Giemsa-Färbung für den Koloniebildungsassay: Ein In-vitro-Färbeverfahren zur Beurteilung der proliferativen Fähigkeit mesenchymaler Stammzellen

Assays zur Koloniebildung messen die proliferative Fähigkeit von Zellen, zu Kolonien heranzuwachsen.

Zuerst wird aus dem Knochenmark gewonnene Zellsuspension aus Samenknochenmark, die Erythrozyten und mononukleäre Zellen, einschließlich mesenchymaler Stammzellen oder MSCs, umfasst, in Medien auf einer Kulturplatte inkubiert und inkubiert. MSCs haften am Plattenboden, während Erythrozyten und mononukleäre Zellen in Suspension bleiben und verworfen werden.

Fügen Sie frische Medien hinzu, die Wachstumsfaktoren enthalten, um das Überleben von MSC zu unterstützen. Abhängig von ihrem individuellen proliferativen Potenzial vermehren sich MSCs zu Kolonien.

Behandeln Sie anschließend die Völker mit Methanol. Methanol permeabilisiert die Zellen, verdrängt Wasser aus der intrazellulären Umgebung und denaturiert Proteine, wodurch die Zellarchitektur erhalten bleibt.

Inkubieren Sie die fixierten Kolonien mit Giemsa-Färbelösung - einer Mischung aus Oxidationsprodukten von Methylenblau, hauptsächlich Azurblau B, einem basischen Farbstoff, und Eosin Y, einem sauren Farbstoff. Bei der Diffusion in die Zellen binden positiv geladene Azur-B-Dimere durch Interkalation an negativ geladene DNA im Zellkern und verleihen ihr eine blaue Färbung.

Negativ geladene Eosin-Y-Monomere interagieren dann mit unneutralisierten positiven Ladungen auf gebundenen azurblauen B-Dimeren und bilden einen "Eosin-Y-azur-B-Komplex", der die Färbung der bläulich gefärbten DNA in violett verändert.

Im ribosomenreichen Zytoplasma bindet Azurblau B an negativ geladene RNA, aber die verminderte Penetration von Eosin Y in hochdichte Ribosomen verhindert die Bildung des Eosin-Y-azur-B-Komplexes und färbt die RNA blau.

Waschen Sie nun die Platte mit Puffer, um überschüssige Flecken zu entfernen, und trocknen Sie sie an der Luft. Zählen Sie die Anzahl der Kolonien, die als Zellcluster mit violetten Kernen und blauem Zytoplasma erscheinen.

Zur Durchführung des KBE-Assays werden 10 Milliliter Giemsa-Lösung pro Schale hergestellt, indem die Stammlösung mit sterilem Wasser 1 bis 10 verdünnt wird. Nehmen Sie das Medium aus der Zellkulturschale und verwenden Sie PBS, um die Zellen vorsichtig zu waschen.

Mit reinem Methanol die Zellen 5 Minuten lang bei Raumtemperatur fixieren, dann das Methanol verwerfen und die Giemsa-Lösung hinzufügen. In einer befeuchteten Kammer bei 37 Grad Celsius 60 Minuten inkubieren. Verwenden Sie nach der Inkubation PBS, um die Zellen zweimal zu waschen. Trocknen Sie dann den Teller mit dem Kopf voran auf einem Papiertuch an der Luft. Zählen Sie mit einem Marker auf der Rückseite der Platte die Völker manuell.