Name: Ein Matrigel-Based Rohr Formation Assay zur vaskulären Aktivität von Tumorzellen Beurteilen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min
Description: Lernen Sie ein Tube-Formation-Assay auf Matrigel zur Bewertung der vaskulären Aktivität von Tumorzellen in vitro. Diese Methode ermöglicht quantitative Einblicke in die Angiogenese-Potenziale verschiedener Krebszelllinien.

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Diese Arbeit wurde vom NCI R01 CA120659 (RS) unterstützt.

1. Ein Matrigel-Based Rohr Formation Assay zur vaskulären Aktivität von Tumorzellen Beurteilen <ol><li> Vorbereitung der Tumorzellen und mikrovaskulären Endothelzellen: Hirntumor-Zellen wie U87-Zellen, Melanomzellen B16F1, Brustkrebs MDA-MB-435, und die Zellen des Darms HCT116 wurden in DMEM ergänzt mit 10% FBS und Penicillin / Streptomycin (alle von Invitrogen ). Endothelial Zelllinie humanen mikrovaskulären Endothelzellen (HMVECs) wurden in EBM2 Medium (Lonza) mit 1 pg / ml Hydrocortison und 1 ng / ml epidermal growth factor, 10% FBS und Penicillin / Streptomycin kultiviert. Die Zellen wurden mit PBS dreimal gewaschen und getrennt mit 0,05% Trypsin / EDTA (Invitrogen). Nach Zentrifugation mit 2.000 rpm für 5 min wurden Zellpellets erneut mit PBS gewaschen. Dann wurden die pelletierten Zellen mit einer Zählkammer gezählt. </li><li> Matrigel Zubereitung: Ein Aliquot von Wachstumsfaktor-reduzierten Matrigel (BD Bioscience) bis bei Raumtemperatur erwärmt. Bevor vollständig aufgetaut war es auf Eis überführt und seine Flüssigkeit wurde auf Eis für mindestens 10 min gehalten. Dann wurden 50 ul der Matrigel wurde 96-Well-Platten auf horizontaler Ebene, dass die Matrigel gleichmäßig zu verteilen ermöglicht ausplattiert und inkubiert für 30 min bei 37 ° C. </li><li> Rohr Bildung: Cells (1-2 x 10 4) wurden mit serumfreiem DMEM für Tumorzellen oder EBM-2 für Endothelzellen resuspendiert und lud auf der Oberseite des Matrigel. Wenn dieser Test zur Messung der Wirkung von einigen Agenten auf Tubulus Entwicklung verwendet wurde, wurden diese Mittel (Stimulatoren oder Inhibitoren), die Serum-freiem Medium aufgenommen. Jede bedingte Gruppe enthalten 4-6 Brunnen. </li><li> Bild-und Daten-Analyse: Nach der Inkubation bei 37 ° C über Nacht, wurde jede Vertiefung direkt unter dem Mikroskop analysiert. Wenn Tubuli zur Fixierung benötigt wurden, wurden 100 ul 10% igem Formalin Kochsalzlösung-basierte Lösung vorsichtig hinzugefügt und zehn Minuten später war es soweit für die Analyse. Unter einem Mikroskop mit 10x Phasenkontrast, wurden Tubuli in jedes Feld abgebildet und einem Durchschnitt von Tubuli 3 bis 5 zufälligen Feldern in jeder Vertiefung wurde gezählt. </li></ol> 2. Repräsentative Ergebnisse: HMVECs wurden als positive Kontrolle verwendet, da diese Röhren aus klarem längliche Zellkörper, die Polygon-Netzwerk zu bilden verbinden entwickelt wurden. B16F1, U87 und MDA-MB-435 Zellen entwickelt vaskulären Tubuli ähnlich denen von HMVECs gebildet, aber HCT116 Zellen nicht (Abbildung 1). Eine Zelle dosisabhängig tube formation wurde in U87-Zellen getestet. Wie in Abbildung 2 gezeigt, gebildet 10.000 Zellen abgesetzt Tubuli. Sobald die Zellen wurden verdoppelt, war eine solide Gefäßnetz vergleichbar mit denen in HMVECs gesehen. Im Gegensatz dazu konnte Zellen weniger als 5.000 bis eine vaskuläre Phänotyp zu bilden. <img src="/files/ftp_upload/3040/3040fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Rohr-Bildung durch HMVECs, U87, MDA-MB-435 und B16F1 Zellen induziert, aber nicht HCT116-Zellen. Alle Zellen (2 x 10 4) wurden auf Matrigel geladen und über Nacht inkubiert. Tubuli wurden aufgenommen mit Phasenkontrast. HMVECs wurden als positive Kontrolle verwendet. Ein Vertreter von 3-5 Felder zu sehen war. Bar: 100 um. <img src="/files/ftp_upload/3040/3040fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. U87-Zell-induzierte Tubuli in einer Zellzahl-abhängigen Weise. Verschiedene Zahlen von U87-Zellen als in den Ecken angegeben wurden tube formation verwendet. HMVECs wurden für eine positive Kontrolle verwendet. Bar: 100 mm.

