JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Biologische Techniken
0 Aufrufe • 4:33 Min. • July 8th, 2025
Während der Krebsmetastasierung wandern Tumorzellen aus einem Primärtumor durch das Kreislaufsystem, extravasieren in entfernte Organe und etablieren Sekundärtumoren.
Um die Lungenmetastasierung in einem Brustkrebs-Mausmodell zu bewerten, dem 4T1-Zellen, hochmetastasierende Brustkrebszellen, injiziert wurden, wird eine Zellsuspension hergestellt, die 4T1-Zellen enthält, die aus der entnommenen Lunge isoliert wurden. Zentrifugieren Sie die Suspension und resuspendieren Sie die Zellen in Medien, die 6-Thioguanin, 6-TG - ein Guanin-Analogon - enthalten. Die Zellsuspension in einer Kulturplatte aussäen.
6TG gelangt in normale Zellen, wo es durch ein spezifisches Transferase-Enzym in 6-TG-Nukleotid, ein toxisches Nukleotid, umgewandelt wird. Diese zytotoxischen Nukleotide werden in die DNA eingebaut, verursachen DNA-Schäden und eliminieren selektiv Zellen aus der Kultur. 4T1-Zellen haben eine verminderte Fähigkeit, toxische Nukleotide zu bilden, was ihr Überleben und ihre Adhärenz an der Platte erleichtert. Abhängig von der Proliferationsfähigkeit der Zellen bilden sie Kolonien.
Behandeln Sie die Zellen mit Methanol. Methanol permeabilisiert die Zellen und denaturiert die zellulären Proteine. Inkubieren Sie die Zellen mit Methylenblau.
Der positiv geladene Farbstoff dringt in die Zelle ein, interagiert mit der negativ geladenen DNA und interkaliert in Zwischenräume zwischen den benachbarten Basenpaaren der DNA-Stränge. Es bindet auch an RNA im Zytoplasma, jedoch mit geringerer Affinität. Die Zellkerne färben sich aufgrund der hohen DNA-Konzentration dunkelblauer als das Zytoplasma aufgrund der niedrigen RNA-Konzentration. Metastasierende Kolonien erscheinen als blaue Punkte.
Stellen Sie sich die Platte vor. Verwenden Sie eine Software, um die metastasierenden Kolonien zu bestimmen und die metastatische Belastung in der Lunge der Maus zu quantifizieren.
Bringen Sie das Volumen der Tube mit 1X HBSS auf bis zu 10 Milliliter. Gießen Sie dann den Inhalt über ein 70-Mikrometer-Zellensieb in das konische 50-Milliliter-Röhrchen. Verwenden Sie den Kolben einer 1-Milliliter-Spritze, um die Probe vorsichtig durch das Sieb zu mahlen.
Das Röhrchen wird 5 Minuten lang bei 350 mal g zentrifugiert und der Überstand wird verworfen. Waschen Sie das Pellet dann zweimal mit 10 Millilitern 1X HBSS. Resuspendieren Sie das Pellet in 10 Millilitern 60 Mikromolaren 6-Thioguanin-Komplettkulturmedien und plattieren Sie die Proben in den 10-Zentimeter-Zellkulturplatten unter Verwendung eines Verdünnungsschemas, falls gewünscht.
Inkubieren Sie die Platten 5 Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Gießen Sie Nährmedien von den Platten in den entsprechenden Abfallbehälter. Um die Zellen zu fixieren, geben Sie 5 Milliliter unverdünntes Methanol auf jede Platte und inkubieren Sie es 5 Minuten lang bei Raumtemperatur, wobei Sie darauf achten, das Methanol so zu schwenken, dass es die gesamte Platte bedeckt.
Gießen Sie das Methanol von den Platten in den entsprechenden Abfallbehälter und spülen Sie dann jede Platte mit 5 Millilitern destilliertem Wasser aus. Fügen Sie 5 Milliliter 0,03 % Methylenblau pro Platte hinzu und inkubieren Sie es 5 Minuten lang bei Raumtemperatur, wobei Sie darauf achten, die Methylenblaulösung so zu schwenken, dass sie die gesamte Platte bedeckt. Gießen Sie das Methylenblau in den entsprechenden Abfallbehälter und spülen Sie jede Platte erneut mit 5 Millilitern destilliertem Wasser aus.
Drehen Sie den Teller auf den Kopf und tupfen Sie ihn gegen ein Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Lege den Teller auf den Deckel und lass ihn über Nacht an der Luft trocknen. Metastasierende Kolonien sind blau. Nach dem Trocknen können die Platten unbegrenzt bei Raumtemperatur gelagert werden.