Name: Aufbau des HIV-1 Capsid Assemblies durch Kryo-Elektronenmikroskopie und Iterative Helical Real-Raum Wiederaufbau (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Erfahren Sie die iterative helikale Real-Raum-Wiederaufbau-Methode für HIV-1-Capsid-Assemblies mittels Kryo-Elektronenmikroskopie. Dieses Protokoll ermöglicht hochaufgelöste 3D-Dichtekarten für die Strukturbiologie.

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Die Autoren bedanken sich bei Dr. Gongpu Zhao und Danxia Ke für technische Unterstützung danken. Wir danken Drs. Edward Egelman und Niko Grigorieff für die gemeinsame Nutzung ihrer Bildverarbeitungssoftware. Wir erkennen auch die Mitarbeiter, die Strukturbiologie Kryo-EM-Anlage und Beowulf Cluster-und Grid an der University of Pittsburgh School of Medicine zu unterstützen. Diese Arbeit wurde von GM082251 und GM085043 unterstützt.

1. Frozen-hydratisiert EM Probenvorbereitung Da HIV-1 Capsid Protein (CA) Baugruppen 9 nur in hohen Salzkonzentrationen (1M NaCl)-Puffer, der starke Hintergrundgeräusche in Kryo-EM-Bilder beteiligt sind stabil, verwenden wir eine rasche Verdünnung und Rückseite Blot-Methode, um vorübergehend verringern das Salz Konzentration bei der Vorbereitung der gefrorenen hydratisierten EM Gitter. <ol><li> Glimmentladung die Kohlenstoff-Seite des 200-mesh R2 / 1 Quantifoil Kupfergittern unter 25mA für 25 Sekunden. </li><li> Verwenden Sie einen Vernebler, die Luftfeuchtigkeit in der Klimakammer, eine hausgemachte manuelle Schwerkraft Kolben, auf 80% zu bringen. </li><li> In der FEI Vitrobot Plunger Dewar, kühlen flüssigem Ethan mit flüssigem Stickstoff. Montieren Sie den Sprung-freezing Dewar auf die manuelle Schwerkraft Kolben. </li><li> Übernehmen 2,5 ul vormontiert CA-Lösung auf den Kohlenstoff Seite des Gitters, die auf einer Pinzette montiert ist, und laden Sie die Zange auf den Kolben mit dem Kohlenstoff Seite des Gitters abgewandten Sie. </li><li> Add 3 ul salzarme Verdünnungspuffer (100 mM NaCl) auf der Rückseite des Gitters und sofort Blot der Rückseite des Gitters mit einem Stück Filterpapier. Die gesamte Rückseite des Gitters sollte in engem Kontakt mit dem Filterpapier für ca. 6 Sekunden, bevor Sie das Filterpapier. Sofort stürzen die Gitter in flüssigem Ethan nach dem Entfernen des Filterpapiers. </li><li> Entfernen Sie die Zange aus dem Kolben und schnelle Übertragung des Gitters in eine Grid-Storage-Box. </li></ol> 2. Cryo-Elektronenmikroskopie von CA röhrenförmigen Baugruppen <ol><li> Legen Sie die gefrorenen hydratisierten Gitter in eine FEI Polara G2 Elektronenmikroskop Betrieb bei 200kV und ausgestattet mit einem Gatan 4Kx4K CCD-Kamera. </li><li> Unter low-dose-Suchmodus bei einer Vergrößerung von ~ 200x und mit einer Dosis &lt;0,001 E - / A 2, Bildschirm das gesamte Netz für Gebiete mit geeigneten Eis und speichern Sie die Positionen dieser Bereiche in einer Phase-Datei. </li><li> Rufen Sie die gespeicherten Positionen und weiteren Bildschirm diesen Bereichen bei einer Vergrößerung von 3.900 x in low-dose-Suchmodus. Wählen Sie die Bereiche mit einer gleichmäßigen, dünnen Schicht aus Eis, das gut getrennt, lange Rohre über Löcher, für die Datenerfassung. Speichern Sie die Positionen dieser Bereiche in einer zweiten Stufe Datei. </li><li> Wechseln Sie zu Belichtungssteuerung bei einer Vergrößerung von 59.000 x, Einsatz einer 100 um Objektivöffnung, und passen Sie das Ziel, Stigmatisierung und Strahlintensität für eine Dosis von ~ 15 e - / Å 2 pro Belichtung. </li><li> Zurück zur low-dose-Suchmodus, um eine gespeicherte Position zu verschieben und zu identifizieren und in der Mitte eine gute Röhre mit der CCD-Kamera. Wechseln Sie in den Fokus-Modus, stellen Sie den Fokus, und legen Sie einen defocus Wert, der normalerweise zwischen 0,5 bis 2,5 um. Wechseln Sie in die Belichtungssteuerung, stellen eine Belichtungszeit von 0,3-0,5 Sekunden, für eine Dosis von 15 E - / A 2, und sammeln Sie ein Bild. Die Bilder werden auf einem Teller Kamera gesammelt, und die