Charakterisierung der funktionellen Chemoresistenz: Eine Methode zur Bewertung der Arzneimittelresistenz in Krebszellen mit einem klonogenen Assay

Um die Chemoresistenz in Krebszellen zu bewerten, beginnen Sie mit der Einnahme einer Multi-Well-Platte. Säen Sie eine Suspension der gewünschten medikamentenempfindlichen Prostatakrebszellen in einige Vertiefungen und eine Suspension der arzneimittelresistenten Variante der Zellen in die verbleibenden Vertiefungen.

Inkubieren Sie die Kultur, um die Anheftung der Zellen an die Kulturplatte zu erleichtern. Behandeln Sie beide Zelltypen mit einer Reihe von steigenden Dosen der ausgewählten Arzneimittellösung. Die Wirkstoffmoleküle dringen in die empfindlichen Zellen ein und verursachen bereits in geringsten Konzentrationen den Zelltod. Die resistenten Zellen scheiden die Wirkstoffmoleküle jedoch durch spezielle Wirkstoff-Effluxpumpen aus, so dass sie trotz höherer Wirkstoffkonzentrationen überleben können.

Aspirieren Sie das verbrauchte Medium, das Schmutz und Arzneimittellösung enthält. Ergänzen Sie mit frischen, medikamentenfreien Nährmedien. Inkubieren, damit sich die überlebenden arzneimittelresistenten Zellen vermehren und Kolonien bilden können. Fügen Sie eine geeignete Färbelösung hinzu, um die lebenden Zellkolonien zu färben.

Waschen Sie die Kultur, um überschüssige Farbe zu entfernen. Zähle die Anzahl der farbigen Kolonien in jeder Vertiefung. Die Vertiefungen mit medikamentenempfindlichen Zellen enthalten nur sehr wenige lebensfähige Kolonien. Im Gegensatz dazu weisen die Vertiefungen, die arzneimittelresistente Zellen enthalten, eine höhere Anzahl von Kolonien auf. Diese arzneimittelresistenten Zellen zeigen jedoch eine Verringerung der Anzahl der Kolonien mit zunehmender Medikamentendosis.

Bei diesem Verfahren werden 2.000 Zellen mit 2 Millilitern Medium pro Vertiefung in den 6-Well-Platten plattiert. Nach 24 Stunden ist eine Erhöhung der Konzentrationen von Docetaxel sowohl für die DU145- als auch für die 22Rv1-Zelllinien zu erhöhen. Geben Sie DMSO nur in eine Vertiefung als Kontrolle mit der gleichen Lautstärke, die für die höchste Docetaxel-Dosis verwendet wird. Nach 72 Stunden aspirieren Sie das arzneimittelhaltige Medium und fügen Sie frisches Docetaxel-freies Medium hinzu.

Inkubieren Sie die Platten 1 bis 2 Wochen lang, bis die Kolonien unter dem Mikroskop sichtbar sind. Um die Kolonien zu färben, waschen Sie sie vorsichtig mit 2 bis 3 Millilitern PBS und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang mit 2 bis 3 Millilitern kristallvioletter Lösung in der Gewebekulturhaube oder einem Abzug.

Entfernen Sie anschließend die Färbelösung und waschen Sie die Platten mit 2 bis 3 Millilitern Wasser. Entfernen Sie dann das Wasser und trocknen Sie die Platten an der Luft. Machen Sie digitale Bilder der Platten für die Darstellung von Figuren. Analysieren Sie das Ergebnis, indem Sie die Vertiefungen visualisieren und die Kolonien mit Hilfe eines Markierungsstifts manuell zählen und den Prozentsatz der Zellviabilität in einem Diagramm darstellen.