Aufbau des HIV-1 Capsid Assemblies durch Kryo-Elektronenmikroskopie und Iterative Helical Real-Raum Wiederaufbau

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Methode zur Verfügung zu stellen, mit der eine dreidimensionale Struktur von heli-assemblierten Molekülen mittels Kryo-Elektronenmikroskopie erhalten werden kann. Das Protokoll beginnt mit der Vorbereitung von Kryo-EM-Proben unter Verwendung einer Schnellverdünnungs- und Rückseiten-Blotting-Methode, um die Salzkonzentration bei der Vorbereitung des gefrorenen hydratisierten EM-Gitters vorübergehend zu reduzieren. Dieser Prozess gewährleistet die Stabilität des Proteins, reduziert das Hintergrundrauschen und verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis während der Kryo-EM-Datenerfassung mit niedriger Dosis, die auf die Datenerfassung folgt.

Die helikale Indizierung der Beugungsmuster ist abgeschlossen. Anschließend wird die Bildverarbeitung durchgeführt, gefolgt von einer 3D-Rekonstruktion im realen Raum, was zu der endgültigen Dichtekarte des HIV-Eins-Kapsids oder der Ca-Röhre führt. Im Allgemeinen werden Einzelpersonen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da es mehrere kritische Punkte für eine optimale Datenerfassung und -analyse gibt.

Im Fall von HIV beispielsweise besteht ein Kapsid aus röhrenförmigen Anordnungen, die sich nur in einer molaren Ausgangslösung bilden und die Salzkonzentration schnell reduzieren, ohne die Struktur zu beeinträchtigen. Es ist wichtig, qualitativ hochwertige Kryo-EM-Bilder zu erhalten. Anhand eines Röhrenbildes ist es sehr schwierig zu lernen, was zu tun ist, um eine kritische Röhre zu indizieren, und welche Software für die 3D-Rekonstruktion in Betracht gezogen werden könnte.

Dieses Video bietet einen detaillierten und unkomplizierten Ansatz zur Erstellung einer 3D-Rekonstruktion physischer Objekte und kann als Referenz für Ihr Experiment verwendet werden. Ich werde das Verfahren mit Dr. Puja demonstrieren. Wir sind beide Postdocs von Dr.Laboratory Um die HIV-Ein-Kapsid-Protein-Anordnungen für Kryo vorzubereiten, beginnen sie mit dem Glühen, wobei die Kohlenstoffseite von 200-Mesh-Kupfergittern für 25 Milliampere für 25 Sekunden entladen wird.

Verwenden Sie einen Vernebler, um die Luftfeuchtigkeit in der Klimakammer auf 80 % zu bringen, bei der es sich um einen selbstgebauten manuellen Schwerkraftkolben handelt. In der Zwischenzeit kühlen Sie flüssiges Ethan in einem vitro-Bott-Kolben mit flüssigem Stickstoff ab und montieren Sie den Tauch-Gefrier-Doer auf den manuellen Schwerkraftkolben. Als nächstes klemmst du die Zange mit einer Pinzette geschlossen an den Gitterrand.

Tragen Sie 2,5 Mikroliter einer vormontierten Proteinlösung auf die Kohlenstoffseite des Gitters auf. Laden Sie dann die Pinzette mit der Carbonseite des Gitters nach oben auf den Kolben. Geben Sie drei Mikroliter Puffer mit niedrigem Salzverdünnungsgrad auf die Rückseite des Gitters.

Tupfen Sie den Rost sofort mit einem Stück Filterpapier auf der gleichen Seite ab. Halten Sie die gesamte Rückseite des Gitters etwa sechs Sekunden lang in engem Kontakt mit dem Filterpapier. Tauchen Sie das Gitter nach dem Entfernen des Filterpapiers sofort in flüssiges Ethan.

Entfernen Sie zum Schluss die Pinzette aus dem Kolben und überführen Sie das Gitter schnell in eine Gitterspeicherbox. Beginnen Sie mit der Kryo-Elektronenmikroskopie, indem Sie das gefrorene hydratisierte Gitter in ein FEI Polar G Zwei-Elektronen-Mikroskop laden. Er arbeitet mit 200 Kilovolt und ist mit einer gatin 4K x 4K CCD-Kamera ausgestattet.

Im Suchmodus mit niedriger Dosis fügen Sie eine Vergrößerung von ca. 200x hinzu. Durchsuchen Sie das gesamte Raster nach Bereichen mit geeignetem Eis. Speichern Sie die Positionen dieser Bereiche in einer Staging-Datei.