Filme sollten die Möglichkeit für 10 Sekunden zu begleichen, bevor eine Belichtung aufgenommen wird. </li><li> Gehen Sie zum nächsten gespeicherten Position und wiederholen Sie Schritt 5, um weitere Bilder zu sammeln. </li><li> Die Filme werden in voller Stärke D19 für 12 Minuten entwickelt und digitalisiert mit einem Nikon Super Coolscan 9000 ED Scanner bei einer Pixelgröße von 6,35 um. Das Format der Bilddateien ist TIFF. </li></ol> 3. Helical Indizierung Eine spiralförmige Objekt kann durch zwei Parameter indiziert werden: Die Bessel Ordnung n, und Schicht Zeilennummer, l. Jede Schicht Linie in der Fourier-Transformation, wie sie aus (n, l), entspricht einer Reihe von Linien auf der Oberfläche Gitter der helikalen Objekt bezeichnet durch (h, k)-Indizes, mit der Notation aus einer 2D-Gitter. Für alle (h, k), ist eine (n hk, l hk) Schicht Linie eine lineare Kombination von zwei Basisvektoren (n = 10, l 10) und (n 01, l 01), die n und l-Werte sind Die beiden wichtigsten Schicht Linien (1, 0) und (0, 1). l kann aus der Schicht line Höhe entlang der Z-Achse in der Fourier-Transformation gemessen bezogen werden. Der Wert von n kann anhand der folgenden Gleichung 10 werden πRr ≈ J n ≈ 1,1 | n | -0,9 .....................( 1) wo J n der Bessel-Funktion, die die Intensität der n-ten Schicht Linie bestimmt ist, ist r der Radius der spiralförmigen Objekt, und R ist der Radius der maximalen Amplitude der Schicht Linie. Die Schicht Zeilennummer, l, ist n durch die Auswahl Regel 11 im Zusammenhang l = tn + um ....................( 2) wo t und u sind Konstanten der Helix. Für jede gegebene Helix, kann es genau u Einheiten werden in genau (oder sehr nahe) t complete dreht. <ol><li> Box aus einer relativ geraden und langen Rohr mit einheitlichem Durchmesser mit dem EMAN ist Programm 12 helixboxer und speichern Sie das Bild in MRC-Format. </li><li> Bestimmen Sie die spiralförmige wiederholen Abstand, c, mit einer Kreuzkorrelation basiertes Programm, wie "imgccf ', in der MRC-Paket 13. </li><li> Berechnen Sie die Fourier-Transformation mit einem neuen Feld Länge, die ein Integral der Wiederholung Abstand, c ist. </li><li> Wählen Sie zwei Haupt-Schicht Linien, die zwei grundlegende Oberfläche Gittervektoren (1,0) zu definieren und (0,1). </li><li> Messen Sie den Radius des Rohres, r, und die Höhe und Radius der beiden wichtigsten Schicht Linien in Fourier-Transformation, l 10, R 10, L 01 ​​R 01 bzw. (Abb. 1). </li><li> Berechnen Sie n 10 und n 01 nach Gleichung (1). </li><li> Da n-Werte nur Schätzungen sind, sind ein paar Kombinationen von n 10 und n 01 in späteren Schritten getestet (siehe Schritt 4.2) auf die richtige helikale Symmetrie mit dem Programmpaket IHRSR finden. </li><li> Berechnen Sie die Schraube Symmetrie von zwei reellen Zahlen beschrieben: die Rotation zwischen den Untereinheiten (Δφ) und die axiale Anstieg (Az) der Ein-Sterne-Helix (n = 1). Angesichts l 10, l 01, n 10 und n 01-Werte, können u und t durch die Prüfung einer Reihe von m-Werte (zum Beispiel, -50 &lt;m &lt;50) nach der Auswahl der Regel erhalten werden. Schließlich sind Δφ und Az berechnet Δφ = 360 t / u und Az = c / u. </li></ol> 4. Dreidimensionale Rekonstruktion <ol><li> Particle-Segmentierung <ol><li> Öffnen Sie eine Aufnahme mit spiralförmigen Partikel, über die grafische Programm Boxer, der ein Programm in der EMAN Paket ist. </li><li> Cut die spiralförmige Partikel in überlappende Segmente. In der Zentrale der Boxer, wählen Helix-Modus und die Parameter für den Boxsport: die Größe der Box sollte größer sein als der Durchmesser der Teilchen und der Wert für 'Olap "sollte ~ 90% of the box groß sein. </li><li> Nach der linken Maustaste auf den beiden Enden der helikalen Partikel werden Boxer automatisch eine Reihe von Partikel-Boxen entlang der Helix Länge. </li><li> Speichern boxed Segmente sowie deren Koordinaten. </li></ol></li><li> Erste 3D-Rekonstruktion mit IHRSR Programme <ol><li> Invert den Kontrast der Kryo-EM-Bilder und gelten Tiefpassfilterung 14 (optional) vor der Verarbeitung mit dem iterativen helikale realen Raum Rekonstruktionsverfahren (IHRSR). </li><li> Öffnen Sie die grafische Oberfläche von IHRSR Programm durch Eingabe von "Generator". Geben Sie die grafische Oberfläche mit allen Informationen für die boxed Partikel-Stack, einschließlich der Namen und den Pfad des Stapels, Anzahl der Bilder im Stapel, die Werte für die Symmetrie-Parameter, etc. