Magnetbead-basierte Exosomenextraktion: Eine Technik zur Isolierung spezifischer Exosomen aus Bioflüssigkeiten

Exosomen sind extrazelluläre vesikuläre Strukturen, die von Zellen in Bioflüssigkeiten abgesondert werden. Um spezifische Exosomen aus Bioflüssigkeiten einzufangen, beginnen Sie mit der Einnahme von Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen in einem Röhrchen.

Zu diesem Röhrchen fügen Sie biotinylierte Anti-Human-Antikörper hinzu. Biotin, das auf den Antikörpern vorhanden ist, hat eine hohe Affinität zu Streptavidin, das auf den magnetischen Kügelchen vorhanden ist. Dadurch kommt es zur Konjugation der Antikörper mit den magnetischen Kügelchen.

Geben Sie als Nächstes eine proteinreiche Blockierungslösung in das Röhrchen mit den mit Antikörpern markierten Magnetkügelchen. Die Proteine in der Blockierungslösung binden an die freien Stellen auf den magnetischen Kügelchen und erhöhen die Spezifität der Exosomenbindung.

Ergänzen Sie nun das Röhrchen mit einer Proben-Bioflüssigkeit, die reich an Exosomen ist. Inkubieren Sie das Röhrchen unter Rühren. Die Exosomen in der Bioflüssigkeit weisen spezifische Oberflächenrezeptoren auf, die ihnen helfen, an die Antikörper zu binden, die an der Oberfläche der magnetischen Kügelchen befestigt sind.

Stellen Sie dann das Rohr in ein Magnetfeld. Unter dem Einfluss eines Magnetfeldes lagern sich die an Exosomen gebundenen Magnetkügelchen an der Oberfläche der Röhre an. Saugen Sie dann mit einer Mikropipette die restliche Bioflüssigkeit aus dem Röhrchen ab.

Entfernen Sie abschließend die Röhre aus dem Magnetfeld und fügen Sie einen geeigneten Puffer hinzu, um die an Exosomen gebundenen Kügelchen zu eluieren. Diese exosomengebundenen Kügelchen können für weitere nachgelagerte Analysen verwendet werden.

Resuspendieren Sie eine Stammlösung, die 10 Mikrogramm pro Milliliter mit Streptavidin beschichtete magnetische Mikropartikel enthält, und geben Sie 5 Mikroliter der Lösung in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das 495 Mikroliter PBS enthält. Um die Kügelchen zu waschen, stellen Sie die Tube zunächst für 1 Minute auf ein Magnetgestell und entfernen Sie vorsichtig den Puffer, ohne die Kügelchen zu stören.

Übertragen Sie dann das Rohr auf ein nichtmagnetisches Gestell. Fügen Sie 500 Mikroliter PBS hinzu und pipettieren Sie, um die Kügelchen zu waschen. Tun Sie dies insgesamt dreimal. Nach der letzten Wäsche resuspendieren Sie die Kügelchen in 490 Mikrolitern PBS und fügen Sie dann 5 Mikroliter biotinylierten Maus-Anti-Human-CD63-Antikörper aus einer Stammlösung von 1 Milligramm pro Milliliter hinzu.

Mischen Sie die Lösung durch Pipettieren. Programmieren Sie einen Probenrotator für eine reziproke Drehung um 90 Grad für 5 Sekunden und eine Vibration bei 5 Grad für 1 Sekunde. Legen Sie die Röhren in den Rotator und lassen Sie das Programm 30 Minuten lang bei Raumtemperatur laufen.

Übertragen Sie anschließend die Röhrchen für 5 Minuten in das Magnetgestell. Waschen Sie die Kügelchen dreimal mit 500 Mikrolitern PBS und resuspendieren Sie sie dann in 490 Mikrolitern PBS, das Kasein enthält. Beschriften Sie ein Röhrchen mit der Probenidentifikation und fügen Sie dann 10 Mikroliter der Probe hinzu.

Pipettieren Sie mehrmals, um die Probe mit den Antikörper-konjugierten Kügelchen zu vermischen. Übertragen Sie anschließend die Röhrchen in den Probenrotator und führen Sie das gleiche Programm 2 Stunden lang bei Raumtemperatur durch. Waschen Sie die Kügelchen dann dreimal mit 500 Mikrolitern eines 1M Tris-Hydrochlorid-Puffers unter Verwendung des magnetisierten Gestells. Die Exosomen werden nun an die magnetisierten Kügelchen gebunden.