Proteinextraktion und Proteolyse: Eine Methode zur Gewinnung von Proteinen aus Prostatatumorgewebeproben und deren enzymatischer Verdau in Peptide
JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Krebsforschung
0 Aufrufe • 4:03 Min. • April 30th, 2023
Beginnen Sie mit einer Gewebeprobe eines Prostatatumors. Resuspendieren Sie es in einem gekühlten Lysepuffer, um die Zelllyse zu starten. Verwenden Sie einen Homogenisator, um die Gewebestrukturen weiter aufzubrechen und ihre intrazellulären Bestandteile freizusetzen. Beschallen Sie die Probe auf Eis, um eine vollständige Zelllyse zu gewährleisten, und scheren Sie die DNA, um Interferenzen während der Peptidverarbeitung zu vermeiden. Erhitzen Sie das Lysat, um die Tertiärstruktur der Proteine zu stören und sich zu entfalten.
Die Reduktionsmittel im Puffer spalten die Disulfidbindungen zwischen Cysteinresten. Anschließend werden die Alkylierungsmittel im Pufferalkylat von Thiolgruppen reduzierter Cysteine freisetzen, um eine Reformation der Disulfidbindung zu verhindern. Die zusätzlichen Denaturierungsmittel im Puffer erleichtern die kontrollierte Denaturierung und die weitere Entfaltung von Proteinen.
Zentrifuge, um die Gewebereste und alle Verunreinigungen zu pelletieren. Sammeln Sie den Überstand mit dem Proteingemisch in einem frischen Röhrchen. Fügen Sie das Lysyl-Endopeptidase-Enzym hinzu, um die Peptidbindungen in Proteinen am C-Terminus der Lysinreste zu spalten und große Pe
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