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Fertig stellen", um den Wiederaufbau Skript zu erstellen, b25.spi. </li><li> Verwenden Sie eine feste oder Hohlzylinder als erste Referenz-und erlaubt das Verfahren Zyklus, bis es keine Änderungen in den definierten Schraube Symmetrie, was in der Regel nach wenigen Zyklen sind. Ein Recht helikale Symmetrie sollte eine stabil konvergente Wiederaufbau. Der Wiederaufbau in den letzten Zyklus erzeugt wird, als eine erste Referenz für weitere Verfeinerung verwendet werden. IHRSR führt 3D-Rekonstruktion mit SPIDER-Programme. </li></ol></li><li> Rekonstruktion mit Nachiteration 15 Die 3D-Rekonstruktion von IHRSR erzeugt wird jetzt als erste Referenz für weitere Verfeinerung verwendet. Während der Weiterbildung ist die helikale Symmetrie bei Δφ und Az, die aus der IHRSR Verfahren bestimmt sind festgelegt. <ol><li> Bestimmen Sie die Unschärfe und Astigmatismus in der Aufnahme mit Programmen CTFFIND3 und CTFTILT 16. </li><li> Multiplizieren Partikel Segmente durch die CTF mit SPIDER-Programme 17. Der Betrieb bezeichnet FT in der SPIDER-Suite wird verwendet, um die Fourier-Transformation (FFT) des 2D-Bild zu berechnen. Danach wird die FFT von CTF-Werte multipliziert, ermittelt in den vorherigen Schritten mit der Operation bezeichnet MU innerhalb der SPIDER-Suite. Der erhaltene Wert wird dann inverse wieder ein neues Bild (CTF-korrigiert) im realen Raum mit dem SPIDER Betrieb Form umgewandelt, wieder FT. </li><li> Führen Projektion Matching durch Vergleich Projektionen des Referenz-Volumes mit dem CTF-korrigierten Bilder, mit Multi-Referenz-Ausrichtung. Die Variation in der Out-of-plane Neigungswinkel ist zu + / -10 ° begrenzt und beprobt in 1 °-Schritten. Führen Sie Einschränkungen, z. B. hohe Korrelationskoeffizienten, in-plane Winkel nahe 0 ° oder 180 ° haben und begrenzt x-Schichten, für die Ausrichtung Parameter der einzelnen Segmente. Include in der Rekonstruktion nur jene Segmente, die die Einschränkungen zu befriedigen. </li><li> Nach jedem iterative Verfeinerung Zyklus wird eine 3D-Rekonstruktion unter Verwendung Rückprojektion und durch die Summe geteilt über die CTF2. </li><li> Impose die helikale Symmetrie zu einem symmetrisierten Volumen zu generieren. Die iterative Verfeinerung ist beendet, wenn keine weitere Verbesserung der Auflösung der neuen 3D-Rekonstruktion erfolgt. </li><li> Die Bildverarbeitungs-Paket SPIDER ist für die meisten der Verfeinerung Schritte verwendet. Eine Reihe von Operationen werden von SPIDER-Skripte, die vom Benutzer erstellten Batch-Steuerung Dateien mit Sequenzen von Operationen und Parameter-Werte kontrolliert werden. Die endgültige Rekonstruktion errechnet Programme in SPIDER-Suite. </li></ol></li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Eine einzige HIV-1 CA A92E Rohr (Abb. 1a) wurde boxed out und seine Fourier-Transformation (Abb. 1b) wurde für Helix Indexierung berechnet. Für Schicht Linien (1, 0) und (0, 1), l 10 = 28, l 01 = 37, R 10 = 55, R 01 = 44. Angesichts einer Röhre Radius von 211.57Å, angenähert wir n 10 =- 12, n 01 = 11 (hier die Händigkeit wurde vorgegeben). Mit einer Wiederholung Abstand von 5195.48Å, die Schraube Symmetrie der Röhre wurde als Az bestimmt = 6.8093Å, Δφ = 328,88 °. Az und Δφ wurden 7.1321Å und 328,86 verfeinert ° mit IHRSR (Abb. 2a) und der erste Wiederaufbau ist in Abb.. 2b. Die endgültige Rekonstruktion (Abb. 3), nach iterative Verfeinerung, verbesserte sich die Dichte Karte deutlich von der ersten Modells mit IHRSR (Abb. 2b) berechnet. <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Indizierung