Bead Loading zum Einbringen von Nukleinsäuren in adhärente kultivierte Zellen: Eine Technik zum Laden von fluoreszierenden Protein-kodierenden Plasmiden in adhärente Säugetierzellen

Beginnen Sie mit einer Kultur von anhaftenden Säugetierzellen in einer Kulturplatte. Übertragen Sie sterilisierte, alkalibehandelte, mikrometergroße Glasperlen in die Kammer einer kundenspezifischen Bead-Loader-Vorrichtung. Decken Sie die Kammeröffnung mit einem Netz mit Öffnungen in optimaler Größe ab, damit die Perlen während des Ladevorgangs passieren können. Sichern Sie das Netz mit einer Bildgebungskammer.

Entfernen Sie das Medium von der Platte. Pipettieren Sie eine Suspension von fluoreszierender Reporterprotein-kodierender Plasmid-DNA in die Platte, um sie gleichmäßig über die Zellen zu verteilen. Mit dem Bead-Loader-Gerät wird eine Monoschicht aus Glasperlen vorsichtig auf die Zellen verteilt. Klopfen Sie mit passender Kraft kurz auf die Kulturplatte.

Die Glaskügelchen rollen kurz auf die adhärenten Zellen, während sie durch die Alkalibehandlung weniger an den Zellen haften. Der Aufprall von Kollisionen zwischen Kügelchen und Zellen überträgt eine angemessene Spannung, die zu lokalisierten Störungen in den Zellmembranen führt. Diese gebildeten transienten Poren von kleinen Abmessungen erleichtern die Aufnahme von Plasmid-DNA in die Zellen und verhindern gleichzeitig das Eindringen großer Kügelchen.

Während der Erholungsphase verschließt sich die Zellmembran wieder, wodurch die Integrität der Membran wiederhergestellt und die Plasmid-DNA eingeschlossen wird. Geben Sie Medien auf die Platte und saugen Sie vorsichtig sichtbare schwimmende Perlen von der Platte ab. Inkubieren Sie die Platte.

Erfolgreich transfizierte Zellen, die Plasmid-DNA enthalten, exprimieren die fluoreszierenden Reporterproteine, die unter einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden können.

Entfernen Sie das Medium aus den Zellen und saugen Sie das gesamte Medium vorsichtig an den Rändern der Kammer an. Kippen Sie dann die Kammer in einem Winkel von etwa 45 Grad und entfernen Sie den restlichen Tropfen des Mediums aus der zentralen Mikrovertiefung. Pipettieren Sie die Bestückungslösung vorsichtig in die Mikrovertiefung des Glases in der Mitte der Kammer.

Verwenden Sie die Bead-Loading-Vorrichtung, um eine Monolage aus Glasperlen vorsichtig auf den Zellen zu dispergieren. Stellen Sie sicher, dass die Kügelchen die Zellen vollständig bedecken. Kneifen Sie die Kammer mit zwei Fingern zusammen. Heben Sie es etwa zwei Zentimeter an und bringen Sie es mit einer Kraft fest nach unten, die ungefähr dem Herunterfallen der Schüssel aus dieser Höhe entspricht.

Geben Sie das Medium vorsichtig zurück in die Kammer, indem Sie es langsam auf die Kunststoffseite der Kammer pipettieren. Aspirieren Sie alle schwebenden Kügelchen, ohne die Zellen zu stören. Die gesamte Beladung der Kügelchen sollte relativ schnell durchgeführt werden, damit die Zellen nicht austrocknen, wenn sie ohne Medium sind. Inkubieren Sie die Zellen dann für 0,5 bis 2 Stunden im Inkubator.