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Krebsforschung
0 Aufrufe • 4:15 Min. • July 8th, 2025
Hirntumor-Stammzellen (BTSCs), eine Subpopulation von Hirntumorzellen, können das Tumorwachstum und die Metastasierung initiieren, was sie zu vielversprechenden Zielen für die Krebstherapie macht. Um die Wirkung von Arzneimitteln auf die BTSC-Migration in vitro zu untersuchen, stellen Sie zunächst einheitliche Suspensionen von BTSCs in einem geeigneten Medium her. Behandeln Sie eine der Suspensionen mit dem gewünschten Medikament.
In der Zwischenzeit erhalten Sie eine Multi-Well-Chemotaxisplatte, die aus membranösen Einsätzen besteht, die jede Vertiefung in eine obere und eine untere Kammer unterteilen. Pipettieren Sie das gewünschte extrazelluläre Matrixprotein in die unteren Kammern und membranösen Inserts. Inkubieren, um die Polymerisation des Proteins zu erleichtern.
Geben Sie ein geeignetes Basalmedium, das den gewünschten Chemolockstoff enthält, in die unteren Kammern und legen Sie es über die membranösen Einsätze. Als nächstes säen Sie die medikamentös behandelte und unbehandelte BTSC-Suspension in membranöse Inserts. Bilden Sie die Platte über einen längeren Zeitraum mit der Lebendzellmikroskopie ab.
In Kultur haften BTSCs an der Proteinmatrix des Inserts. Als Reaktion auf den zwischen der oberen und unteren Kammer etablierten Konzentrationsgradienten des Chemotraktors wandern die unbehandelten BTSCs über die Proteinmatrix durch die Membraninsert-Poren in die untere Kammer.
Die medikamentöse Behandlung wirkt sich jedoch negativ auf die funktionelle Aktivität der Zellen aus und verringert die BTSC-Migration. Nun können Sie mit geeigneter Software die migrierten BTSCs in den unteren Kammern analysieren und quantifizieren. Die unbehandelten BTSCs zeigen eine erhöhte Migration, während die medikamentös behandelten BTSCs eine verringerte Migration aufweisen.
Um die Auswirkungen einer medikamentösen Behandlung von Interesse auf die Migration zu bewerten, werden die Zellen zunächst für einen geeigneten Versuchszeitraum mit der entsprechenden Konzentration des Medikaments vorbehandelt. Zur Vorbereitung der Chemotaxisplatte beschichten Sie drei Membraneinsatz-Wells und drei Bodenreservoir-Vertiefungen pro Bedingung einer 96-Well-Chemotaxisplatte mit 75 bzw. 225 Mikrolitern 0,2 Milligramm pro Milliliter Typ-I-Kollagen für 1 Stunde bei 37 Grad Celsius.
Am Ende der Inkubation aspirieren Sie die Kollagenlösung aus jeder Vertiefung, ohne die Kollagenbeschichtung zu zerkratzen, und waschen Sie die Vertiefungen zweimal mit sterilem PBS. Entfernen Sie nach der letzten Wäsche den Einsatz von der Platte und geben Sie 225 Mikroliter wachstumsfaktorfreies Medium, ergänzt mit 10 % FBS, in jede Vertiefung des unteren Reservoirs der Chemotaxisplatte.
Bringen Sie dann den oberen Einsatz vorsichtig in einem Winkel in den unteren Behälter zurück, um Blasenbildung zu vermeiden, und fügen Sie 2,5 mal 10 zu den dritten dissoziierten BTSCs in 50 Mikrolitern wachstumsfaktorfreiem Medium zu jeder Einsatzvertiefung hinzu. Es ist wichtig, die BTSCs vollständig in einzelne Zellen zu dissoziieren und sie vor dem Plattieren sorgfältig zu zählen, um Zellklumpen oder zu viele Zellen im oberen Einsatz zu vermeiden.
Um die BTSC-Migration entlang des FBS-Gradienten abzubilden, platzieren Sie die Platte in einem Lebendzell-Bildgebungssystem und stellen Sie die automatisierte Bildgebungssoftware so ein, dass sie bis zu 72 Stunden lang alle 1 bis 2 Stunden mikroskopische Bilder der Platte aufnimmt. Wenn die Bildaufnahme abgeschlossen ist, wählen Sie eine neue Verarbeitungsdefinition, um die BTSCs von ihren Einsatzporen auf der Unterseite der Membran zu unterscheiden, und ändern Sie die Analyse, wenn sie die Zellen nicht wie nötig genau von der Hintergrundmembran unterscheidet.
Um die Zellen zu quantifizieren, die durch die Poren gewandert sind, sammeln Sie die Daten als Zelloberfläche auf der Unterseite der Membran für jede der drei Replizierungsvertiefungen pro Zustand. Stellen Sie dann die Zellmigration grafisch dar, wie die Fläche der Zellen im Laufe der Zeit in Mikrometern zum Quadrat migriert ist.