von HIV-1 CA Schraubenfeder. (A) Eine einzelne HIV-1 CA A92E Rohr Bild. Scale-bar, 30 nm auf. (B) Die Fourier der Röhre in (A) gezeigt, zu verwandeln. Die spiralförmige Indizes (n 10 =- 12, n 01 = 11) bezeichnet werden. Die Pfeilspitze zeigt auf die Schicht Linie bei 23a-Auflösung. <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Eine erste Rekonstruktion mit IHRSR. (A) Schrauben Symmetrie Bestimmung für jeden iterativen Zyklus. Δφ und Az, ausgehend von der ursprünglichen Werte, die stabile Werte konvergieren nach 10 Nachiteration Zyklen. (B) Die ersten 3D-density map nach 10 iterative Zyklen. <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Die 3D-density map nach der iterative Verfeinerung. (AC) Die Dichte Karte CA Rohre als drei orthogonalen Schnitten dargestellt: parallel zur Rohrachse und nahe an der Oberfläche (A), die senkrecht zur Rohrachse (B), und parallel zur und durch die Rohrachse (C) . Scale-Bars, 10 nm auf. (D) Surface Rendering der 3D-density map bei 1.8s konturierte umschließenden 100% vol.

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir präsentieren eine Reihe von Protokollen ein einfacher Ansatz bieten, um 3D-Strukturen von Helix Objekte zu erhalten. Mit dem beschriebenen Verfahren haben wir eine 3D-Struktur von HIV-1 Capsid Montage aus einer einzigen Röhre Bild (176 Segmente). Höhere Auflösung Strukturen können durch darunter mehr Bilddaten erreicht werden. Es gibt mehrere kritische Punkte zur optimalen Datenerfassung und-analyse: Erstens, bei der Vorbereitung eines Kryo-EM-Probe sollte die Probelösung entfernt ausgelöscht werden, so dass eine gleichmäßige, dünne Schicht aus Lösung, die etwas dicker als die Stichprobengröße ist. Es gibt verschiedene Möglichkeiten, um die Probe-Blot. Bei bakteriellen Zellen und röhrenförmigen Proben, wie zum Beispiel HIV-1 CA Montage, Löschpapier aus einseitig, vor allem aus der Rückseite, am besten geeignet ist. Zweitens muss die Händigkeit der Helix bestimmt werden, da dies nicht durch spiralförmige Indizierung oder Rekonstruktion durchgeführt werden. Eine gängige Praxis ist, Gefrierätztechnik, von Rotary Shadowing 18 bis Händigkeit bestimmen gefolgt verwenden. Händigkeit kann auch post-Rekonstruktion bestimmt werden, wenn die Auflösung der Dichte Karte ist ausreichend hoch, die 3D Atommodelle der einzelnen Komponenten sollten gut in der Dichte Karte, wenn eine korrekte Händigkeit angenommen. Andernfalls sollte die Händigkeit angenommen werden. Drittens sollte ein Wiener-Filter bei der Bildverarbeitung eingesetzt werden, sowohl für Phase und Amplitude Korrektur, um rauscharme Verstärkung zu reduzieren. Da die CTF aus einem einzigen Bild hat immer Nulldurchgänge, ist ein Teil der Informationen im reziproken Raum verloren. Daher ist es notwendig, mehrere Projektion Daten-Sets enthalten zur 3D-Rekonstruktion, die jeweils abgebildeten an verschiedenen defocus Werte.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Quelle </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Glow-Entladeeinrichtung 100X </td><td> Glow-Entladeeinrichtung 100X </td><td></td></tr><tr><td> Tecnai Polara F30 Mikroskop mit einem Field Emission Gun </td><td> FEI, Portland, OR </td><td></td></tr><tr><td> Gatan 4K x 4K-CCD-Kamera </td><td> Gatan, Pleasanton, CA </td><td></td></tr><tr><td> Plunge-Gefriereinrichtung </td><td></td><td> Hausgemachte manuelle Schwerkraft Kolben </td></tr><tr><td> Quantifoil R2 / 1 200 mesh holely-Kohlenstoff Kupfergittern </td><td> Quantifoil Micro Tools, Jena, Deutschland </td><td></td></tr><tr><td> EM Software EMAN </td><td> <a href="http://blake.bcm.edu/EMAN/">http://blake.bcm.edu/EMAN/</a> </td><td></td></tr><tr><td> EM Software IHRSR </td><td> <a href="http://people.virginia.edu/~ehe2n/">http://people.virginia.edu/ ~ ehe2n /</a> </td><td> Programme von Edward H. Egelman </td></tr><tr><td> EM Software Spinne </td><td> <a href="http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html">http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</a> </td><td></td></tr><tr><td> MRC basierten Helix-Software </td><td> <a href="http://www.riken.jp/biostrmech/index.html">http://www.riken.jp/biostrmech/index.html</a> </td><td> Programme von Koji Yonekura </td></tr><tr><td> CTFFIND3/CTFTILT und Real-Raum spiralförmige Veredelung Software </td><td> <a href="http://emlab.rose2.brandeis.edu/software">http://emlab.rose2.brandeis.edu/software</a> </td><td></td></tr></tbody></table>