Rufen Sie die gespeicherten Positionen auf und screenen Sie diese Bereiche weiter. Fügen Sie eine 3.900-fache Vergrößerung im Suchmodus mit niedriger Dosis hinzu. Wählen Sie für die Datenerfassung die Bereiche mit gleichmäßiger dünner Eisschicht aus, die sich dadurch auszeichnen, dass sie lange Röhren enthalten, die über einem Loch hängen.

Speichern Sie alle Bereiche in einer Datei der zweiten Phase. Wechseln Sie in den Belichtungsmodus. Fügen Sie eine 59.000-fache Vergrößerung hinzu und setzen Sie eine 100-Mikrometer-Objektivblende ein.

Passen Sie dann den objektiven Stigmatismus und die Strahlintensität für eine Dosis von etwa 15 Elektronen pro Angström zum Quadrat pro Exposition an. Kehren Sie in den Suchmodus für niedrige Dosen zurück und bewegen Sie sich in eine gespeicherte Position. Identifizieren und zentrieren Sie ein gutes Rohr.

Stellen Sie mit dem Schalter der CCD-Kamera in den Fokusmodus den Fokus ein und stellen Sie einen Unschärfewert ein, der normalerweise zwischen 0,5 und 2,5 Mikrometern liegt. Wechseln Sie dann in den Belichtungsmodus und stellen Sie eine Belichtungszeit von 0,3 bis 0,5 Sekunden für eine Dosis von 15 Elektronen pro Angström zum Quadrat ein. Sammeln Sie die Bilder auf einer Plattenkamera, und lassen Sie die Filme 10 Sekunden lang ruhen, bevor eine Belichtung gemacht wird.

Wechseln Sie nach dem Sammeln von Bildern zur nächsten gespeicherten Position und wiederholen Sie diesen Vorgang, um weitere Bilder zu sammeln. Entwickeln Sie die Folien in voller Stärke D 19 für 12 Minuten. Digitalisieren Sie dann die Bilder mit einem Nikon Super Cool Scan 9.000 ED-Scanner bei einer Pixelgröße von 6,35 Mikrometern.

Ein spiralförmiges Objekt kann durch zwei Parameter indiziert werden. Die Bessel-Ordnung N und die Layer-Liniennummer L in der Forer-Transformation des Oberflächengitters eines spiralförmigen Objekts. Jede Schichtlinie ist durch N und L gekennzeichnet und entspricht einem Satz von Linien auf dem Oberflächengitter, die durch H- und K-Indizes gekennzeichnet sind.

Um mit der spiralförmigen Indizierung zu beginnen, verwenden Sie das Iman-Programm Helix Boxer, um ein relativ langes und gerades Rohr mit einheitlichem Durchmesser auszuboxen und das Bild im MRC-Format zu speichern. Messen Sie dann den Radius des Rohres mit dem Programmboxer von Iman. Bestimmen Sie den HEL-Wiederholungsabstand mit einem auf Kreuzkorrelation basierenden Programm, z. B. I-M-G-C-C-F im MRC-Paket.

Berechnen Sie dann das Foyer. Transformieren Sie mit einer neuen Quaderlänge, die ein Integral des Wiederholungsabstands ist. Wählen Sie als Nächstes zwei Hauptlayerlinien aus, die zwei grundlegende Oberflächengittervektoren definieren: eine Null und eine Null eins in der Einheit FFT-Pixel.

Bestimmen Sie die Lagenliniennummern sowie die Radien der maximalen Amplitude für die beiden Hauptlagenlinien in der Fourier-Transformation. Ausgehend von den Liniennummern der Schichten und den Werten der Bessel-Ordnungen für die beiden Hauptlagenlinien kann die Rotation zwischen den Untereinheiten und der axiale Anstieg der Ein-Stern-Helix unter Verwendung der Auswahlregel ermittelt werden, wie sie im schriftlichen Verfahren beschrieben ist. Diese beiden reellen Zahlen beschreiben die Schraubensymmetrie des Rohres.

Die 3D-Rekonstruktion beginnt mit der Partikelsegmentierung mit dem Programm Iman. Boxer. Nachdem Sie eine Schliffaufnahme mit helikalen Partikeln geöffnet haben, schneiden Sie ein Partikel im Bedienfeld des Boxers in überlappende Segmente. Wählen Sie den Helix-Modus und stellen Sie die Parameter für das Boxen ein.

Die Größe der Box sollte größer sein als der Durchmesser des Partikels und der Wert für OLA sollte etwa 90 % der Boxgröße betragen. Wenn Sie nach links auf eines der Enden des Partikelboxers klicken, wird automatisch eine Reihe von Partikelboxen entlang der Helixlänge generiert. Speichern Sie die gerahmten Segmente sowie deren Koordinaten. Der nächste Schritt besteht darin, eine erste 3D-Rekonstruktion mit der iterativen helikalen Realraumrekonstruktionsmethode I-H-R-S-R durchzuführen, bevor die Verarbeitung mit I-H-R-S-R erfolgt.