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<li>Sood, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+significance+of+tumor+cell-lined+vasculature+in+ovarian+carcinoma%3A+implications+for+anti-vasculogenic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biology+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">The clinical significance of tumor cell-lined vasculature in ovarian carcinoma: implications for anti-vasculogenic therapy.</a> Cancer Biology & Therapy. 1, 661-664 (2002).</li>
<li>Shirakawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamics+in+vasculogenic+mimicry+and+angiogenesis+of+inflammatory+breast+cancer+xenograft%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Hemodynamics in vasculogenic mimicry and angiogenesis of inflammatory breast cancer xenograft.</a> Cancer Research. 62, 560-566 (2002).</li>
<li>Ruf, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+role+of+tissue+factor+pathway+inhibitors+1+and+2+in+melanoma+vasculogenic+mimicry%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Differential role of tissue factor pathway inhibitors 1 and 2 in melanoma vasculogenic mimicry.</a> Cancer Research. 63, 5381-5389 (2003).</li>
<li>Seftor, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+interactions+of+laminin+5+gamma2+chain%2C+matrix+metalloproteinase-2%2C+and+membrane+type-1-matrix%2Fmetalloproteinase+are+required+for+mimicry+of+embryonic+vasculogenesis+by+aggressive+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Cooperative interactions of laminin 5 gamma2 chain, matrix metalloproteinase-2, and membrane type-1-matrix/metalloproteinase are required for mimicry of embryonic vasculogenesis by aggressive melanoma.</a> Cancer Research. 61, 6322-6327 (2001).</li>
<li>Shirakawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculogenic+mimicry+and+pseudo-comedo+formation+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Vasculogenic mimicry and pseudo-comedo formation in breast cancer.</a> International Journal of Cancer. 99, 821-828 (2002).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Um für diesen Test erfolgreich zu sein, sollte die Qualität der Matrigel zuerst getestet werden. Eine kleine Probe von BD Bioscience erhalten werden, um Vorlauf der Test unter Verwendung von HMVECs. Verschiedene Produkte können Batch-Display ungleichen Qualitäten, in denen einige viel nicht bieten eine optimale Voraussetzung für tube formation. Zweitens sollten alle Blasen vermieden werden, wenn ein Aliquot von Matrigel in 96-Well-Platten geladen werden, da Blasen Tubulus Bildung stören können. Wenn kleine Bläschen in e...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16000-044 </td></tr><tr><td> Growth factor-reduziert Matrigel </td><td> BD Bioscience </td><td> 47743-720 </td></tr><tr><td> EBM2 kit </td><td> Lonza </td><td> CC-3156 </td></tr><tr><td> Nikon ECLIPSE TS100 Mikroskop </td><td> Nikon </td><td></td></tr></tbody></table>

ein matrigel-based rohr formation assay zur vaskulären aktivität von tumorzellen beurteilen

A Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of Tumor Cells

Im Laufe der letzten Jahrzehnte, mit einem Rohr-Assay growth factor-reduzierten Matrigel wurde in der Regel eingesetzt, um die angiogene Aktivität des vaskulären endothelialen Zellen in vitro 1-5 demonstrieren. Allerdings hat vor kurzem immer mehr Belege dafür ergeben, dass dieser Test nicht beschränkt auf vaskuläre Verhalten für Endothelzellen zu testen. Stattdessen hat sie auch benutzt worden, um die Fähigkeit einer Reihe von Tumorzellen zu einer vaskulären Phänotyp 6-8 Entwicklung zu testen. Diese Fähigkeit wurde in Übereinstimmung mit ihren vaskulogene Verhalten in xenotransplantierten Tiere, ein Verfahren, wie vaskulogene Mimikry (VM) 9 bekannt sind, identifiziert. Es gibt eine Vielzahl von Nachweisen dafür, dass Tumor-Zell-vermittelten VM spielt eine wichtige Rolle bei der Tumorentwicklung, unabhängig von Endothelzellen Angiogenese 6, 10-13. So wurden zum Beispiel Tumorzellen im Blut durchströmt, vaskuläre Kanalbildung in Gewebeproben aus Melanomen und Glioblastom-Patienten 8, 10, 11 zu beteiligen. Hier haben wir beschrieben, diese röhrenförmigen Netz-Assay als ein nützliches Instrument bei der Auswertung von vaskulären Aktivität von Tumorzellen. Wir fanden, dass einige Tumorzelllinien wie Melanom B16F1 Zellen, Glioblastom U87-Zellen, und Brustkrebs MDA-MB-435 Zellen in der Lage, vaskuläre Tubuli bilden; einige aber auch nicht wie Darmkrebs HCT116-Zellen. Darüber hinaus ist dieses vaskulären Phänotyp abhängig Zellzahlen auf dem Matrigel beschichtet. Daher kann dieser Test als leistungsstarkes Dienstprogramm für die vaskuläre Potenzial einer Vielzahl von Zelltypen einschließlich vaskulärer Zellen, Tumorzellen sowie anderen Zellen Bildschirm dienen.