aufbau des hiv-1 capsid assemblies durch kryo-elektronenmikroskopie und iterative helical real-raum wiederaufbau

Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

Cryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM), mit Bildverarbeitung kombiniert, ist eine zunehmend mächtiges Werkzeug zur Strukturaufklärung von makromolekularen Proteinkomplexen und Baugruppen. In der Tat haben einzelne Partikel Elektronenmikroskopie 1 und zweidimensionale (2D) Elektronenkristallographie 2 haben sich relativ Routine Methoden und eine Vielzahl von Strukturen gelöst mit diesen Methoden. Zur gleichen Zeit hat der Bildverarbeitung und dreidimensionale (3D) Rekonstruktion der Helix-Objekte schnell entwickelt, vor allem, die iterative helikale Realraum Wiederaufbau (IHRSR)-Methode 3, die einzelnen Partikel-Analyse-Tools verwendet in Verbindung mit helikalen Symmetrie. Viele biologische Einheiten Funktion in filamentösen oder spiralförmige Formen, einschließlich Aktinfilamente 4, Mikrotubuli 5, Amyloid-Fasern 6, Tabak-Mosaik-Virus 7 und Bakterien Geißeln 8, und weil ein 3D-Dichte Karte eine spiralförmige Einheit aus einer Projektion erreicht werden kann Bild, im Vergleich zu den vielen Bildern für die 3D-Rekonstruktion eines nichthelikalen Objekt erforderlich, mit dem IHRSR Methode, Strukturanalyse eines solchen flexiblen und ungeordneten spiralförmigen Anordnungen ist nun erreichbar. In diesem Video-Artikel bieten wir Ihnen detaillierte Protokolle für die Erlangung eines 3D-Dichte Karte eine helikale Protein Montage (HIV-1 Capsid 9 ist unser Beispiel), einschließlich der Protokolle für die Kryo-EM Probenvorbereitung, niedrige Dosis Datenerhebung durch Kryo-EM, Indexierung von Schraubenfedern Beugungsmuster und Bildverarbeitungs-und 3D-Rekonstruktion mit IHRSR. Im Vergleich zu anderen Techniken, bietet Kryo-EM optimale Probe Erhaltung unter nahezu natürlichen Bedingungen. Die Proben werden in einer dünnen Schicht aus glasigem Eis eingebettet, durch schnelles Einfrieren und abgebildet in Elektronenmikroskopen bei der Temperatur flüssigen Stickstoffs, unter niedrig dosiertem Bedingungen, um die Strahlung zu minimieren. Beispielbilder sind unter nahezu natürlichen Bedingungen zu Lasten der Low-Signal und geringem Kontrast in der aufgezeichneten Aufnahmen erhalten. Glücklicherweise hat der Prozess der helikalen Wiederaufbau weitgehend automatisiert, mit Ausnahme der Indizierung der spiralförmigen Beugungsmuster. Hier beschreiben wir einen Ansatz zur Index Helix-Struktur und bestimmen helikale Symmetrie (helikale Parameter) aus digitalisierten Aufnahmen, ein wesentlicher Schritt für die 3D-helikale Wiederaufbau. Kurz gesagt, erhalten wir einen ersten 3D-density map durch die Anwendung der IHRSR Methode. Diese erste Karte wird dann iterativ durch die Einführung von Beschränkungen für die Ausrichtung Parameter der einzelnen Segmente und damit die Kontrolle ihrer Freiheitsgrade verfeinert. Eine weitere Verbesserung ist durch die Korrektur für die contrast transfer function (CTF) des Elektronenmikroskops (Amplitude und Phase-Korrektur) und durch die Optimierung der helikale Symmetrie der Anordnung erreicht.

Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um eine dreidimensionale (3D) Struktur der spiralförmig montiert Moleküle mittels Kryo-Elektronenmikroskopie erhalten. In diesem Protokoll, verwenden wir HIV-1 Capsid Baugruppen für die detaillierte 3D-Rekonstruktion Verfahren zum Erreichen einer Dichte Karte durch die iterative helikale Realraum Rekonstruktion Methode zu illustrieren.

