Agarose-Spin-Down-Assay: Eine Technik zur Einbettung von Organoiden für die histologische Analyse

3D-Organoidkulturen von Krebszellen rekapitulieren viele pathophysiologische Merkmale menschlicher Krebserkrankungen. Damit bilden diese in vitro Kulturen ein hervorragendes Modell für die Krebsforschung.

Um diese Organoide zu verarbeiten, beginnen Sie mit einer Kultur aus vorgeformten 3D-Organoiden, die in einer geeigneten Basalmembranmatrix gezüchtet werden. Fügen Sie ein gewünschtes Zellwiederherstellungsmedium hinzu und inkubieren Sie. Das Medium erleichtert die Depolymerisation des Matrixgels, wodurch die 3D-Organoide in die Lösung freigesetzt werden.

Zentrifugieren Sie diese Mischung, um die Organoide zu pelletieren. Das Wiederherstellungsmedium mit den Matrixkomponenten verbleibt im Überstand. Entsorgen Sie den Überstand. Fügen Sie als nächstes Paraformaldehydlösung zum Organoid-Pellet hinzu. Die Chemikalie dringt in die Organoidzellen ein und bindet an die Aminosäuren, was zu einer Proteinvernetzung und Probenfixierung führt. Dieser Schritt ist für alle nachgelagerten histologischen Anwendungen von entscheidender Bedeutung.

Pelletieren Sie die Organoide, um den paraformaldehydhaltigen Überstand zu trennen und zu entfernen. Warme geschmolzene Agarose zu den Organoiden geben. Verwenden Sie eine Nadel, um die pelletierten Organoide abzulösen und in der flüssigen Agarose zu dispergieren. Lassen Sie die Agarose sich verfestigen und betten Sie die Organoide ein. Verwenden Sie den organoidhaltigen Agarose-Pfropfen für nachgeschaltete histologische Assays.

Um die Organoide für die Histologie zu verarbeiten, entfernen Sie vorhandene Medien aus der Vertiefung und achten Sie darauf, dass die Basalmembrankuppeln nicht abgesaugt werden. Fügen Sie ein gleiches Volumen der Zellrückgewinnungslösung hinzu und inkubieren Sie die Platte 60 Minuten lang bei 4 Grad Celsius.

Nach der Inkubation die Basalmembrankuppel mit einer Pipette lösen und mit der Pipettenspitze zerdrücken. Sammeln Sie die dissoziierte Kuppel und die Zellwiederherstellungslösung in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen. Das Röhrchen bei 300 x g und 4 Grad Celsius 5 Minuten zentrifugieren, dann den Überstand entfernen und beiseite stellen.

Bewahren Sie den gesamten Überstand bis zum letzten Schritt auf, wenn das Vorhandensein von Organoiden bestätigt ist. Fügen Sie die gewünschte Menge kaltes PBS hinzu und pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um das Pellet mechanisch zu entfernen, ohne die Organoide zu stören. Wiederholen Sie die Zentrifugation und entfernen Sie den Überstand.

Fixieren Sie das Pellet in einem abgestimmten Volumen von 4 % PFA für 60 Minuten bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie nach der Fixierung den Zentrifugationsschritt und die PBS-Wäsche. Fügen Sie dann langsam 200 Mikroliter warme 2%ige Agarose hinzu und lösen Sie das Zellpellet sofort, aber vorsichtig von der Röhrchenwand, ohne es mit einer 25-Gauge-Nadel zu stören, die an einer 1-Milliliter-Spritze befestigt ist.

Bei der Agarose-Spin-Down-Methode ist es entscheidend, das Zellpellet direkt nach der Zugabe von Agarose mit einer 25-Gauge-Nadel von der Wand des Röhrchens zu lösen.

Sobald die Agarose vollständig erstarrt ist, lösen Sie sie mit einer 25-Gauge-Nadel, die an einer 1-Milliliter-Spritze befestigt ist, vom Röhrchen und übertragen Sie sie in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen. Füllen Sie das Röhrchen mit 70 % Ethanol und fahren Sie mit dem herkömmlichen Protokoll für die Gewebedehydrierung und Paraffineinbettung fort.

• Spin-down - A process to separate substances of different densities by centrifugation.
• Organoid paraffin embedding - A technique to preserve biological tissues in paraffin wax.
• Cell recovery solution - A solution used to dissociate cells from a matrix for further analysis.
• Agar embedding - A method to preserve tissue samples in an agarose gel block.
• Agarose embedding protocol - A detailed procedure for encasing biological samples in agarose.

• Introduce Spin-down – A method utilized to separate different-density particles by centrifugal force (e.g., spin-down).
• Key Concepts – Overview of tissue sample preservation techniques such as paraffin and agar embedding (e.g., organoid paraffin embedding).
• Underlying Mechanisms – Description of the procedure to detach and process organoids (e.g., cell recovery solution).
• Connect to Experiment – Explanation of the importance of proper organoid and agarose handling in the experiment.

• What is the spin-down technique and how is it applied in the procedure?
• How does organoid paraffin embedding contribute to tissue preservation?
• What role does cell recovery solution play during the dissociation of organoids?

• Practical Applications – Spin-down and embedding techniques in biological and medical research (e.g., spin-down).
• Industry Impact – Areas like pathology and histology benefit from these methods (e.g., organoid paraffin embedding).
• Societal Importance – Advancement in disease diagnosis and treatment (e.g., cell recovery solution).
• Link to Scientific Advancements – Development of improved tissue preservation and analysis methods.