RNA-CISH-Signaldetektion: Eine Technik zum Nachweis chromogener Signale während der RNA-In-situ-Hybridisierung in intakten Gewebeproben

Um chromogene Signale während der RNA-Hybridisierung nachzuweisen, beginnen Sie mit der Entnahme eines Gewebeschnitts auf einem Objektträger. Dieser Abschnitt enthält Ziel-RNA, die mit Meerrettichperoxidase-markierter RNA-Sonde prähybridisiert wurde.

Geben

Sie einige Tropfen Diaminobenzidin oder DAB, ein Nachweissubstrat, auf den Gewebeschnitt und inkubieren Sie.

DAB dringt in die Zelle ein, und das Meerrettichperoxidase-Enzym oxidiert sie zu einem braunen Niederschlag. Diese Reaktion verleiht bestimmten RNA-Sequenzen in der Zelle eine braune Farbe. Die Zellen, die keine Ziel-RNA enthalten, haben keine Peroxidase-Aktivität und bleiben ungefärbt.

Anschließend wird der Gewebeschnitt mit Hämatoxylin gegengefärbt. Hämatoxylin bindet an die DNA und verleiht dem Gewebeschnitt eine violette Färbung.

Behandeln Sie den Gewebeschnitt mit Ammoniakwasser - einer Bläuungslösung. Es reduziert die Intensität der violetten Färbung und lässt die Zellen blau erscheinen. Dieser Schritt ist für eine klare Visualisierung der braunen Flecken im Inneren der Zellen unerlässlich.

Tauchen Sie nun den Gewebeschnitt in steigende Konzentrationen von Ethanol und behandeln Sie ihn anschließend mit Xylol - einem organischen Lösungsmittel. Durch diese Schritte wird der Gewebeschnitt dehydriert, um bessere Bilder zu erhalten.

Zum Schluss verschließen Sie den Objektträger mit einer Eindecklösung und einem Deckglas und visualisieren ihn unter einem Lichtmikroskop. Die Zellen weisen punktförmige braune Punkte auf, die auf das Vorhandensein von Ziel-RNA hinweisen.

Geben Sie die gleiche Anzahl von Tropfen jeder DAB-A- und DAB-B-Lösung in ein entsprechend großes Röhrchen, um etwa 120 Mikroliter DAB-Substrat pro Schnitt und Vortex herzustellen. Nehmen Sie jede Folie nacheinander aus der Folienablage und tippen und schnippen Sie, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, und legen Sie sie wieder in die Folienablage. Pipettieren Sie etwa 120 Mikroliter DAB-Mischung auf jeden Gewebeabschnitt und stellen Sie sicher, dass die Abschnitte bedeckt sind. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und mit der Gegenfärbung fortfahren.

Geben Sie einen Tropfen Montagemedium pro Glaslamelle und legen Sie dann die Lamelle auf die Schienen und lassen Sie sie an der Luft trocknen. Nach einigen Stunden fahren Sie mit der Auswertung mit einem Lichtmikroskop fort, wie im Manuskript beschrieben.