialen Wachstumsmedium und inkubieren Sie es für die gewünschte Dauer. Das Medium erleichtert das selektive Wachstum von HPMC gegenüber Erythrozyten.

Beobachten Sie die Zellen mit einem Lichtmikroskop, um das Wachstum quaderförmiger menschlicher Mesothelzellen zu bestätigen.

Nach der Entnahme einer chirurgischen Probe des menschlichen Omentums tauchen Sie die Probe sofort in PBS bei Raumtemperatur. Übertragen Sie das Omentum innerhalb von 2 Stunden nach dem Eintauchen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit 20 Millilitern frischem PBS. Übertragen Sie die restliche PBS-Waschung, die die primären menschlichen Mesothelzellen oder HPMC und roten Blutkörperchen enthält, in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen und schleudern Sie die Zellen nach unten.

Gießen Sie dann den Inhalt des Röhrchens in eine 10 Zentimeter große sterile Kulturschale und hacken Sie das Gewebe mit zwei Skalpellen in 5 Kubikmillimeter große Stücke. Um die primären menschlichen Mesothelzellen oder HPMC zu isolieren, geben Sie die Omentumstücke in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und warten Sie 1 Minute, bis die festen Stücke nach oben schwimmen. Das HPMC setzt sich mit den roten Blutkörperchen am Boden des Röhrchens ab.

Verwenden Sie eine Pipette, um die PBS-Waschung, die Mesothelzellen und rote Blutkörperchen enthält, in das Röhrchen mit den pelletierten Zellen zu übertragen, und schleudern Sie die Zellen herunter. Geben Sie dann 20 Milliliter frisches PBS in das Omentum und sammeln Sie das PBS-haltige HPMC und RBC drei weitere Male, wie gerade den ursprünglichen pelletierten Zellen gezeigt.

Nach dem letzten Schleudern werden die Zellen in einem 75 Quadratzentimeter großen Kolben mit 15 Millilitern Vollwachstumsmedium überzogen. Um zusätzliches HPMC aus der Omentumprobe zu isolieren, schütteln Sie das verbleibende feste Gewebe in 20 Millilitern PBS bei 200 U/min und 37 Grad Celsius. Lassen Sie die Probe nach 10 Minuten 1 Minute ruhen, damit das feste Gewebe an die Oberseite des Röhrchens aufsteigen kann.

Sammeln Sie dann die HPMC und RBC vom Boden des Röhrchens, wie gerade gezeigt. Schleudern Sie nun die Zellen aus der Sekundärwäsche herunter und geben Sie sie in einen separaten 75-Quadratzentimeter-Kolben mit 15 Millilitern Vollwachstumsmedium. Um verbleibende HPMC zu isolieren, schütteln Sie das Gewebe weitere 10 Minuten lang, diesmal in einer Mischung aus PBS und 10 Millilitern Trypsin-EDTA, und plattieren Sie diese HPMC und RBC in einem 75 Quadratzentimeter großen Kolben.

Inkubieren Sie die Kulturen dann bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in einer befeuchteten Umgebung. Füttern Sie die plattierten Zellen an den Tagen 3 und 5 mit 15 Millilitern frischem Vollwachstumsmedium, ohne das verbrauchte Medium zu entfernen. Die HPMC sind an ihrer quaderförmigen Form und ihrer Expression von Cytokeratin-8 und Vimentin zu erkennen.