Fluoreszierende Peptid-Zymographie: Eine modifizierte Technik zum Nachweis der Proteaseaktivität unter Verwendung fluorogener Substrate in Zymogramm-Gelen

Die Zymographie ist eine elektrophoretische Technik, bei der ein Proteinsubstrat mit Polyacrylamidgel copolymerisiert wird, um hydrolytische Enzyme und ihre Aktivität nachzuweisen. Lösen Sie die Proben zunächst in einem Zymographiepuffer auf, der Glycerin, Natriumdodecylsulfat oder SDS und Bromphenolblau enthält.

Glycerin macht den Probenpuffer dichter als den umgebenden Laufpuffer des Gels, was ein einfaches Laden in die Geltaschen ermöglicht. SDS - ein anionisches Reinigungsmittel - denaturiert Enzyme in der Probe und überzieht sie mit einer negativen Ladung. Bromphenolblau - ein Tracking-Farbstoff - hilft bei der Überwachung des Probenfortschritts im Gel.

Laden Sie die Proben in Polyacrylamidgel, das in fluorogene Substrate eingebettet ist, um die Proteaseaktivität nachzuweisen. Schließen Sie nun die Elektroden an und beginnen Sie mit der Elektrophorese. Das erzeugte elektrische Feld bewirkt, dass alle SDS-gebundenen Enzyme durch das Gel in Richtung der positiv geladenen Elektrode wandern.

Entfernen Sie nach Abschluss der Elektrophorese das Gel und waschen Sie es in einem Renaturierungspuffer, der nichtionisches Detergens enthält, das SDS ersetzt, um eine Enzymrenaturierung zu e