FFPE-Gewebevorbehandlung für RNA CISH: Ein Verfahren zur Verarbeitung von Formalin-fixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten für die chromogene In-situ-Hybridisierung von RNA
JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Krebsforschung
0 Aufrufe • 3:53 Min. • April 30th, 2023
Die Vorbehandlung von formalinfixierten, paraffineingebetteten oder FFPE-Gewebeschnitten erleichtert die Exposition von Nukleinsäuren und ermöglicht die Bindung markierter Sonden an die Zielsequenz während der nachfolgenden in situ Hybridisierung. Darüber hinaus trägt die Vorbehandlung dazu bei, die Integrität der Nukleinsäuren in den Zellen und die gesamte Gewebemorphologie zu erhalten.
Nehmen Sie zunächst einen Objektträger mit einem deparaffinisierten und rehydrierten FFPE-Gewebeschnitt von Interesse. Behandeln Sie das Gewebe mit einer angemessenen Konzentration von Wasserstoffperoxid und inkubieren Sie.
Wasserstoffperoxid inaktiviert die körpereigene Peroxidase, die physiologisch in den Zellen vorhanden ist, irreversibel. Dieser Blockierungsprozess schließt die Möglichkeit von unspezifischen Hintergrundsignalen bei nachfolgenden Hybridisierungsschritten aus.
Tauchen Sie anschließend den Gewebeschnitt in ein beheiztes Bad, das einen geeigneten Antigen-Retrieval-Puffer enthält. Inkubieren Sie für die gewünschte Dauer. Bei hohen Temperaturen spalten Fixiermittel-induzierte chemische Vernetzungen in Proteinen und Nukleinsäuren und setzen die unmaskierten Epitope während der anschli
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