Aufbau des HIV-1 Capsid Assemblies durch Kryo-Elektronenmikroskopie und Iterative Helical Real-Raum Wiederaufbau

Die Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) ist in Kombination mit der Bildverarbeitung ein zunehmend leistungsfähiges Instrument zur Strukturaufklärung makromolekularer Proteine ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Methode zur Gewinnung einer dreidimensionalen Struktur von heli-assemblierten Molekülen mittels Kryo-Elektronenmikroskopie bereitzustellen. Das Protokoll beginnt mit der Kryo-EM-Probenpräparation unter Verwendung einer Schnellverdünnungs- und Rückseiten-Blotting-Methode, um die Salzkonzentration vorübergehend zu senken, wenn der gefroren-hydratierte EM-Grid hergestellt wird. Dieser Prozess gewährleistet die Stabilität des Proteins, verringert gleichzeitig Hintergrundrauschen und verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis während der anschließenden datensammelnden Kryo-EM-Aufnahme mit niedriger Dosis, die auf die Datensammlung folgt.Die helikale Indizierung der Beugungsmuster ist abgeschlossen. Anschließend erfolgt die Bildverarbeitung, gefolgt von der 3D-Rekonstruktion im Realraum, was zur endgültigen Dichtekarte des HIV-Kapsids oder des CA-Rohrs führt. Im Allgemeinen werden Anfänger Schwierigkeiten haben, da es mehrere kritische Punkte für eine optimale Datensammlung und -analyse gibt.Beispielsweise bilden sich bei HIV Kapsid-Röhrenstrukturen, die nur in einer einmolarigen Quelllösung entstehen, durch schnelle Reduzierung der Salzkonzentration, ohne die Struktur zu beeinträchtigen. Es ist entscheidend, hochwertige Kryo-EM-Aufnahmen zu erhalten. Bei einem Röhrenbild ist es äußerst schwierig, herauszufinden, wie eine wichtige Röhre indiziert werden muss und welche Software für die 3D-Rekonstruktion in Betracht gezogen werden könnte.Dieses Video bietet einen detaillierten und einfachen Ansatz, um eine 3D-Rekonstruktion physischer Objekte zu erhalten, und kann als Referenz für Ihr Experiment dienen. Ich werde das Verfahren gemeinsam mit Dr. Puja demonstrieren. Wir sind beide Postdocs aus dem Labor von Dr. Laboratory. Um die HIV-1-Kapsidprotein-Assemblierungen für die Kryo-EM vorzubereiten, beginnen Sie damit, die Kohlenstoffseite von 200-Mesh-Kupfergittern unter 25 Milliampere für 25 Sekunden zu glühen und zu entladen.Verwenden Sie ein Zerstäubungsgerät, um die Luftfeuchtigkeit in der Umweltkammer auf 80 % zu erhöhen, die aus einer manuellen, selbstgebauten Schwerkraft-Stoßvorrichtung besteht. Kühlen Sie unterdessen flüssiges Ethan in einer Glasflaschen-Stoßvorrichtung mit flüssigem Stickstoff; montieren Sie die Stoßgefriervorrichtung auf die manuelle Schwerkraft-Stoßvorrichtung. Verwenden Sie anschließend eine Pinzette, um die Klemmen am Gitterrand festzuklemmen.Geben Sie 2,5 µL einer vorgefertigten Proteinslösung auf die Kohlenseite des Rasters. Danach bringen Sie die Pinzette mit der Kohlenseite des Rasters nach außen auf den Kolben auf. Fügen Sie 3 µL Puffer mit niedriger Salzkonzentration zur Rückseite des Rasters hinzu.Blottern Sie das Raster unverzüglich mit einem Stück Filterpapier auf derselben Seite ab. Halten Sie die gesamte Rückseite des Rasters etwa sechs Sekunden lang eng an das Filterpapier angepresst. Nach dem Entfernen des Filterpapiers tauchen Sie das Raster sofort in flüssiges Ethan ein.Entfernen Sie schließlich die Pinzette vom Kolben und übertragen Sie das Gitter schnell in eine Gitteraufbewahrungsbox. Beginnen Sie die Kryo-Elektronenmikroskopie, indem Sie das gefrorene, hydratisierte Gitter in ein FEI Polara G2-Elektronenmikroskop laden, das bei 200 Kilovolt betrieben wird und mit einer Gatan 4K × 4K CCD-Kamera ausgestattet ist.Im Suchmodus mit niedriger Dosis eine Vergrößerung von etwa 200× hinzufügen. Das gesamte Gitter nach Bereichen mit geeignetem Eis absuchen. Die Positionen dieser Bereiche in einer Stufen-Datei speichern.Rufen Sie die gespeicherten Positionen auf und untersuchen Sie diese Bereiche weiter. Wählen Sie eine Vergrößerung von 3.900× im Niedrigdosis-Suchmodus. Wählen