Isolierung von Hirnkapillaren aus dem menschlichen Gehirn: Eine optimierte Methode zur Extraktion von Hirnkapillaren aus menschlichem Hirngewebe

Zerebrale Kapillaren sind ein wichtiger Bestandteil der Blut-Hirn-Schranke - eine semipermeable Barriere, die eine selektive Bewegung von gelösten Stoffen zwischen Blut und Gehirn ermöglicht. Um Hirnkapillaren zu isolieren, beginnen Sie mit frischem menschlichem Gehirngewebe. Entfernen Sie die Hirnhäute und hacken Sie die weiße Substanz ab.

Zerkleinern Sie das Hirngewebe in kleinere Fragmente. Die Fragmente werden in einen Homogenisator mit einem geeigneten Puffer überführt und homogenisiert. Durch die Homogenisierung wird das Gewebe zersetzt, wodurch Kapillaren und Gewebetrümmer in die Lösung freigesetzt werden.

Das Homogenat wird in ein frisches Röhrchen umgefüllt und ein optimales Volumen eines geeigneten Dichtegradientenmediums hinzugefügt. Zentrifugieren Sie die Lösung, um die Kapillaren zu pelletieren. Zu viel oder zu wenig Dichtegradient mittel führt zu einer geringen Kapillarausbeute. Entfernen Sie den Überstand.

Resuspendieren Sie das Pellet in Rinderserumalbumin oder BSA-supplementiertem Puffer. BSA stabilisiert Verdauungsenzyme und erhält die strukturelle Integrität der Kapillaren. Filtrieren Sie anschließend die Lösung mit einem geeigneten Filter, um große Gefäße und Gewebereste zu entfernen.

Lassen Sie dann das Filtrat durch einen kleineren Maschenfilter. Dieser Filter hält die Hirnkapillaren zurück und lässt kleinere Ablagerungen und rote Blutkörperchen durch. Drehen Sie anschließend den Filter um und waschen Sie die Kapillaren in einem frischen Röhrchen mit BSA-zugesetztem Puffer ab.

Die Lösung zentrifugieren und den Überstand entfernen. Suspendieren Sie die reinen Kapillaren in Puffer und lagern Sie sie für die weitere Verwendung.

Um dieses Verfahren zu beginnen, dokumentieren Sie das Gewicht des menschlichen Gehirngewebes, das etwa 10 Gramm betragen sollte. Entfernen Sie unter dem Mikroskop vorsichtig alle Hirnhäute mit einer Pinzette und schneiden Sie mit einem Skalpell die weiße Substanz ab. Schneiden Sie dann das Hirngewebe vorsichtig auf und hacken Sie es mit einem Skalpell etwa 5 Minuten lang.

Übertragen Sie das Hirngewebe in die Gewebeschleifmaschine und fügen Sie 30 Milliliter Isolationspuffer hinzu. Anschließend wird jede Probe mit 100 Hüben bei 50 U/min homogenisiert. Rühren Sie nicht in Luft ein, um Blasen zu vermeiden. Dokumentieren Sie die Zeit alle 25 Striche und die Gesamtzeit, die für 100 Schläge benötigt wird. Anschließend wird das Homogenat in einen Dounce Homogenisator auf Eis überführt. Homogenisieren Sie die Suspension für ca. 20 Hübe und vermeiden Sie Blasen.

Verteilen Sie dann das Gehirnhomogenat gleichmäßig auf vier 50-Milliliter-Zentrifugationsröhrchen und dokumentieren Sie das Gesamtvolumen des Homogenats. Stellen Sie sicher, dass Sie das richtige Volumen an Ficoll hinzufügen. Zu wenig oder zu viel Ficoll führt zu einer falschen Dichte, um die Kapillaren von den Zelltrümmern zu trennen, und reduziert somit das Kapillargranulat und begrenzt die Ausbeute.

Verwenden Sie 10 Milliliter Isolationspuffer, um den Stößel und den Homogenisator zu spülen und auf die vier Zentrifugationsröhrchen zu verteilen. Verteilen Sie anschließend 50 Milliliter Dichtegradientenpuffer in die Zentrifugationsröhrchen. Verschließen Sie die Zentrifugenröhrchen mit Kappen fest. Mischen Sie anschließend das Homogenat, das Dichtegradientenmedium und den Puffer, indem Sie die Röhrchen kräftig schütteln. Zentrifugieren Sie bei 5.800 x g für 15 Minuten bei 4 Grad Celsius. Anschließend wird der Überstand verworfen und jedes Pellet in 2 Millilitern 1 % BSA resuspendiert.

Nach dem Resuspendieren des Pellets filtrieren Sie die Suspension durch das 300-Mikrometer-Maschen. Kapillaren werden durch das Netz gefiltert, während größere Gefäße und größere Hirntrümmer auf dem Netz verbleiben. Waschen Sie das Netz vorsichtig mit bis zu 50 Millilitern 1 % BSA und entsorgen Sie das Netz. Um die Kapillaren von roten Blutkörperchen und anderen Hirntrümmern zu trennen, verteilen Sie das Kapillarfiltrat auf 530-Mikrometer-Zellstammfilter.

Kapillaren werden durch diesen Filter zurückgehalten, während rote Blutkörperchen, andere Einzelzellen und kleine Hirntrümmer den Filter passieren und im Filtrat gesammelt werden. Waschen Sie anschließend jeden Filter mit 25 Millilitern 1% BSA. Gießen Sie alle Filter über den sechsten Filter, um die Ausbeute zu erhöhen. Waschen Sie jeden Filter mit 50 Millilitern 1 % BSA. Bewahren Sie die Zellstammfilter mit den Kapillaren auf und entsorgen Sie das Filtrat. Drehen Sie dann die Filter auf den Kopf und waschen Sie die Kapillaren mit 50 Millilitern 1 % BSA in 50-Milliliter-Röhrchen.

Üben Sie mit der Pipettenspitze vorsichtig Druck aus und bewegen Sie sie über den Filter, um die Gehirnkapillaren abzuwaschen. Achten Sie darauf, alle Kapillaren des Gehirns abzuwaschen, insbesondere vom Rand des Filters. Vermeiden Sie Blasen, da dies den Filtrationsprozess erschwert und die Wahrscheinlichkeit von Kapillarverlusten erhöht. Nach der Entnahme der Kapillaren zentrifugieren Sie alle Proben bei 1.500 x g für 3 Minuten bei 4 Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in etwa 3 Millilitern Isolationspuffer.

Kombinieren Sie dann alle resuspendierten Pellets aus einer Probe in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen und füllen Sie es mit Isolationspuffer. Nochmals bei 1.500 x g für 3 Minuten bei 4 Grad Celsius zentrifugieren und noch zwei Mal waschen. Dokumentieren Sie die Kapillarreinheit mit einem Mikroskop mit 100-facher Vergrößerung und Kamera. Die isolierten Hirnkapillaren können nun für Experimente verwendet, verarbeitet oder schockgefrostet und bei minus 80 Grad Celsius in Kryoröhrchen für mindestens 6 bis 12 Monate gelagert werden.