Ein Rohr-Assay wird verwendet, um vaskuläre Aktivität von Tumorzellen zu bewerten.

Ein Matrigel-Based Rohr Formation Assay zur vaskulären Aktivität von Tumorzellen Beurteilen

In den letzten Jahrzehnten wurde typischerweise ein Tubulusbildungs-Assay unter Verwendung von wachstumsfaktorreduziertem Matrigel eingesetzt, um die angiogene ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Röhrenbildung verschiedener Tumorzelltypen in vitro zu messen, um so die vaskuläre Aktivität in vivo einzuschätzen. Dies wird erreicht, indem Tumorzellen auf Matrigel gegeben werden, um die Röhrenbildung zu induzieren. Als zweiter Schritt.Zellen auf Matri-Gel werden über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert, wodurch die Tubusbildung ermöglicht wird. Anschließend werden die von jedem Zelltyp gebildeten Tubuli abgebildet. Um die durchschnittliche Anzahl der von jedem Zelltyp gebildeten Tubuli zu quantifizieren, werden Ergebnisse ermittelt, die die potenzielle Fähigkeit dieser Zellen widerspiegeln, basierend auf Xenotransplantat-Tumormodellen in vivo eine Gefäßbildung durchzuführen.Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Krebsforschung zu beantworten, beispielsweise wie man die vaskuläre Aktivität in vitro misst. Um Tumorzellen vorzubereiten, kultivieren Sie zunächst UAD sieben Melanom-, B 16 F1-, MDA-MB 435- oder Kolon-HCT 116-Zellen in DMEM, ergänzt mit 10 % FPS und Penicillin. Humanen mikrovaskulären endothelialen Zellen oder H ECS kultivieren Sie in EBM-2-Medium, ergänzt mit einem Mikrogramm pro Milliliter Hydrocortison, einem Nanogramm pro Milliliter epidermalem Wachstumsfaktor, 10 % FBS und Penicillin.Behandeln Sie die Zellen mit Streptomycin, waschen Sie sie mit PBS und lösen Sie sie dann mit 0,05 % Trypsin-EDTA ab. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 2000 RRP M. Waschen Sie sie anschließend erneut mit PBS. Zählen Sie die Zellen mithilfe eines Hämozytometers, um das Matrigel warm vorzubereiten.Lösen Sie ein Milliliter Wachstumsfaktor-reduziertes Matrigel auf Raumtemperatur. Stellen Sie es anschließend unverzüglich für 10 Minuten auf Eis. Pipettieren Sie 50 Mikroliter in die Vertiefungen einer 96-Loch-Platte.Und die Platte 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren, ein bis zwei mal 10 hoch 5 Tumorzellen oder endotheliale Zellen in DMEM bzw. eBM2 resuspendieren und sie auf die Oberfläche des Matrigels auftragen. Wenn die Auswirkungen von Reagenzien auf die Tubulusentwicklung untersucht werden, das Reagenz dem serumfreien Medium zufügen und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Zur Bildanalyse 10 µl einer 10 %igen Formalin-Lösung in Kochsalzlösung 10 Minuten lang zugeben.Danach mit einem Phasenkontrastmikroskop unter einem 10×-Objektiv abbilden. Zählen Sie die Anzahl der Tubuli in drei bis fünf zufälligen Feldern aus jedem. Berechnen Sie anschließend hier den Durchschnitt.HMCs wurden als positiver Kontrollwert verwendet, da diese Tubuli aus klaren, langgestreckten Zellkörpern hervorgingen, die sich zur Bildung eines polygonen Netzwerks verbanden. B16F1-, U87- und MDA-MB-435-Zellen bildeten vaskuläre Tubuli, die denen ähnelten, die von HEcs gebildet wurden. HCT-116-Zellen hingegen taten dies nicht.Die abhängige Gefäßröhrenbildung in Abhängigkeit von der Zellzahl wurde in U 87-Zellen getestet. Wie in dieser Abbildung gezeigt, bildeten 10.000 Zellen diskontinuierliche Röhren, sobald sich die Zellen verdoppelt hatten. Ein solides vaskuläres Netzwerk war vergleichbar mit dem in H ecs beobachteten.Im Gegensatz dazu gelang es bei der Inokulation mit weniger als 5.000 Zellen nicht, ein vaskuläres Phänotyp zu bilden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen Matrigel-Röhrenassay erfolgreich einrichtet, um die Röhrenbildung von Krebszellen in vitro zu messen.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Das Rohr-Assay ist eine schnelle, quantifizierbare Verfahren zum Messen in vitro Angiogenese. Endothelzellen werden mit konditioniertem Medium kombiniert und Basalmembran-Extrakt ausgestrichen. Schlauchbildung erfolgt innerhalb von Stunden und neu gebildeten Tubuli leicht quantifizieren.

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