Herstellung von Biogerüsten durch Elektrospraying: Eine Technik zur Erzeugung von Microcarrier-Gerüsten, die aus der extrazellulären Matrix von dezellularisiertem Gewebe gewonnen werden

Microcarrier sind mikrometergroße kugelförmige Stützmatrizen mit miteinander verbundenen Poren, die eine ausgedehnte Oberfläche für die Zelladhäsion und das Zellwachstum bieten.

Um extrazelluläre Matrix oder EZM-abgeleitete Mikrocarrier herzustellen, beginnen Sie mit einer gleichmäßigen Suspension aus fein pulverisierter EZM. Laden Sie die Suspension in eine Spritze, die mit einem Infusionsset verbunden ist. Befestigen Sie die Spritze auf einer Spritzenpumpe. Positionieren Sie die Nadel senkrecht über einem Kryokolben in geeignetem Abstand.

Verbinden Sie nun die Nadel mit dem Pluspol einer Hochspannungsstromquelle. Befestigen Sie einen gefalteten Aluminiumfolienstreifen über dem Rand des Kolbens und verbinden Sie ihn mit der Erdungsklemme, um den Stromkreis zu vervollständigen.

Füllen Sie anschließend flüssigen Stickstoff in den Kolben, wobei das innere Ende des Aluminiumstreifens eingetaucht ist. Legen Sie die gewünschte Spannung an und stellen Sie die Spritzenpumpe auf eine geeignete Durchflussmenge ein, um das Elektrosprühen zu starten. Wenn die leitfähige ECM-Suspension aus der Nadelspitze austritt, verformt sich ihre Form unter dem Einfluss des elektrischen Feldes und der Oberflächenspannung und bildet einen spitzen Flüssigkeitskegel.

Mit Spannungsschritten spritzt die Aufhängung heraus. Diese zerfällt schließlich in geladene kleinere Tröpfchen und fällt in das Flüssigstickstoffbad. Flüssiger Stickstoff gefriert die Mikrotröpfchen sofort und kristallisiert die darin enthaltenen Lösungsmittelpartikel

Übertragen Sie die gefrorenen Mikrotröpfchen in ein frisches Röhrchen. Lyophilisieren Sie die Probe. Dieser Schritt hilft, gefrorene Lösungsmittelpartikel aus der Probe zu entfernen und an ihrer Stelle Poren zu erzeugen. Lagern Sie das trockene Pulver aus porösen Microcarriern für weitere Anwendungen.

Inkubieren Sie die kryogemahlene ECM-Suspension unter kontinuierlichem Rühren bei 100 U/min über Nacht. Geben Sie 3 Milliliter ECM-Suspension in eine 3-Milliliter-Luer-Lock-Spritze und befestigen Sie ein geflügeltes Infusionsset an der Bohrung der Spritze. Befestigen Sie die Spritze in der Spritzenpumpe. Befestigen Sie dann die Nadel an einem Retortenständer und positionieren Sie die Nadelspitze senkrecht in einem Abstand von 4 bis 6 Zentimetern von der Oberseite eines niedrigen Dewargefäßes.

Befestigen Sie als Nächstes eine Krokodilklemme-Elektrode an der Spitze der Nadel und stellen Sie sicher, dass die Krokodilklemme mit dem Pluspol des Hochspannungsnetzteils verbunden ist. Falten Sie den Streifen Alufolie über den Rand der Isolierflasche. Befestigen Sie dann eine zweite Krokodilklemmen-Elektrode an der Außenkante der Folie. Schließen Sie es an die Erdungsleiterklemme des Netzteils an.

Den Dewargefäß wird etwa 1 Zentimeter von oben mit flüssigem Stickstoff gefüllt, so dass drei Viertel der Folie untergetaucht sind. Stellen Sie dann die Spritzenpumpe auf eine Infusionsrate von 30 Millilitern pro Stunde ein und sprühen Sie die Proben gemäß dem Textprotokoll elektrosprayen. Sobald die Infusion abgeschlossen ist, gießen Sie überschüssigen flüssigen Stickstoff vorsichtig aus dem Dewar ab und lassen Sie den Mikrocarrier in etwa 25 Millilitern flüssigem Stickstoff suspendiert, um sicherzustellen, dass er gefroren bleibt.

Übertragen Sie die Microcarrier sofort mit flüssigem Stickstoff in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, indem Sie in einer gleichmäßigen Bewegung gießen. Verwenden Sie dann eine Scoopula, um alle gefrorenen Mikrocarrier zu sammeln, die im Dewar übrig geblieben sind. Gib sie in das Zentrifugenröhrchen. Um die Gefriertrocknung vorzubereiten, decken Sie das Zentrifugenröhrchen mit Aluminiumfolie ab, die mit kleinen Löchern perforiert ist. Legen Sie die abgedeckten Zentrifugenröhrchen in einen Lyophilisatorkolben. Schließen Sie dann sofort den Kolben an den Gefriertrockner an und trocknen Sie die Proben über Nacht.