Endothelzellkultur aus Mikrogefäßen des Rattengehirns: Ein Verfahren zur Isolierung und Kultivierung von Endothelzellen aus Mikrogefäßen des Rattengehirns

Um Endothelzellen des Gehirns zu isolieren, wird zunächst ein geerntetes Rattengehirn in eine Schale mit gekühltem Puffer gegeben.

Nachdem Sie das Kleinhirn und den Sehnerv entfernt haben, teilen Sie das Gehirn in Gehirnhälften. Trennen Sie dann das Mittelhirn vom Vorderhirn.

Entfernen Sie die Hirnhäute und die myelinhaltige weiße Substanz aus dem Vorderhirn, wobei die Hirnrinde zur Isolierung der Mikrogefäße zurückbleibt.

Homogenisieren Sie als Nächstes den Kortex, um das Nervengewebe und die Bestandteile zu brechen.

Zentrifugieren Sie das Homogenat, um Zelltrümmer und Myelin zu entfernen.

Behandeln Sie anschließend das Gewebepellet mit einem Verdauungscocktail, der Kollagenase-, Disparase- und Desoxyribonuklease-Enzyme enthält.

Kollagenasen und Dispasen verdauen die extrazelluläre Matrix, die die Mikrogefäße einbettet, und lösen die Mikrogefäßfragmente aus dem Gewebe. Desoxyribonukleasen bauen jegliche freie DNA ab, die aus lysierten Zellen freigesetzt wird.

Das gewünschte Volumen des aufgeschlossenen Homogenats mit einem geeigneten Dichtegradientenmedium mischen und zentrifugieren.

Die oberste Schicht mit Myelin und Hirnparenchymzellen wird verworfen, gefolgt vom Überstand.

Behandeln Sie nun das mikrogefäßhaltige Pellet mit dem Verdauungscocktail, um die Mikrogefäßfragmente, bestehend aus Endothelzellen und Perizyten, vollständig freizusetzen.

Die Suspension zentrifugieren. Resuspendieren Sie das Pellet mit Mikrogefäßfragmenten in einem geeigneten Medium, das mit Puromycin - einem Antibiotikum - ergänzt wird.

Die Suspension wird in eine mit extrazellulären Matrixproteinen beschichtete Platte ausgesät und inkubiert.

Die Mikrogefäßfragmente haften an der Beschichtung in der Platte. Puromycin eliminiert selektiv Perizyten, während die Medienkomponenten die Proliferation von Endothelzellen erleichtern.

Entnehmen Sie das Gehirn aus dem Schädel von drei 5 Wochen alten Wistar-Ratten und geben Sie die Gehirne in eine Petrischale, die mit Kaltdissektionspuffer gefüllt ist und auf Eis gehalten wird.

Präparieren Sie das Gehirn ohne Kleinhirn und Sehnerven. Schneiden Sie dann jedes Gehirn in zwei Hälften, um die beiden Gehirnhälften zu trennen.

Machen Sie unter dem Stereomikroskop einen weiteren Schnitt, um das Mittelhirn zu entfernen, und übertragen Sie alle Vorderhirne in eine saubere Petrischale auf Eis mit Dissektionspuffer.

Übertragen Sie dann ein Vorderhirn in eine neue Petrischale, die mit Kaltdissektionspuffer gefüllt ist. Halten Sie es mit der Klemme fest und lösen Sie vorsichtig die Hirnhäute von den Rändern des Vorderhirns.

Drehen Sie danach das Vorderhirn um und ziehen Sie vorsichtig die Hirnhäute ab, ohne sie zu zerreißen. Stellen Sie sicher, dass das Vorderhirn von Hirnhäuten befreit ist und durchtrennen Sie den restlichen Teil der Sehnerven. Das Ziel dieses Schrittes ist es, die Bettdecke aus weißer Substanz zu entfernen, um eine Schale aus Kortex zu erhalten.

Beginnen Sie damit, das Vorderhirn an der Kante festzuklemmen und ziehen Sie dann die Pinzette vorsichtig an der Oberfläche entlang, wobei Sie darauf achten, dass die Oberfläche der Rinde nicht reißt.

Stellen Sie dann sicher, dass das Gehirn frei von den Hirnhäuten ist, indem Sie es umdrehen, um zu überprüfen, ob keine Hirnhäute oder große Oberflächengefäße vorhanden sind.

