Biolistisch-vermittelter Gentransfer: Eine Technik zur Verabreichung von Genen von Interesse in Zielzellen über eine biolistische Genkanone

Beginnen Sie mit einem optimalen Volumen an Goldkügelchen - biologisch inerten und ungiftigen Gentransportvehikeln - in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie dann kationische Wirkstoffe - Spermidin und Calciumchlorid - hinzu, gefolgt von den gewünschten DNA-Fragmenten zu den Goldkügelchen. Bewegen Sie das Röhrchen vorsichtig und inkubieren Sie.

Calciumchlorid bindet an die DNA-Fragmente und erleichtert deren Beschichtung über Goldkügelchen über Spermidinreste. Als nächstes zentrifugieren und das Lösungsmittel entfernen. Suspendieren Sie die DNA-beschichteten Kügelchen in Ethanol. Pipettieren Sie die Kügelchen vorsichtig auf einer sterilen Makroträgerscheibe. Trocknen lassen.

Richten Sie eine biolistische Genkanone ein, die aus einer Heliumgasbeschleunigungsröhre und einer Beschusskammer mit einer Berstscheibe und einem Stoppschirm in ihren jeweiligen Schlitzen besteht. Als nächstes kehren Sie die Makroträgerscheibe um und laden sie unterhalb der Berstscheibe.

Danach werden die kultivierten Zielwirtszellen in ein geeignetes festes Medium gelegt, das mit Sorbit - einem osmotischen Stabilisator zur Verbesserung der Transformationseffizienz - versetzt wird. Sobald das Setup fertig ist, feuern Sie die Genkanone ab.

Während Helium durch das Beschleunigungsrohr fließt, baut sich der Druck weiter auf, bis die Berstscheibe bricht und Helium-Schockwellen erzeugt. Diese Stoßwellen treiben die Makroträgerscheibe, die die Goldperlen trägt, in Richtung des Stoppschirms, der nur die Goldperlen passieren lässt.

Die beschleunigten Goldkügelchen dringen in den Zellkern der Wirtszelle ein und integrieren die gewünschte DNA in das Genom der Wirtszelle.

Beginnen Sie damit, orangefarbene Makrocarrier-Biolistic-Scheiben mit einer Pinzette in 100%iges Ethanol zu tauchen, dann übertragen Sie die Scheiben in eine große Petrischale mit Drierit, wobei Sie darauf achten müssen, dass die Scheiben das Trockenmittel nicht berühren. Nach dem Trocknen drücken Sie die Scheiben in mit Ethanol abgewischte Silberscheibenhalter, dann wirbeln Sie ein Röhrchen mit Goldperlen vor und aliquotieren Sie 12 Mikroliter der Bead-Lösung in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen pro Transformation.

Als nächstes fügen Sie nacheinander 2 Mikrogramm DNA, 10 Mikroliter Calciumchlorid und zwei Mikroliter spermidinfreie Base in jedes Röhrchen mit Kügelchen hinzu. Wirbeln Sie dann jede Probe vor und inkubieren Sie die Röhrchen 5 Minuten lang bei Umgebungstemperatur, mit gelegentlichem leichtem Schnippen, um die abgesetzten Kügelchen wieder zu suspendieren.

Am Ende der Inkubation pelletieren Sie die DNA-beschichteten Goldkügelchen und aspirieren den Überstand vorsichtig. Suspendieren Sie die Kügelchen langsam vollständig in 600 Mikrolitern 100% Ethanol, dann pelletieren Sie die Zellen erneut, diesmal resuspendieren Sie die Kügelchen in 8 Mikrolitern Ethanol.

Geben Sie nun jede Tube der Kügelchen in Kreisen mit einem Durchmesser von 1 Zentimeter auf die Mitte einer einzelnen biolistischen Scheibe. Wenn eine ausreichende Konzentration von Kügelchen vorhanden ist, ist in der Mitte jeder Scheibe ein goldener Kreis sichtbar, sobald die Kügelchen trocken sind.

Um die Genkanone zu betätigen, schalten Sie zuerst die Vakuumpumpe ein und drehen Sie dann den Heliumtankknopf gegen den Uhrzeigersinn, bis ein Druck von ca. 2200 PSI am Manometer erreicht ist. Legen Sie als Nächstes den linken roten Schalter um, um die Genkanone einzuschalten, und stellen Sie die Durchflussraten für das Vakuum und die Entlüftung so ein, dass das Vakuum innerhalb von 15 Sekunden 28 Zoll Quecksilber erreicht. Vergewissern Sie sich, dass der Abstand zwischen der Berstscheibe und dem Makroträger zu diesem Zeitpunkt ebenfalls etwa 3/8 Zoll beträgt.

Wenn alles in Position ist, wischen Sie die gesamte Kammer mit 70 % Ethanol ab und tauchen Sie die Berstscheiben in 100 % Ethanol. Nachdem Sie die Scheiben auf einer sterilen Oberfläche getrocknet haben, lösen Sie den Berstscheibenhalter mit einem Drehmomentschlüssel und setzen Sie eine saubere Scheibe ein. Schrauben Sie den Berstscheibenhalter wieder fest und drehen Sie ihn mit dem Drehmomentschlüssel einmal nach rechts, um ihn festzuziehen.

Tauchen Sie anschließend die Siebe in 100 % Ethanol. Setzen Sie nach dem Trocknen ein Sieb auf die weiße Kunststoff-Montageplatte und setzen Sie den Macrocarrier-Disc-Halter mit der DNA-Seite nach unten in die Disc-Kammer ein. Schrauben Sie die silberne Kappe auf und setzen Sie die Montageplatte in den höchsten Schlitz ein, dann setzen Sie eine YPD-Agarplatte mit 1 molaren Sorbit auf die Bodenplatte.

Schließen Sie nun die Kammertür und verriegeln Sie sie, dann drücken und halten Sie den mittleren roten Schalter in der oberen Position, um das Vakuum einzuschalten und es auf 28 Zoll Quecksilbersäule zu bringen. Sobald das richtige Vakuumniveau erreicht ist und der mittlere Schalter in die untere Position gebracht wurde, halten Sie den rechten roten Schalter gedrückt, um zu feuern.

Wenn die Berstscheibe platzt, lassen Sie sofort den Feuerknopf los und drücken Sie den mittleren roten Schalter in die mittlere Position, um die Kammer auf 0 PSI zu entlüften. War der Schuss erfolgreich, ist ein goldener Ring auf der Platte zu sehen. Reinigen Sie die Berstscheibe und den Schmutz der Makroträgerscheibe, schalten Sie die Genpistole aus, drehen Sie dann den Heliumtankknopf im Uhrzeigersinn, um das Gas auszuschalten und die Vakuumpumpe auszuschalten.