Kehren Sie den Kontrast der Kryo-EM-Bilder um und wenden Sie die LOWPASS-Filterung an. Öffnen Sie dann die grafische Oberfläche des Programms I-H-R-S-R, indem Sie den Generator eingeben. Stellen Sie der grafischen Benutzeroberfläche alle Informationen für den Quader-Partikelstapel zur Verfügung, einschließlich des Namens und des Pfads des Stapels, der Anzahl der Bilder im Stapel und der Werte für die Symmetrieparameter.

Klicken Sie auf die Schaltfläche Fertig stellen, um das Rekonstruktionsskript zu erstellen. B 25 SP. Als erste Referenz verwende ich einen Voll- oder Hohlzylinder und lasse das Verfahren so lange laufen, bis sich die definierte Schraubensymmetrie nicht mehr ändert, was in der Regel nach einigen Zyklen der Fall ist. Eine rechtshelikale Symmetrie sollte eine stabil konvergente Rekonstruktion ergeben.

Die im letzten Zyklus generierte Rekonstruktion wird als erste Referenz für die weitere Verfeinerung verwendet. Führen Sie abschließend eine 3D-Rekonstruktion mit iterativer Verfeinerung durch, indem Sie die von I-H-R-S-R generierte 3D-Dichtekarte als erste Referenz für eine weitere Verfeinerung während der Verfeinerung verwenden. Die helikale Symmetrie ist bei der Rotation zwischen den Untereinheiten und der axialen Steigung festgelegt, die mit dem I-H-R-S-R-Verfahren bestimmt werden.

Als nächstes bestimmen Sie die Defokussierung und den Astigmatismus in der Schliffbildaufnahme mit den Programmen CTF find three und CTF tilt mit Spinnenprogrammen, die als FT und mu bezeichnet werden, multiplizieren Partikelsegmente durch die Kontrastübertragungsfunktion. Die abgekürzte CTF führt einen Projektionsabgleich durch, indem sie die Projektionen der Referenzvolumina mit den CTF-korrigierten Bildern unter Verwendung der Multi-Referenzausrichtung vergleicht. Die Variation des Neigungswinkels außerhalb der Ebene ist auf plus oder minus 10 Grad begrenzt und führt in Schritten von einem Grad zu Einschränkungen wie hohen Korrelationskoeffizienten in einfachen Winkeln nahe null Grad oder 180 Grad und begrenzten X-Verschiebungen.

Bei den Achsparametern jedes Segments werden nur die Segmente in die Rekonstruktion einbezogen, die den Randbedingungen entsprechen. Nach jedem iterativen Verfeinerungszyklus wird eine 3D-Rekonstruktion mittels Rückprojektion erzeugt und durch einen Teil über das CTF-Quadrat dividiert, das die spiralförmige Symmetrie auferlegt, um ein Symmetrievolumen zu erzeugen. Die iterative Verfeinerung wird beendet, wenn keine weitere Verbesserung der Auflösung der neuen 3D-Rekonstruktion eintritt.

Eine einzelne HIV-Ein-Kapsid-Anordnung, eine 92 e-Röhre, wurde ausgeboxt und ihre Fourier-Transformation für die Helic-Indexierung der beiden Radien, der Lagenliniennummern und der Radien der maximalen Amplitude für die Schichtlinien eins null und null eins berechnet. Anschließend wurden Endwerte von minus 12 und 11 für eine Null bzw. Null eins mit einer Wiederholungsdistanz von 5195,48 Ångström berechnet. Die Schraubensymmetrie des Rohres wurde so bestimmt, dass Delta Z 6,81 Ångström und Delta fünf 328,88 Grad entspricht, Delta Z und Delta fünf wurden mit I-H-R-S-R auf 7,13 Ångström und 328,86 Grad verfeinert und nach 10 iterativen Zyklen eine erste Rekonstruktion erstellt.

Die endgültige Rekonstruktion nach iterativer Verfeinerung verbesserte die Dichtekarte signifikant gegenüber dem ursprünglichen Modell, das mit I-H-R-S-R berechnet wurde. Die Dichtekarte von Kapsidanordnungsröhrchen wird als drei orthogonale Schichten parallel zur Rohrachse und nahe der Oberfläche, senkrecht zur Rohrachse und parallel zu und durch die Rohrachse dargestellt. Die dargestellte Struktur ergibt sich aus dem Oberflächen-Rendering der 3D-Dichtekarte, die bei 1,8 Sigma konturiert ist und 100 % Volumen umfasst.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein sehr gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mit Hilfe der Krähenelektronenmikroskopie eine 3D-Struktur eines verbündeten zusammengesetzten Moleküls erhalten.