Isolierung von Rückenmarksneuronen: Ein Dichtegradientenverfahren zur Isolierung von neonatalen Rückenmarksneuronen für In-vitro-Studien

Um Neuronen des Rückenmarks zu isolieren, nehmen Sie eine Wirbelsäule einer neugeborenen Maus und legen Sie sie auf eine Petrischale. Spülen Sie die Wirbelsäule mit Kochsalzlösungspuffer, um das Rückenmark zu lösen. Übertragen Sie das Rückenmark in ein kaltes neuronales Medium, um das Überleben der Zellen zu fördern.

Als nächstes hacken Sie das Rückenmark und übertragen die Fragmente in ein Röhrchen mit frischem neuronalem Medium. Inkubieren Sie das Röhrchen zur Akklimatisierung in einem Shaker-Wasserbad. Nach der Inkubation das verbrauchte Medium entfernen und das Aufschlussmedium hinzufügen. Verdauungsenzyme spalten die Gewebematrix, um die Zellen aufzulockern.

Führen Sie die Verreibung durch, indem Sie die Gewebefragmente in die Pipette aspirieren und die Komponenten schnell entleeren, wodurch einzelne Zellen in Suspension freigesetzt werden. Übertragen Sie dann diese Suspension in ein Röhrchen, das das Dichtegradientenmedium und die Zentrifuge enthält.

Nach der Zentrifugation enthält die oberflächliche Schicht des Röhrchens Gewebereste. Die erste Schicht umfasst Oligodendrozyten und Astrozyten. Die zweite und dritte Schicht bestehen aus Neuronen, wobei die dritte Schicht die höchste Reinheit aufweist. Schließlich enthält das Pellet Mikrogliazellen.

Sammeln Sie die dritte Schicht in einem frischen Röhrchen und fügen Sie neuronales Medium hinzu, um das Dichtegradientenmedium zu verdünnen. Zentrifuge, um die Neuronen zu pelletieren. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Kügelchen in einem neurobasalen Medium, um die Neuronen für weitere Experimente zu konservieren.

Um diesen Vorgang zu starten, trennen Sie den Kopf der eingeschläferten Mäusebabys mit einer Schere. Stabilisieren Sie anschließend den Schwanz und die Arme auf dem Eingriffstisch mit der Rückenseite nach oben. Schneiden Sie dann die Haut mit der gebogenen Irisschere ab. Schneiden Sie danach das Rückenmark aus der Lendenwirbelsäule knapp über der Hüfte ab und schneiden Sie dann beide Seiten des Brustkorbs, um ihn vom Körper zu trennen.

Waschen Sie die Proben nacheinander in drei 10-Zentimeter-Petrischalen mit 5 Millilitern sterilisiertem PBS für jeweils 10 Sekunden, um überschüssiges Gewebe zu entfernen. Führen Sie anschließend eine 22-Gauge-Nadel und eine Spritze, die mit 5 Millilitern sterilisiertem PBS gefüllt sind, in das kaudale Ende der Wirbelsäule ein und spülen Sie sie kranial, so dass der Strang in eine vierte Petrischale austreten kann.

Übertragen Sie das Rückenmark in einem 15-Milliliter-Schlauch mit 5 Millilitern HABG auf Eis. Vermeiden Sie es, das Rückenmark zu quetschen und wiederholen Sie die Eingriffe für den Rest der Welpen. Im Idealfall sollte dieser Vorgang für eine Gruppe von Welpen nicht länger als 30 Minuten dauern, um eine gesunde Neuronenisolierung zu gewährleisten.

Um den Dichtegradienten vorzubereiten, bereiten Sie jede der vier Schichten in vier 15-Milliliter-Röhrchen vor. Geben Sie dann 1 Milliliter jeder Schicht in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen. Beginnen Sie mit Schicht 1 unten und fügen Sie sie nacheinander hinzu, bis Sie Schicht 4 oben erreichen. Vermeiden Sie es, die Schichten beim Hinzufügen zu stören und kräftige Bewegungen, die zu einer Vermischung führen könnten. Geben Sie anschließend das Verdauungsmedium in das gehackte Gewebe. Legen Sie die Probe in einen Shaker in das Wasserbad bei 30 Grad Celsius. Nehmen Sie anschließend das Gewebe aus dem Wasserbad und lassen Sie es einige Minuten einwirken.

Um die Verreibung durchzuführen, aspirieren Sie das überschüssige Aufschlussmedium. Suspendieren Sie das Gewebe in 2 Millilitern HABG. Mit einer Pipette mit schmaler Bohrung 10 Mal in 45 Sekunden trituieren und das Einbringen von Luft vermeiden, da dies die rentable Ausbeute erheblich verringert. Die Verreibung ist einer der kritischsten Schritte des Verfahrens. Das Gewebe sollte vorsichtig in die feuerpolierte Pipette eingezogen und aus ihr entleert werden, um übermäßige Vitalität zu vermeiden, die zum Absterben der Neuronen führen kann, oder zu schonend, was zu einer geringen Ausbeute führt.

Anschließend aspirierst du die oberen 2 Milliliter des Überstands und überträgst sie in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen mit der Bezeichnung "Sammlung". Wiederholen Sie den Entnahmevorgang noch zweimal, um 6 Milliliter Überstand zu erhalten. Übertragen Sie anschließend den Inhalt des Auffangrohrs langsam in das zuvor vorbereitete Gradientenröhrchen, um eine Unterbrechung des Gradienten zu vermeiden.

Um die Neuronen zu reinigen, zentrifugieren Sie das Gradientenröhrchen 15 Minuten lang bei 800 x g und 22 Grad Celsius. Sammeln Sie die gewünschten Schichten und übertragen Sie sie in eine neue 15-Milliliter-Tube. Für die höchste Reinheit der Neuronenisolierung sammeln Sie Schicht 3. Für mehr Ausbeute bei geringerer Reinheit sammeln Sie die Schichten 2 bis 3.

Als nächstes verdünnen Sie den Dichtegradienten, indem Sie den neu gesammelten Schichten 5 Milliliter HABG hinzufügen. Zentrifugieren Sie es bei 200 x g für 2 Minuten bei 22 Grad Celsius. Nach 2 Minuten wird der Überstand verworfen und die Zellen in 5 Millilitern HABG durch Schnippen des Pellets resuspendiert. Anschließend zentrifugieren Sie die Probe bei 200 x g für 2 Minuten bei 22 Grad Celsius erneut. Verwerfen Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 3 Millilitern neurobasalem Medium, indem Sie das Pellet schnippen.