Reinigung von Subpopulationen extrazellulärer Vesikel: Eine Technik zur Aufreinigung von Subpopulationen extrazellulärer Vesikel mittels Dichtegradienten-Ultrazentrifugation

Extrazelluläre Vesikel oder EVs sind nanogroße, heterogene, membrangebundene Vesikel, die von verschiedenen Zellen, einschließlich Hirntumorzellen, sezerniert werden. Bei den kleinen EVs handelt es sich um eine Subpopulation, die aus endosomalen und membranabgestoßenen EVs besteht.

Um die kleinen EVs zu reinigen, beginnen Sie mit der Einnahme von vorextrahierten EVs, die in einem mit Saccharose angereicherten Puffer suspendiert sind, der eine homogene Lösung beibehält und die strukturelle Integrität der EVs bewahrt.

Zu dieser Lösung fügen Sie dann ein geeignetes Volumen Iodixanol hinzu - ein inertes und ungiftiges Dichtegradientenmedium -, um die gewünschte Dichte zu erreichen.

Jodixanol löst die verunreinigenden Proteine auf, die später entfernt werden sollen.

Fügen Sie als Nächstes Schichten von Iodixanollösungen mit sukzessive abnehmender Dichte hinzu, um einen diskontinuierlichen Dichtegradienten zu erzeugen.

Zentrifugieren Sie das Röhrchen mit hoher Geschwindigkeit.

Abhängig von ihren Flotationsraten wandern die dichteren EVs in eine gleich dichte Schicht aus Gradientenmedium, während weniger dichte EVs weiter in eine leichtere Schicht wandern und die dichtesten Verunreinigungen ein Pellet am Boden des Rohrs bilden.

Übertragen Sie nun kleine Fraktionen der Gradientenschichten in frische Röhrchen, die einen geeigneten Puffer enthalten.

Zentrifugieren Sie die Röhrchen anschließend mit ultrahoher Geschwindigkeit unter gekühlten Bedingungen.

Während der Zentrifugation verhindert eine niedrige Temperatur, dass Elektrofahrzeuge durch hohe Geschwindigkeiten durch Hitze geschädigt werden.

Nachdem die reinen Elektrofahrzeuge abgeglebt sind, entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die EVs in einem geeigneten Puffer und fahren Sie mit der Charakterisierung und Proteomikanalyse fort.

Fügen Sie zunächst 1,5 Milliliter 60 % Iodixanol zu den 1,5 Millilitern des Saccharose/Tris-Puffers hinzu, der die EVs enthält, um eine endgültige Lösung mit 30 % Iodixanol herzustellen. Pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um die Lösung gründlich zu mischen.

Übertragen Sie diese Lösung auf den Boden eines 5,5-Milliliter-Ultrazentrifugationsröhrchens. Mischen Sie anschließend die 60%ige Iodixanol-Brühe mit Reinstwasser, um mindestens 1,5 Milliliter einer 20%igen und einer 10%igen Iodixanollösung herzustellen.

Messen Sie mit einer Spritze und einer 18G-Nadel 1,3 Milliliter der 20%igen Iodixanollösung ab und schichten Sie sie vorsichtig auf den unteren Gradienten.

Halten Sie die Fase der Nadel in Kontakt mit der Innenseite des Schlauchs direkt über dem Meniskus und fügen Sie die Lösung tropfenweise hinzu, um eine Vermischung der Schichten an der Dichtegrenzfläche zu vermeiden.

Schichten Sie dann 1,2 Milliliter der 10%igen Iodixanollösung mit der gleichen Technik auf die 20%ige Schicht. Balancieren Sie die Ultrazentrifugationsröhrchen vorsichtig aus und laden Sie sie in die Rotorbecher.

Stellen Sie die Beschleunigungs- und Verzögerungsgeschwindigkeiten eines Ausschwingrotors auf die Mindestgeschwindigkeit ein und zentrifugieren Sie 50 Minuten lang bei 268.000 x g und bei 4 Grad Celsius.

Während die Probe zentrifugiert wird, beschriften Sie für jede Probe zehn 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, die den Fraktionen 1 bis 10 des Dichtegradienten entsprechen.

Sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist, nehmen Sie die Röhrchen vorsichtig aus den Rotoreimern und legen Sie sie in eine stabile Halterung. Pipettieren Sie 10 serielle Fraktionen von 490 Mikrolitern vom oberen Ende des Gradienten in die entsprechenden Röhrchen.

Messen Sie mit einem Refraktometer die Brechungsindizes der Fraktionen. Übertragen Sie dann jede Fraktion in ein sauberes 12-Milliliter-Ultrazentrifugationsröhrchen.

Geben Sie 5 Milliliter 1x PBS in jedes Röhrchen und pipettieren Sie zum Mischen langsam auf und ab. Geben Sie zusätzlich 6 Milliliter 1x PBS auf den oberen Rand des Röhrchens und mischen Sie erneut vorsichtig.

Ultrazentrifugieren Sie die Röhrchen bei 100.000 x g und bei 4 Grad Celsius, um die kleinen Vesikel wieder zu pelletieren. Dekantieren Sie den Überstand und klopfen Sie die Röhrchen trocken, bevor Sie die Vesikel für die Proteinanalyse lysieren oder die EVs für die morphologische Analyse resuspendieren.