Als nächstes, beginnend mit der Extraktion der drei Gehirne aus ihrem Schädel, sollte die volle Zeit für die Dissektion nicht länger als 2 Stunden dauern, um das Gewebe zu erhalten und das Überleben der Zellen zu gewährleisten. Übertragen Sie die Kortike von drei Gehirnen auf 6 Milliliter Kaltdissektionspuffer in einem 7-Milliliter-Dounce-Homogenisator.

Dissoziieren Sie anschließend die Kortikale mit 10 Auf- und Abbewegungen mit dem ersten Stößel mit größerem Spielraum, gefolgt von 10 Auf- und Abwärtsbewegungen mit dem zweiten Stößel mit kleinerem Spielraum.

Übertragen Sie dann 6 Milliliter der Suspension in ein neues 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen und waschen Sie den Dounce-Homogenisator mit 24 Millilitern Kaltdissektionspuffer. Teilen Sie die Suspension in drei Falcon-Röhren auf, um das Äquivalent von einem Kortex pro Röhrchen zu erhalten.

Anschließend bei 1000 x g 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Die Betrachtung des Pellets zeigt einen rosafarbenen Farbgradienten, der den Mikrogefäßteil des Homogenats der Kortikel darstellt.

Entsorgen Sie nun den Überstand und homogenisieren Sie das Pellet aus einer Rinde mit 1 Milliliter enzymatischer Lösung, die eine Mischung aus Kollagenasen, Dispase, DNase Typ 1 und Gentamicin enthält.

Legen Sie die Röhrchen für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius in einen Shaker. Mischen Sie dann 1 Milliliter Aufschluss mit 10 Millilitern 25 % BSA/HBSS 1X und wirbeln Sie die Röhrchen vorsichtig ein. Anschließend trennen Sie diese durch dichteabhängige Zentrifugation bei 3.600 x g für 15 Minuten bei Raumtemperatur.

Nach der dichteabhängigen Zentrifugation enthält das Pellet die Mikrogefäße und die obere Scheibe enthält Myelin, Hirnparenchym und verbleibende Mikrogefäße.

Füllen Sie die obere Scheibe und den Überstand vorsichtig in saubere 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen und achten Sie darauf, dass das Mikrogefäßpellet nicht abgesaugt wird.

Wirbeln Sie das Röhrchen vorsichtig vor und wiederholen Sie die dichteabhängige Zentrifugation. Halten Sie während dieser zweiten Zentrifugation das resultierende Pellet mit den Mikrogefäßen bei 4 Grad Celsius.

Nach der zweiten dichteabhängigen Zentrifugation werden die obere Scheibe und der Überstand vorsichtig entsorgt. Die resultierenden Pellets, die die Mikrogefäße aus beiden Zentrifugen enthalten, werden mit 1 Milliliter kaltem HBSS 1X gemischt und resuspendiert.

Anschließend die Mikrogefäße mit 20 Millilitern kaltem HBSS 1X waschen und 5 Minuten bei 1.000 x g zentrifugieren. Entsorgen Sie dann den Überstand und achten Sie darauf, dass das Mikrogefäßpellet nicht verloren geht.

Homogenisieren Sie das Mikrogefäß-Pellet aus einer Rinde mit 1 Milliliter der gleichen enzymatischen Lösung, indem Sie einem sanften Wirbel der Röhrchen folgen. Verdauen Sie die Mikrogefäße 1 Stunde lang bei 37 Grad Celsius in einem Shaker. Mischen Sie danach die verdauten Mikrogefäße aus den drei Kortikalen in ein Röhrchen.

Trennen Sie die Mischung wieder in zwei 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen, um die Mikrogefäße zu erhalten, die aus dem Äquivalent von eineinhalb Kortiken pro Röhrchen extrahiert werden. Dann bei 1.000 x g 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren.

Kurz vor dem Plattieren der Mikrogefäße werden zwei beschichtete T75-Kolben aus dem Inkubator entnommen und der Überschuss der Beschichtung abgesaugt. Den Überstand verwerfen und das Mikrogefäßpellet in 1 Milliliter ECM resuspendieren.

Bringen Sie jedes Röhrchen auf 10 Milliliter mit ECM, ergänzt mit 4 Mikrogramm pro Milliliter Puromycin, um den Reinigungsprozess zu starten, und plattieren Sie die Mikrogefäße im Kolben.

Legen Sie dann die Kolben bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in den Inkubator, um die Adhäsion der Mikrogefäße an der Kollagen-Fibronektin-Matrix zu ermöglichen.