Sie die Bereiche mit gleichmäßigem, dünnem Einfrieren für die Datensammlung aus, die dadurch gekennzeichnet sind, dass lange Röhren über einer Öffnung schweben.Speichern Sie alle Bereiche in einer Zweitstufen-Datei. Wechseln Sie in den Belichtungsmodus. Fügen Sie eine Vergrößerung von 59.000 x hinzu und setzen Sie eine 100-Mikrometer-Objektivblende ein.Danach die Objektivstigmatie und Strahlintensität so einstellen, dass eine Dosis von etwa 15 Elektronen pro Ångström Quadrat pro Belichtung erreicht wird. Zur Niedrigdosis-Suchansicht zurückkehren und zu einer gespeicherten Position wechseln. Einen geeigneten Tubulus identifizieren und zentrieren.Stellen Sie mithilfe der CCD-Kamera auf den Fokusmodus um, justieren Sie den Fokus und stellen Sie normalerweise einen Defokuswert zwischen 0,5 und 2,5 Mikrometern ein. Schalten Sie dann in den Belichtungsmodus und stellen Sie eine Belichtungszeit von 0,3 bis 0,5 Sekunden für eine Dosis von 15 Elektronen pro Quadratangstrom ein. Sammeln Sie die Bilder mit einer Plattenkamera, wobei die Filme vor der Belichtung 10 Sekunden lang ruhen sollen.Nach der Aufnahme der Bilder wechseln Sie zur nächsten gespeicherten Position und wiederholen diesen Vorgang, um weitere Bilder aufzunehmen. Entwickeln Sie die Filme 12 Minuten lang in voller Konzentration mit D 19. Anschließend digitalisieren Sie die Bilder mithilfe eines Nikon Super cool scan 9,000 ED-Scanners mit einer Pixelgröße von 6,35 Mikrometern.Ein helikales Objekt kann durch zwei Parameter indiziert werden: die Besselordnung N und die Schichtliniennummer L in der Fourier-Transformation des Oberflächengitters eines helikalen Objekts. Jede Schichtlinie wird durch N und L charakterisiert und entspricht einer Menge von Linien auf dem Oberflächengitter, gekennzeichnet durch die Indizes H und K.Um mit der helikalen Indizierung zu beginnen, verwenden Sie das Programm Helix boxer von Iman, um ein relativ langes und gerades Rohr mit gleichmäßigem Durchmesser auszuwählen und das Bild im MRC-Format zu speichern. Anschließend messen Sie den Radius des Rohrs mithilfe des Programms boxer von Iman. Bestimmen Sie den HEL-Wiederholungsabstand unter Verwendung eines auf Kreuzkorrelation basierenden Programms wie I-M-G-C-C-F im MRC-Paket.Berechnen Sie dann die Eingangshalle. Transformieren Sie mit einer neuen Kastenlänge, die ein Vielfaches der Wiederholungsdistanz ist. Wählen Sie anschließend zwei Haupt-Ebenenlinien aus, die zwei grundlegende Gittervektoren der Oberfläche definieren, und zwar „eins null“ und „null eins“ in Einheiten von FFT-Pixeln.Bestimmen Sie die Schichtliniennummern sowie die Radien der maximalen Amplitude für die beiden Haupt-Schichtlinien in der Fourier-Transformation. Aus den Schichtliniennummern und den Werten der Bessel-Ordnungen für die beiden Haupt-Schichtlinien können unter Verwendung der Auswahlregel, wie im schriftlichen Verfahren beschrieben, die Rotation zwischen den Untereinheiten und der axiale Anstieg der Ein-Stern-Helix ermittelt werden. Diese beiden reellen Zahlen beschreiben die Schraubensymmetrie des Rohrs.Die 3D-Rekonstruktion beginnt mit der Partikelsegmentierung mithilfe des Iman-Programms Boxer. Nachdem ein Mikrograf mit helikalen Partikeln geöffnet wurde, schneiden Sie im Steuerfeld von Boxer einen Partikel in überlappende Segmente. Wählen Sie den Helix-Modus und stellen Sie die Parameter für das Einrahmen ein.Die Größe der Box sollte größer als der Durchmesser des Partikels sein, und der Wert für OLA sollte etwa 90 % der Boxgröße betragen. Nach einem Klick auf eines der Enden des Partikel-Boxers wird automatisch eine Reihe von Partikelboxen entlang der Helixlänge generiert; zudem werden die boxed Segmente sowie ihre Koordinaten gespeichert. Der nächste Schritt besteht darin, eine initiale 3D-Rekonstruktion mithilfe der iterativen helikalen Rekonstruktion im reellen Raum (I-H-R-S-R) durchzuführen, bevor die Verarbeitung mit I-H-R-S-R erfolgt.Stellen Sie den Kontrast der Kryo-EM-Bilder um und wenden Sie eine TIEFPASS-Filterung an. Öffnen Sie dann die