Ex-vivo-Elektroporation von Kleinhirnschnitten von Kükenembryonen: Eine Methode zur Einführung von Plasmid-DNA, die für grün fluoreszierendes Protein kodiert, um die Entwicklung granularer Zellen zu visualisieren

Kleinhirn-Körnerzellen sind die am häufigsten vorkommende Art von Neuronen im Gehirn. Die äußere granulare Schicht, EGL, besteht ausschließlich aus granularen Zellvorläufern, GCPs, die sich differenzieren und nach innen wandern, um die innere granulare Schicht, IGL, zu bilden.

Um die Entwicklung granularer Zellen zu visualisieren, bereiten Sie eine Elektroporationskammer vor, indem Sie eine Anode an der Basis einer Petrischale anbringen. Geben Sie Kulturmedium hinzu, um die Elektrode abzudecken. Platzieren Sie nun einen Kultureinsatz auf der mediumbedeckten Elektrode. Übertragen Sie die Kleinhirnscheiben des Hühnerembryos in sagittaler Ausrichtung auf den Kultureinsatz.

Die Sagittalebene ermöglicht es, die Zielschicht-EGL gegen verschiedene Kleinhirnschichten zu identifizieren. Geben Sie eine viskose Farbstofflösung, die eine GFP-Plasmid-DNA über EGL enthält. Die GFP-Plasmid-DNA kodiert für ein grün fluoreszierendes Protein, das sich homogen im Zellzytoplasma verteilt und die Bildgebung lebender Zellen ermöglicht.

Platzieren Sie anschließend eine Kathode im Medium in der Nähe von EGL, jedoch nicht direkt auf dem Gewebe. Wenden Sie dann mehrere elektrische Impulse an verschiedene EGL-Bereiche an. Die elektrischen Impulse induzieren temporäre Poren in der Zellmembran, die es den Zellen ermöglichen, die Plasmid-DNA aufzunehmen. Anschließend ermöglicht die Plasmid-DNA die GFP-Expression in granulären Zellen.

Bilden Sie die Kleinhirnschnitte unter einem Fluoreszenzmikroskop ab, um die granulare Zelldifferenzierung und das Migrationsmuster in verschiedenen Stadien der Zellentwicklung zu beobachten.

Konstruieren Sie eine Elektroporationskammer, indem Sie die Anode eines Elektroporators mit Isolierband am Boden einer 60-Millimeter-Petrischale befestigen. Fügen Sie etwa 1 Milliliter HBSS hinzu, um die Elektrode zu bedecken. Platzieren Sie als Nächstes einen 0,4-Mikrometer-Kultureinsatz auf der mit HBSS bedeckten Elektrode.

Verwenden Sie eine 3-Milliliter-Pasteurpipette mit einer abgeschnittenen Spitze, um die identifizierten Scheiben, bis zu 5 pro Einsatz, auf den Kultureinsatz zu übertragen. Trennen Sie dann die Scheiben und lassen Sie sie in sagittaler Ausrichtung auf dem Kultureinsatz absetzen. Entfernen Sie mit einer Pipette überschüssiges Medium aus den Hirnschnitten. Lassen Sie den Einsatz auf der Elektrode ruhen, so dass ein Kontakt zwischen dem Einsatz und der Elektrode besteht.

Bei diesem Aufbau ruht der Kultureinsatz mit den Scheiben auf der Oberfläche des Mediums, wobei der Schaltkreis erhalten bleibt, aber eine räumliche Ausrichtung der Kathode ermöglicht wird. Pipettieren Sie mit einer P10-Pipettenspitze 5 Mikroliter DNA, verdünnt mit 20 % Fast Green, auf die Oberfläche einer bestimmten Region jeder Schnittscheibe. Die Zugabe von Fast Green stellt sicher, dass die DNA-Lösung viskos genug ist, um eine weite Ausbreitung der DNA zu verhindern.

Legen Sie dann die Kathode über das gewünschte Zielgewebe und elektropolieren Sie die Proben. Vermeiden Sie den direkten Kontakt der Kathode mit dem Gewebe, indem Sie die Kathode so nah wie möglich am Gewebe platzieren, ohne es tatsächlich zu berühren. Wiederholen Sie die Elektroporation in mehreren Bereichen der äußeren Körnerschicht auf jeder einzelnen Kleinhirnscheibe wie gewünscht.

Wenn Sie fertig sind, geben Sie den Kultureinsatz in eine 30-Millimeter-Petrischale. Geben Sie zu jeder Kultur 1 Milliliter vorgewärmtes Nährmedium unter den Kultureinsatz. Achten Sie darauf, dass die Einlage nicht auf dem Medium schwimmt. Der Kultureinsatz sollte mit dem Medium in Kontakt kommen, aber die Scheiben sollten nicht darin gebadet werden.