JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Biologische Techniken
0 Aufrufe • 3:31 Min. • July 8th, 2025
Die lasergestützte lentivirale Genverabreichung ist eine Technik, um ein Transgen in ein Wirtssystem zu übertragen.
Um transgene Mäuse herzustellen, beginnen Sie mit isolierten von Mäusen befruchteten Eiern in einem geeigneten Nährmedium. Stellen Sie die befruchtete Ei-haltige Kulturschale auf einen Mikroskoptisch, auf dem ein Lasergerät vorinstalliert und an eine Steuerungssoftware angeschlossen ist. Bei geeigneter Vergrößerung beobachten.
Befruchtete Eizellen sind von Zona pellucida umgeben, einer schützenden Glykoproteinschicht, die lentivirale Partikel abschließt. Um diese Barriere zu durchdringen, schalten Sie das Lasergerät ein und stellen Sie sicher, dass die Laser-LED über der Zona pellucida sichtbar ist. Zünden Sie den Laser mit der Steuerungssoftware ab. Passen Sie die Brenndauer an den gewünschten Perforationsdurchmesser an.
Lege die Eier zur Erholung in einen Inkubator. Nach kurzer Inkubation werden die Eier entnommen und Lentiviruspartikel hinzugefügt, die das Gen von Interesse und einen fluoreszierenden, selektierbaren Marker tragen.
Wenn die Zona pellucida perforiert ist, diffundiert das Lentivirus leicht zur Eizellmembran und gelangt über die Endozytose in die Eizellmembran. Das Lentivirus zerlegt sich und setzt seine RNA frei, die bei der sequentiellen Verarbeitung zu einer doppelsträngigen DNA in den Wirtskern gelangt und die fremden Gene in das Wirtsgenom integriert.
Brüte die Eier aus und lass sie sich zu Blastozysten entwickeln. Implantieren Sie die Blastozysten in verpaarte weibliche Mäuse. Sobald die Trächtigkeit abgeschlossen ist, bergen Sie die Jungtiere und analysieren Sie sie auf das Vorhandensein von Transgenen.
Während sich die Eizellen im Inkubator befinden, richten Sie den XYClone Laser gemäß den Empfehlungen des Herstellers ein und kalibrieren Sie ihn. Wenn die Eier fertig sind, legen Sie die erste Tropfplatte auf den Lasermikroskoptisch und fokussieren Sie die Zona pellucida manuell. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass das Laser-LED-Licht durch das Objektiv sichtbar ist, bewegen Sie den Mikroskoptisch so, dass er mit dem LED-Laser auf die Zone zielt, und stellen Sie den XYClone-Laser mit der Computersoftware auf 250 Mikrosekunden ein.
Stellen Sie die LED-Lichtgröße auf die entsprechenden Abmessungen ein und perforieren Sie die Zona pellucida jedes Eies dreimal mit dem Laser, um drei 10-Mikrometer-Löcher zu erzeugen.
Es ist wichtig, die Perforation schnell, aber vorsichtig durchzuführen, da die befruchteten Eizellen nicht länger als 15 Minuten außerhalb des Inkubators bleiben können.
Legen Sie dann die perforierten Eier für weitere zwei Stunden in den Brutkasten zurück. Behandeln Sie am Ende der zweiten Inkubation den 50-Mikroliter-KSOM-Tropfen mit 2 Mikrolitern konzentriertem Lentivirus ohne Vermischung und geben Sie die Eier für vier Tage in den Inkubator zurück. Wenn sich die Eizellen zu Blastozysten entwickelt haben, verwenden Sie ein nicht-chirurgisches Embryotransfergerät, um etwa 10 bis 15 Embryonen in und etwa 2 Mikroliter KSOM zu deponieren.
Lassen Sie die trächtige Maus 17 Tage nach dem Embryotransfer auf natürlichem Wege gebären, oder entnehmen Sie die Neugeborenen bei Bedarf per Kaiserschnitt.