grafische Oberfläche des I-H-R-S-R-Programms, indem Sie generator eingeben. Geben Sie der grafischen Oberfläche alle erforderlichen Informationen für den Stapel der markierten Partikel an, einschließlich Name und Pfad des Stapels, Anzahl der Bilder im Stapel sowie der Werte für die Symmetrieparameter.Klicken Sie auf die Schaltfläche „Fertig stellen“, um das Rekonstruktionsskript zu erstellen. B 25 SP.I verwende einen Voll- oder Hohlzylinder als initiale Referenz und lasse den Vorgang so lange zyklisch durchlaufen, bis sich die definierte Schraubensymmetrie nicht mehr ändert, was üblicherweise nach wenigen Zyklen der Fall ist. Eine rechtsdrehende Helixsymmetrie sollte eine stabil konvergierte Rekonstruktion ergeben.Die in der letzten Zyklen erzeugte Rekonstruktion wird als anfänglicher Referenzwert für weitere Verfeinerungen verwendet. Führen Sie abschließend eine 3D-Rekonstruktion mit iterativer Verfeinerung durch, wobei die durch I-H-R-S-R erzeugte 3D-Dichtekarte als anfänglicher Referenzwert für zusätzliche Verfeinerungen während der Verfeinerung dient. Die helikale Symmetrie ist auf die Rotation zwischen den Untereinheiten und den axialen Anstieg festgelegt, die aus dem I-H-R-S-R-Verfahren bestimmt wurden.Als Nächstes bestimmen Sie die im Mikrograf vorhandene Defokussierung und das Astigmatismus mit den Programmen CTF find three und CTF tilt unter Verwendung von SPIDER-Programmen, die als FT und mu bezeichnet werden. Multiplizieren Sie Partikelsegmente mit der Kontrastübertragungsfunktion, abgekürzt CTF, und führen Sie eine Projektionsanpassung durch, indem Sie Projektionen der Referenzvolumina mit den CTF-korrigierten Bildern unter Verwendung einer Multi-Referenz-Ausrichtung vergleichen. Die Variation des Aus-der-Ebene-Tiltwinkels ist auf plus oder minus 10 Grad begrenzt und in Ein-Grad-Schritten abgetastet; dabei werden Nebenbedingungen eingeführt, wie hohe Korrelationskoeffizienten für Neigungswinkel nahe null Grad oder 180 Grad sowie begrenzte X-Verschiebungen.Fügen Sie für die Alignierungsparameter jedes Segments nur die Segmente in die Rekonstruktion ein, die die Beschränkungen erfüllen. Nach jedem iterativen Verfeinerungszyklus wird eine 3D-Rekonstruktion mittels Rückprojektion erzeugt und durch einige über das CTF-Quadrat dividiert, um die helikale Symmetrie anzuwenden und ein symmetrisches Volumen zu erzeugen. Die iterative Verfeinerung wird beendet, wenn keine weitere Verbesserung der Auflösung der neuen 3D-Rekonstruktion mehr auftritt.Eine einzelne HIV-1-Kapsid-Assembly, eine 92-e-Röhre, wurde ausgeschnitten und ihre Fourier-Transformation zur Helix-Indexierung berechnet; dabei wurden die beiden Radien, die Schichtliniennummern sowie die Radien der maximalen Amplitude für die Schichtlinien 10 und 01 bestimmt. Die Endwerte von −12 und 11 wurden anschließend für 10 bzw. 01 berechnet, bei einer Wiederholungsdistanz von 5195,48 Ångström. Die Schraubensymmetrie der Röhre wurde als ΔZ = 6,81 Ångström und Δφ = 328,88 Grad ermittelt; ΔZ und Δφ wurden mittels I-H-R-S-R auf 7,13 Ångström und 328,86 Grad verfeinert, und nach 10 iterativen Zyklen wurde eine erste Rekonstruktion erstellt.Die endgültige Rekonstruktion nach iterativer Verbesserung zeigte eine deutliche Verbesserung der Dichtekarte im Vergleich zum anfänglichen Modell, das mit I-H-R-S-R berechnet wurde. Die Dichtekarte der Kapsid-Assemblierungsröhren wird als drei orthogonale Schnittebene angezeigt, die parallel zur Röhrenachse und nahe der Oberfläche, senkrecht zur Röhrenachse sowie parallel und entlang der Röhrenachse verlaufen. Die dargestellte Struktur ergibt sich aus der Oberflächen-Darstellung der 3D-Dichtekarte, die bei 1,8 Sigma konturiert ist und 100 % des Volumens einschließt.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein sehr gutes Verständnis dafür haben, wie man mithilfe der Kryo-Elektronenmikroskopie eine dreidimensionale Struktur eines in Lösung assemblierten Moleküls erhält.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

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