Glioblastom-Induktion mittels SB-vermittelter Transposition: Eine Technik zur Generierung eines neuartigen Mausmodells unter Verwendung der Transposon-vermittelten Integration von SB-Plasmid in das Gehirn von Neugeborenen

Beginnen Sie damit, ein Röhrchen zu nehmen, das eine Mischung aus Plasmiden enthält. Das Dornröschen- oder SB-Transposon-Plasmid ist so konstruiert, dass es ein transponierbares Element trägt, das ein vom Menschen stammendes Glioblastom-induzierendes Onkogen umfasst, das zwischen zwei invertierten Wiederholungssequenzen eingebettet ist. Darüber hinaus enthält diese Mischung ein SB-Transposase-Plasmid, das ein Transposase-Enzym-exprimierendes Element aufweist.

Geben Sie nun ein geeignetes Transfektionsreagenz in das Röhrchen. Die Injektionsmischung wird in eine Spritze mit einer Mikronadel aspiriert. Befestigen Sie als Nächstes einen anästhesierten Mauswelpen in Bauchlage auf einem stereotaktischen Rahmen. Visualisieren Sie die Kopfregion des Welpen, um die Schädelnähte zu lokalisieren. Positionieren Sie die Mikronadel über den Schädelnähten.

Injizieren Sie die Mischung in den Seitenventrikel - einen Hohlraum im Hirnparenchym. Anschließend wird die Lösung in das Hirnparenchym dispergiert, wo die Transfektionsreagenzmoleküle den Eintritt von Plasmiden in die Zellen erleichtern. Sobald sich das Transposase-Plasmid in der Zelle befindet, exprimiert es die Transposase-Enzymmoleküle, die die invertierten Wiederholungssequenzen erkennen und das Transposon-Element herausschneiden.

Die transponierbare Element-DNA integriert sich dann wieder in die TA-Repeat-Region der genomischen DNA des Welpen. Die genetische Transposition führt zu einer onkogenen Transformation von Gehirnzellen, die zur Entwicklung eines Glioblastoms im Gehirn der Maus führt.

3 bis 4 Wochen vor dem Versuch stellen Sie einen Zuchtkäfig für Mäuse mit einem Männchen und einem Weibchen auf. Fügen Sie ein farbiges Plastikiglu hinzu, um die Umgebung zu bereichern und die Chancen auf eine Paarung zu erhöhen. Entfernen Sie das Männchen, sobald eine Trächtigkeit bestätigt wurde, und beginnen Sie 18 Tage nach dem Paarungstag mit der Überwachung des Weibchens bis zur Geburt. Stellen Sie sicher, dass zum Zeitpunkt der Entbindung eine Leihmutter verfügbar ist.

Führen Sie am ersten Tag nach der Geburt die intraventrikulären Injektionen durch. Die Injektionslösung wird hergestellt, indem zunächst 20 Mikroliter des DNA-Mixes, der die Transposon-Plasmide enthält, in einer Endkonzentration von 0,5 Mikrogramm DNA pro Mikroliter aliquotiert werden. Als nächstes fügen Sie der DNA-Lösung ein 20-Mikroliter-Aliquot PEI-Lösung hinzu und lassen Sie sie 20 Minuten bis eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren, danach sollte die Mischung auf Eis gelagert werden.

Befestigen Sie für die Injektionsnadel eine 10-Mikroliter-Spritze an einer 30-Gauge-Injektionsnadel, die bei 12,5 Grad abgeschrägt ist. Befestigen Sie dann die Spritze an einer Pumpe mit automatischer Injektion. Testen Sie das Setup mit 10 Mikrolitern Wasser und achten Sie darauf, die Spritze zu leeren. Kühlen Sie nun das stereotaktische Stadium des Neugeborenen mit einer Aufschlämmung aus Trockeneis und Alkohol ab. Wenn es auf 2 bis 8 Grad Celsius abgekühlt ist, fahren Sie mit den Injektionen fort.

Betäuben Sie einen Welpen, indem Sie ihn 2 Minuten lang auf Eis legen. Während der Welpe auf Eis liegt, befüllen Sie die Spritze mit der Injektionslösung. Sobald der Welpe betäubt ist, übertragen Sie ihn in den Rahmen und fixieren Sie seinen Kopf zwischen den mit Gaze bedeckten Ohrstangen. Vergewissern Sie sich, dass die dorsale Seite des Schädels horizontal und parallel zur Rahmenoberfläche verläuft. Auch die Schädelnähte sollten deutlich sichtbar sein.

Wenn der Kopf des Welpen nicht fest genug immobilisiert ist, bewegt er sich während der Injektion, während er zu fest zwischen die Ohrstangen des Rahmens gedrückt wird, das Lambda nicht sichtbar ist und der Druck im Kopf die injizierte Lösung zum Austreten zwingt.

Wenn der Welpe fest am Rahmen festsitzt, wischen Sie den Kopf mit 70 % Ethanol ab. Senken Sie dann die Nadel ab und stellen Sie ihre Position so ein, dass sie das Lambda berührt. Als nächstes heben Sie die Nadel an und bewegen sie 0,8 Millimeter seitlich und 1,5 Millimeter rostral. Senken Sie es dann wieder ab, bis es die Haut leicht einweicht. Notieren Sie sich die Koordinaten dieser Position. Senken Sie dann die Nadel 1,5 Millimeter durch die Haut und den Schädel und in die Rinde am Seitenventrikel ab.

Injizieren Sie dort 0,75 Mikroliter über 90 Sekunden und warten Sie eine Minute, bis sich die Lösung dispergiert hat. Während des Wartens kann der nächste Welpe, der injiziert werden soll, betäubt werden. Nach der Wartezeit die Nadel langsam anheben. Bringen Sie den Welpen dann an einen Erholungsort unter einer Heizlampe. Die Zeit von der Betäubung bis zur Erwärmung muss weniger als 10 Minuten betragen; Je schneller, desto besser.

Überwachen Sie die Atmung und reiben Sie bei Bedarf sanft die Gliedmaßen, um die Atmung anzuregen. Sobald der Welpe aufgewärmt ist, eine rosige Farbe und einen gleichmäßigen Atem hat, bringen Sie ihn zu seiner Mutter zurück.