Orthotope Langzeittransplantation von Tumorzellen in Zebrafischembryonen: Eine effiziente Methode zur Verlagerung von Tumorzellen in den vierten Ventrikel von Zebrafischembryonen zur Langzeitanalyse des Verhaltens von Tumorzellen

Bei der orthotopen Transplantation werden Tumorzellen oder Gewebe eines tumortragenden Spenders in das entsprechende Gewebe eines Empfängers derselben Spezies transplantiert. Bereiten Sie zunächst eine einheitliche Suspension - in einem geeigneten Puffer - von fluoreszenzmarkierten Hirntumorzellen her, die von einem tumortragenden Zebrafisch entnommen wurden. Laden Sie diese Zellsuspension mit einer feinen Gelladespitze in eine Mikroinjektionsnadel.

Befestigen Sie anschließend die geladene Nadel in der Halterung eines Mikromanipulators. Anschließend übertragen Sie einen anästhesierten Zebrafischembryo auf eine vorgefertigte Injektionsplatte. Für einen einfachen Zugang während der Mikroinjektion positionieren Sie den Embryo seitlich, um die Hirnventrikel sichtbar zu machen - ein Netzwerk von mit Liquor gefüllten Hohlräumen im Gehirn.

Stellen Sie die Nadelspitze so ein, dass die Tumorzellsuspension in den vierten Ventrikel, die rautenförmige Höhle des Hinterhirns des Embryos, injiziert wird. Die Tumorzellen nehmen den Hohlraum innerhalb der Herzkammer ein. Ziehen Sie die Nadel zurück. Übertragen Sie den Embryo in eine Kulturschale mit Kochsalzlösung. Beobachten Sie den Embryo unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop, um das Vorhandensein von Tumorzellen im Ventrikelraum zu bestätigen.

Inkubieren Sie den Embryo. Innerhalb weniger Stunden nach der Injektion wandern die Tumorzellen und dringen in das umliegende Hirngewebe ein, wo sie sich dann vermehren und neue Tumore hervorbringen. Im Laufe der Zeit vermehren sich Tumorzellen und dringen weiter ein, wobei sie sich im gesamten Gehirn ausbreiten.

Mit einer Transferpipette werden 10 bis 20 anästhesierte Embryonen in die Peripherie der Injektionsplatte übertragen. Die Embryonen sollten seitlich fallen, wobei die Ventrikel deutlich sichtbar und zugänglich sind. Verwenden Sie eine abgewinkelte Sonde, um die Embryonen nach Bedarf anzupassen, und positionieren Sie sie vom äußeren Rand der Injektionsplatte weg.

Verwenden Sie

dann eine Gelladespitze, um 1 bis 2 Mikroliter der Tumorzellsuspension in die Injektionsnadel zu laden und die Nadel in den Manipulator einzuführen. Senken Sie anschließend den Manipulator manuell ab und halten Sie die Nadel in einem 45-Grad-Winkel. Stellen Sie die Knöpfe des Mikromanipulators in x-, y- und z-Richtung ein, bis sich die Nadel knapp über und etwa 5 Millimeter rechts vom Embryokopf befindet.

Stellen Sie den Mikromanipulator mit einem Stereomikroskop langsam in x-Richtung ein, bis die Nadel den vierten Ventrikel des Embryos durchbohrt. Lassen Sie die Nadel nicht das Herz oder das Eigelb durchstechen. Für konsistente Injektionen müssen die Embryonen betäubt werden. Der Tumor muss ordnungsgemäß in eine zelluläre Suspension dissoziiert werden, und die Nadel muss den vierten Ventrikel durchstechen, darf aber nicht über das Herz hinaus reichen.

Drücken Sie das Fußpedal des Mikroinjektors, um die Tumorzellsuspension zu injizieren. Wenn Sie mit der Injektion fertig sind, spülen Sie die injizierten Embryonen vorsichtig von der Injektionsplatte in eine Petrischale ab. Untersuchen Sie nun die injizierten Embryonen unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop in einem dunklen Raum. Vergewissern Sie sich, dass der Injektionsdruck, der Winkel, die Nadelgröße und die Viskosität der Zellsuspension dazu führen, dass Tumorzellen 25 % bis 50 % des Ventrikelraums ausfüllen.

Setzen Sie die Embryonen über Nacht wieder in den 28 Grad Celsius heißen Inkubator ein. Am nächsten Tag beurteilen Sie das Überleben des Embryos, indem Sie morphologische und physiologische Merkmale wie die normale Herz- und Gehirnentwicklung, wie zuvor beschrieben, untersuchen.