JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Krebsforschung
0 Aufrufe • 3:21 Min. • April 30th, 2023
Um Peptide zu isolieren und zu reinigen, beginnen Sie mit einer Suspension aus Proteinlysat, die eine Mischung aus verdauten Peptiden enthält.
Behandeln Sie die Mischung mit Trifluoressigsäure oder Reagenz auf TFA-Basis. Dieses anionische oder negativ geladene Reagenz bildet einen Ionenpaarkomplex mit basischen oder positiv geladenen Resten auf Peptiden, maskiert so deren Ladung und verbessert die Hydrophobizität des Peptids.
Stellen Sie nun eine Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Säule (RP-HPLC) zusammen, die eine poröse stationäre Phase auf Siliziumdioxidbasis enthält, die mit unpolaren hydrophoben Liganden immobilisiert ist. Geben Sie einen peptidkompatiblen Äquilibrierungspuffer in die Säule, um die stationäre Phase vor der Probenapplikation vorzubereiten.
Laden Sie nun die angesäuerte Probe in die Säule. Innerhalb der Säule adsorbieren die hydrophoben Peptide selektiv an die hydrophoben Liganden der stationären Phase. Lassen Sie einen Waschpuffer durch die Säule laufen, um ungebundene oder unerwünschte Partikel zu eluieren.
Führen Sie als Nächstes einen weniger polaren organischen Elutionspuffer mit hoher Hydrophobie durch die Säule. Aufgrund ihrer selektiven Affinität zum Elutionspuffer desorbieren die gebundenen Peptide aus der Säulenmatrix.
Sammeln Sie das peptidhaltige Eluat aus der Säule. Lyophilisieren Sie das Eluat, um den Wassergehalt zu entfernen und ein trockenes Pulver aus reinen und stabilen Peptiden zu erhalten.
Um die Probe anzusäuern, fügen Sie etwa 20 Mikroliter 5%ige Trifluoressigsäure oder TFA pro Milliliter Lysat hinzu. Mischen Sie das Röhrchen gut und verwenden Sie einen pH-Streifen, um den pH-Wert zu messen. Fügen Sie bei Bedarf zusätzliche 5 % TFA hinzu, um den pH-Wert auf 2,5 einzustellen. Verbinden Sie als Nächstes das kürzere Ende einer C18-Säule mit einem Vakuumverteiler. Nachdem Sie das Vakuum zwischen 17 und 34 kPa eingestellt haben, verwenden Sie 3 Milliliter 100 % Acetonitril und eine Glaspipette, um die Säule zu befeuchten.
Äquilibrieren Sie die Säule mit einer Glaspipette und tragen Sie zwei 3-Milliliter-Aliquots mit 0,1 % TFA auf. Laden Sie dann die angesäuerte Probe auf die Säule. Verwenden Sie drei 3-Milliliter-Volumina mit 0,1 % TFA, um die Säule zu waschen. Tragen Sie dann 2 Milliliter 40 % ACN und 0,1 % TFA auf, um die Probe zu eluieren, und sammeln Sie zwei 2-Milliliter-Fraktionen in Glaskulturröhrchen. Decken Sie die Eluatröhrchen mit Parafilm ab und stanzen Sie mit einer 20-Gauge-Nadel drei bis fünf Löcher in die Abdeckung, bevor Sie die Proben über Nacht lyophilisieren.