Immunfluoreszenz-Bildgebung für ganze Mounts: Eine Fixier- und Färbetechnik zur Bewertung intakter Organoide

Prostata-Organoide stellen in erster Linie eine äußere Schicht aus basalen Epithelzellen und innere Schichten aus luminalen Epithelzellen dar, die um ein zentrales Lumen angeordnet sind.

Die Whole-Mount-Bildgebung ermöglicht die Untersuchung intakter 3D-Organoide unter Beibehaltung ihrer Morphologie und Heterogenität. Um mit der Färbung zu beginnen, behandeln Sie die Organoide mit einem geeigneten Fixiermittel, um ihre zellulären Bestandteile an Ort und Stelle zu fixieren und so zu erhalten. Waschen Sie die Probe, um überschüssige Fixiermittel zu entfernen.

Inkubieren Sie mit einem Cocktail aus Blockierungslösung und DNA-Färbefarbstoff. Proteine in der Blockierungslösung binden passiv an unspezifische Stellen der Zellen und reduzieren die Hintergrundfärbung. Gleichzeitig färbt der DNA-färbende Farbstoff die Zellkerne.

Fügen Sie zwei Sätze von Primärantikörpern hinzu, die auf spezifische Antigene abzielen, die von den beiden konstituierenden Zellpopulationen exprimiert werden. Inkubieren Sie mit zwei verschiedenen Fluoreszenzfarbstoff-konjugierten Sekundärantikörpern, die an die Primärantikörper binden. Waschen Sie die Probe, um ungebundene Antikörper zu entfernen.

Tauchen Sie die gefärbten Organoide nacheinander in steigende Konzentrationen von tensidhaltigen Zuckerlösungen, um die Gewebetransparenz zu verbessern, ohne die Organoidarchitektur zu beeinträchtigen. Diese Behandlung erhöht die Abbildungstiefe der Probe.

Montieren Sie die Organoide auf einem Objektträger mit Abstandshaltern, um ihre 3D-Morphologie während der Bildgebung zu erhalten. Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop, um die Fluoreszenzemissionen der basalen und luminalen Zellpopulationen zu beobachten, die um das zentrale Lumen angeordnet sind.

Um eine Ganz-Mount-Immunfluoreszenzfärbung von Prostata-Organoiden durchzuführen, fügen Sie zunächst 500 Mikroliter 4% Paraformaldehyd in PBS hinzu. Inkubieren Sie die Organoide 2 Stunden lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. Nach dem Waschen des Pellets, wie im Textprotokoll beschrieben, 1 Mikrogramm pro Milliliter DAPI-Fleck in Blockierlösung geben und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Schützen Sie die Probe während der Inkubation vor Licht. Nach der Zentrifugation der Organoide wie zuvor wird der Primärantikörper und die Blockierungslösung zugegeben und über Nacht bei 4 Grad Celsius unter leichtem Schütteln inkubiert.

Pelletieren Sie die Organoide erneut und waschen Sie das Pellet mit 1 Milliliter PBS 15 Minuten lang unter leichtem Schütteln. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang zweimal. Fügen Sie dann einen sekundären Antikörper und eine Blockierungslösung hinzu und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 Grad Celsius unter leichtem Schütteln. Nach der Inkubation die Organoide pelletieren und das Pellet zwei weitere Male waschen. Fügen Sie 1 Milliliter 30% Saccharose in PBS mit 1% Triton X-100 zu den pelletierten Organoiden hinzu. Dann 2 Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubieren.

Nachdem Sie die Organoide erneut pelletiert haben, fügen Sie 1 Milliliter 45% Saccharose in PBS mit 1% Triton X-100 hinzu und schütteln Sie es vorsichtig für 2 Stunden bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie dann den Vorgang, fügen Sie jedoch 1 Milliliter 60% Saccharose in PBS mit 1% Triton X-100 hinzu. Die Organoide werden durch Zentrifugation bei 800 x g 3 Minuten bei Raumtemperatur pelletiert und 95 % des Überstands entfernt. Beobachten Sie das Pellet unter UV-Licht, um sicherzustellen, dass es bei der Entfernung des Überstands nicht verloren gegangen ist. Das Pellet wird lockerer, wenn die Konzentration an Saccharose steigt. Übertragen Sie 10 bis 20 Mikroliter der restlichen Suspension auf ein Deckglas mit Kammer und fahren Sie mit der konfokalen Mikroskopie fort.