RNA-CISH-Signaldetektion: Eine Technik zum Nachweis chromogener Signale während der RNA-In-situ-Hybridisierung in intakten Gewebeproben

Um chromogene Signale während der RNA-Hybridisierung nachzuweisen, beginnen Sie mit der Entnahme eines Gewebeschnitts auf einem Objektträger. Dieser Abschnitt enthält Ziel-RNA, die mit Meerrettichperoxidase-markierter RNA-Sonde prähybridisiert wurde.

Geben

Sie einige Tropfen Diaminobenzidin oder DAB, ein Nachweissubstrat, auf den Gewebeschnitt und inkubieren Sie.

DAB dringt in die Zelle ein, und das Meerrettichperoxidase-Enzym oxidiert sie zu einem braunen Niederschlag. Diese Reaktion verleiht bestimmten RNA-Sequenzen in der Zelle eine braune Farbe. Die Zellen, die keine Ziel-RNA enthalten, haben keine Peroxidase-Aktivität und bleiben ungefärbt.

Anschließend wird der Gewebeschnitt mit Hämatoxylin gegengefärbt. Hämatoxylin bindet an die DNA und verleiht dem Gewebeschnitt eine violette Färbung.

Behandeln Sie den Gewebeschnitt mit Ammoniakwasser - einer Bläuungslösung. Es reduziert die Intensität der violetten Färbung und lässt die Zellen blau erscheinen. Dieser Schritt ist für eine klare Visualisierung der braunen Flecken im Inneren der Zellen unerlässlich.

Tauchen Sie nun den Gewebeschnitt in steigende Konzentrationen von Ethanol und behandeln Sie ihn anschließend mit Xylol - einem