Astrozytenisolierung: Eine Methode zur reinen Präparation von kortikalen Astrozyten der Maus

Die In-vitro-Kultur der Astrozyten hilft dabei, die biologische Rolle der Astrozyten - der am häufigsten vorkommenden Gehirnzellen - zu untersuchen.

Beginnen Sie mit einem neugeborenen Mausgehirn, das unter ein Präpariermikroskop gelegt wird.

Entferne die Riechkolben und das Kleinhirn.

Führen Sie einen Schnitt in der Mittellinie zwischen den beiden Hemisphären durch, um den Kortex zu trennen.

Entfernen Sie die Hirnhäute, um eine Kontamination der Astrozytenkultur durch Fibroblasten und Hirnhautzellen zu vermeiden.

Die Rindenhälften in ein eiskaltes Medium geben und in kleine Stücke hacken.

Sammeln Sie die kortikalen Stücke in einem Röhrchen, das Trypsin enthält. Trypsin, ein Proteaseenzym, verdaut die Zelladhäsionsproteine und erleichtert so die Zelltrennung.

Zentrifugieren Sie, um das verdaute Gewebe zu pelletieren.

Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie dem Pellet ein Astrozytenmedium hinzu. Pipettieren Sie kräftig, um eine gemischte Zellpopulation aus Astrozyten, Mikroglia und Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) freizusetzen.

Diese Zellsuspension wird in einen mit Polylysin beschichteten Gewebekulturkolben ausgesät und inkubiert.

Die negativ geladenen Zellen heften sich an das positiv geladene Polylysin und wachsen über die gesamte Oberfläche zu einer konfluenten Schicht.

Schütteln Sie den Kolben, um die lose gebundenen Mikroglia und OPCs zu lösen. Entfernen Sie den Überstand mit abgelösten Zellen.

Füge Trypsin zur Astrozytenschicht hinzu. Sammeln Sie die Zellen und zentrifugieren Sie.

Suspendieren Sie das Pellet wieder und teilen Sie die Astrozyten in mehrere Kolben auf.

Beurteilen Sie schließlich die Reinheit der Astrozytenkultur durch Immunfärbung zellspezifischer Marker.

Übertragen Sie die Schale mit den Gehirnen in ein Stereomikroskop. Um die Kortexe zu isolieren, greifen Sie als Nächstes mit einer feinen Pinzette nach dem hinteren Ende jedes Gehirns und führen Sie einen Mittellinienschnitt zwischen den Hemisphären durch.

Führen Sie dann eine zweite Pinzette in die entstandene Rille ein und schälen Sie die plattenartige Struktur der Hirnrinde vom Rest des Gehirns ab.

Wenn alle Kortikalen isoliert sind, schälen Sie die Hirnhäute vorsichtig von der Rinde ab, indem Sie mit der feinen Pinzette ziehen. Dieser Schritt vermeidet eine Kontamination der endgültigen Astrozytenkultur durch Meningealzellen und Fibroblasten.

Übertragen Sie die vorbereiteten kortikalen Hemisphären in eine zweite Schale, die mit gekühltem HBSS gefüllt ist, und legen Sie sie auf Eis. Fahren Sie entsprechend mit allen vier Kortikalen fort. Zum Schluss schneidest du jede Halbkugel mit scharfen Klingen in vier bis acht kleine Stücke.

Übertragen Sie die Cortex-Stücke unter sterilen Bedingungen in ein 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen und fügen Sie HBSS zu einem endgültigen Volumen von 22,5 Millilitern hinzu. Fügen Sie dann 2,5 Milliliter 2,5% Trypsin hinzu.

Setzen Sie die Kappe wieder auf, mischen Sie es und inkubieren Sie das Gewebe 30 Minuten lang im Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Mischen Sie durch Schütteln alle 10 Minuten. Nachdem Sie 5 Minuten lang bei 300 x g zentrifugiert haben, um die Kortexgewebestücke zu pelletieren, wird der Überstand vorsichtig dekantiert.

Geben Sie 10 Milliliter Astrozyten-Beschichtungsmedium in das Pellet und pipettieren Sie das Medium, das das Gewebe enthält, mit einer 10-Milliliter-Pipette 20 bis 30 Mal kräftig auf und ab, bis eine einzelne Zellsuspension erhalten wird.

Geben Sie anschließend Astrozyten-Plattierungsmedium bis zu einem Endvolumen von 20 Millilitern hinzu und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler nach Standardverfahren.

Eine Präparation von vier Maus-Welpenkortiken sollte 10 bis 15 mal 10 bis zur sechsten dissoziierten Einzelzelle ergeben. Schließlich wird das Poly-D-Lysin aus einem zuvor vorbereiteten Kolben aspiriert und die dissoziierte Zellsuspension in den Kolben überführt.

Inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius im Gewebekultur-Inkubator für 2 Tage und wechseln Sie dann das Medium. Danach sollte das Medium alle 3 Tage gewechselt werden.

Der Astrozyt sollte nach 7 bis 8 Tagen in Kultur konfluent mit einer darüber liegenden Schicht aus Mikroglia erscheinen. Zu diesem Zeitpunkt stellen Sie den T75-Kolben 30 Minuten lang auf einen Orbitalschüttler, der auf 180 Umdrehungen pro Minute eingestellt ist, um Mikroglia zu entfernen.

Entsorgen Sie den Überstand, der Mikroglia enthält, oder schleudern Sie ihn herunter und legen Sie ihn für die Kultur auf die Platte. Fügen Sie dann 20 Milliliter frisches Astrozyten-Kulturmedium hinzu und schütteln Sie den Kolben 6 Stunden lang bei 240 U/min, um Oligodendrozyten-Vorläuferzellen zu entfernen.

Da sich einige OPCs nicht vollständig von der Astrozytenschicht lösen, schütteln Sie 1 Minute lang kräftig mit der Hand, um eine OPC-Kontamination zu vermeiden. Auch hier können Sie den Überstand entsorgen oder auf einer Platte herunterschleudern, um OPCs zu kultivieren.

Spülen Sie die verbleibende konfluente Astrozytenschicht zweimal mit PBS aus. Aspirieren Sie das PBS und fügen Sie 5 Milliliter Trypsin-EDTA hinzu. Inkubieren Sie im Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius.

Überprüfen Sie alle 5 Minuten, ob sich die Astrozyten ablösen, und erzwingen Sie die Ablösung der Astrozyten, indem Sie den Kolben zwei- bis dreimal gegen Ihre Handfläche schlagen.

Sobald sich die Astrozyten vom Kolben gelöst haben, fügen Sie 5 Milliliter Astrozyten-Nährmedium hinzu. Schleudern Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 180 x g, aspirieren Sie den Überstand und fügen Sie 40 Milliliter frisches Astrozyten-Beschichtungsmedium hinzu.

Ein T75-Kolben mit gemischten kortikalen Zellen sollte nach der ersten Passage etwa 1 mal 10 bis zu den sechsten Zellen ergeben, die für Astrozyten angereichert sind.