JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Krebsforschung
0 Aufrufe • 4:13 Min. • July 8th, 2025
Das Glioblastom besitzt stammähnliche Zellen, die entlang der axonalen Bahnen myelinisierter Neuronen wandern, um in entfernte Orte im Gehirn einzudringen. Um die Wanderung von Glioblastom- oder GBM-Zellen auf Neuronen in vitro zu rekapitulieren, beginnen Sie mit der Entnahme eines Glasdecktuchs.
Aktivieren Sie das Deckglas durch eine Sauerstoffplasmabehandlung und grundieren Sie es mit einem Funktionalisierungsmittel. Diese Behandlung unterstützt den einfachen Zugang zu den Chemikalien in den nachfolgenden Schritten. PEGylierte Lösung zum Deckglas geben und inkubieren. Diese Lösung bedeckt das Deckglas und verhindert die Adhäsion von Neuronen an zufälligen Stellen.
Geben Sie ein Photoinitiator-Polymer auf das Deckglas und montieren Sie es in der Bildgebungskammer. Stellen Sie die Kammer auf den Tisch eines Fluoreszenzmikroskops. Im Inneren werden die Photoinitiator-Moleküle durch die UV-Beleuchtung lokal an den dafür vorgesehenen Stellen aktiviert, die den vorgesehenen Mikromustern entsprechen.
Die aktivierten Photoinitiator-Moleküle spalten die darunterliegende PEG-Schicht und erzeugen so das gewünschte Muster. Fügen Sie nun die Lamininlösung hinzu und inkubieren Sie. Laminin - ein Glykoprotein - lagert sich an bestimmten Stellen ab, an denen die PEG-Schicht entfernt wurde. Säen Sie das Medium mit den Hippocampus-Neuronen der Ratte auf das Deckglas.
Inkubieren, um die Adhärenz der Neuronen an den lamininbeschichteten Arrays zu ermöglichen, um neuronenmikrostrukturierte Deckgläser zu erhalten. Legen Sie eine Suspension von fluoreszenzmarkierten GBM-Zellen über die mikrostrukturierten Neuronen ab. Bild, um zu sehen, wie die fluoreszierenden GBM-Zellen auf Neuronen wandern.
Um ein Substrat für die Mikrostrukturierung herzustellen, behandeln Sie 18 Millimeter große kreisförmige Glasdeckgläser 5 Minuten lang durch Luft- oder Plasmaaktivierung, bevor Sie die Deckgläser 1 Stunde lang in einen Exsikkator mit 100 Mikrolitern 3-Aminopropyltriethoxysilan legen. Inkubieren Sie dann eine Lösung von Peg-SVA bei 100 Milligramm pro Milliliter für 1 Stunde zur Gelabscheidung. Geben Sie am Ende der Inkubation 3 Mikroliter PLPP und 50 Mikroliter absolutes Ethanol in die Mitte des Objektträgers und warten Sie, bis er vollständig getrocknet ist.
Für die Mikrostrukturierung von Objektträgern montieren Sie das Deckglas in einer Ludin-Kammer und stellen Sie die Kammer auf den Tisch eines Mikroskops, das mit einem Autofokus-System ausgestattet ist. Laden Sie nach dem Imaging die mikrostrukturierten Bilder in die Software. Nach der automatischen Sequenzierung mit UV-Beleuchtung waschen Sie das PLPP mit einer Pipette ausgiebig mit PBS vom Deckglas. Inkubieren Sie dann das Deckglas 30 Minuten lang mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Laminin, gefolgt von einer weiteren Wäsche mit PBS, wie gezeigt.
Um eine embryonale Hippocampus-Neuronenkultur der Ratte auf den mikrostrukturierten Deckgläsern einzurichten, rehydrieren Sie die Objektträger nach dem letzten Waschen mit neuronalem Zellkulturmedium. Säen Sie 5 mal 10 bis zur vierten Ratte suspendierte Hippocampus-Neuronen in neurobasalem Medium, angereichert mit 3 % Pferdeserum pro Quadratzentimeter, auf jedes mikrostrukturierte Deckglas für eine 24-stündige Inkubation in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Dissoziierte Glioblastomzellen werden 5 Minuten lang bei 1.000 U/min zentrifugiert und das Pellet in Glioblastom-Zellkulturmedium resuspendiert. Legen Sie dann 1 mal 10 bis zu den dritten GBM-Zellen über den mikrostrukturierten Neuronen ab.