Aufbau des HIV-1 Capsid Assemblies durch Kryo-Elektronenmikroskopie und Iterative Helical Real-Raum Wiederaufbau

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Methode zur Gewinnung einer dreidimensionalen Struktur von heli-assemblierten Molekülen mittels Kryo-Elektronenmikroskopie bereitzustellen. Das Protokoll beginnt mit der Kryo-EM-Probenpräparation unter Verwendung einer Schnellverdünnungs- und Rückseiten-Blotting-Methode, um die Salzkonzentration vorübergehend zu senken, wenn der gefroren-hydratierte EM-Grid hergestellt wird. Dieser Prozess gewährleistet die Stabilität des Proteins, verringert gleichzeitig Hintergrundrauschen und verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis während der anschließenden datensammelnden Kryo-EM-Aufnahme mit niedriger Dosis, die auf die Datensammlung folgt.

Die helikale Indizierung der Beugungsmuster ist abgeschlossen. Anschließend erfolgt die Bildverarbeitung, gefolgt von der 3D-Rekonstruktion im Realraum, was zur endgültigen Dichtekarte des HIV-Kapsids oder des CA-Rohrs führt. Im Allgemeinen werden Anfänger Schwierigkeiten haben, da es mehrere kritische Punkte für eine optimale Datensammlung und -analyse gibt.

Beispielsweise bilden sich bei HIV Kapsid-Röhrenstrukturen, die nur in einer einmolarigen Quelllösung entstehen, durch schnelle Reduzierung der Salzkonzentration, ohne die Struktur zu beeinträchtigen. Es ist entscheidend, hochwertige Kryo-EM-Aufnahmen zu erhalten. Bei einem Röhrenbild ist es äußerst schwierig, herauszufinden, wie eine wichtige Röhre indiziert werden muss und welche Software für die 3D-Rekonstruktion in Betracht gezogen werden könnte.

Dieses Video bietet einen detaillierten und einfachen Ansatz, um eine 3D-Rekonstruktion physischer Objekte zu erhalten, und kann als Referenz für Ihr Experiment dienen. Ich werde das Verfahren gemeinsam mit Dr. Puja demonstrieren. Wir sind beide Postdocs aus dem Labor von Dr. Laboratory. Um die HIV-1-Kapsidprotein-Assemblierungen für die Kryo-EM vorzubereiten, beginnen Sie damit, die Kohlenstoffseite von 200-Mesh-Kupfergittern unter 25 Milliampere für 25 Sekunden zu glühen und zu entladen.

Verwenden Sie ein Zerstäubungsgerät, um die Luftfeuchtigkeit in der Umweltkammer auf 80 % zu erhöhen, die aus einer manuellen, selbstgebauten Schwerkraft-Stoßvorrichtung besteht. Kühlen Sie unterdessen flüssiges Ethan in einer Glasflaschen-Stoßvorrichtung mit flüssigem Stickstoff; montieren Sie die Stoßgefriervorrichtung auf die manuelle Schwerkraft-Stoßvorrichtung. Verwenden Sie anschließend eine Pinzette, um die Klemmen am Gitterrand festzuklemmen.

Geben Sie 2,5 µL einer vorgefertigten Proteinslösung auf die Kohlenseite des Rasters. Danach bringen Sie die Pinzette mit der Kohlenseite des Rasters nach außen auf den Kolben auf. Fügen Sie 3 µL Puffer mit niedriger Salzkonzentration zur Rückseite des Rasters hinzu.

Blottern Sie das Raster unverzüglich mit einem Stück Filterpapier auf derselben Seite ab. Halten Sie die gesamte Rückseite des Rasters etwa sechs Sekunden lang eng an das Filterpapier angepresst. Nach dem Entfernen des Filterpapiers tauchen Sie das Raster sofort in flüssiges Ethan ein.

Entfernen Sie schließlich die Pinzette vom Kolben und übertragen Sie das Gitter schnell in eine Gitteraufbewahrungsbox. Beginnen Sie die Kryo-Elektronenmikroskopie, indem Sie das gefrorene, hydratisierte Gitter in ein FEI Polara G2-Elektronenmikroskop laden, das bei 200 Kilovolt betrieben wird und mit einer Gatan 4K × 4K CCD-Kamera ausgestattet ist.

Im Suchmodus mit niedriger Dosis eine Vergrößerung von etwa 200× hinzufügen. Das gesamte Gitter nach Bereichen mit geeignetem Eis absuchen. Die Positionen dieser Bereiche in einer Stufen-Datei speichern.

Rufen Sie die gespeicherten Positionen auf und untersuchen Sie diese Bereiche weiter. Wählen Sie eine Vergrößerung von 3.900× im Niedrigdosis-Suchmodus. Wählen Sie die Bereiche mit gleichmäßigem, dünnem Einfrieren für die Datensammlung aus, die dadurch gekennzeichnet sind, dass lange Röhren über einer Öffnung schweben.

Speichern Sie alle Bereiche in einer Zweitstufen-Datei. Wechseln Sie in den Belichtungsmodus. Fügen Sie eine Vergrößerung von 59.000 x hinzu und setzen Sie eine 100-Mikrometer-Objektivblende ein.

Danach die Objektivstigmatie und Strahlintensität so einstellen, dass eine Dosis von etwa 15 Elektronen pro Ångström Quadrat pro Belichtung erreicht wird. Zur Niedrigdosis-Suchansicht zurückkehren und zu einer gespeicherten Position wechseln. Einen geeigneten Tubulus identifizieren und zentrieren.

Stellen Sie mithilfe der CCD-Kamera auf den Fokusmodus um, justieren Sie den Fokus und stellen Sie normalerweise einen Defokuswert zwischen 0,5 und 2,5 Mikrometern ein. Schalten Sie dann in den Belichtungsmodus und stellen Sie eine Belichtungszeit von 0,3 bis 0,5 Sekunden für eine Dosis von 15 Elektronen pro Quadratangstrom ein. Sammeln Sie die Bilder mit einer Plattenkamera, wobei die Filme vor der Belichtung 10 Sekunden lang ruhen sollen.

Nach der Aufnahme der Bilder wechseln Sie zur nächsten gespeicherten Position und wiederholen diesen Vorgang, um weitere Bilder aufzunehmen. Entwickeln Sie die Filme 12 Minuten lang in voller Konzentration mit D 19. Anschließend digitalisieren Sie die Bilder mithilfe eines Nikon Super cool scan 9,000 ED-Scanners mit einer Pixelgröße von 6,35 Mikrometern.

Ein helikales Objekt kann durch zwei Parameter indiziert werden: die Besselordnung N und die Schichtliniennummer L in der Fourier-Transformation des Oberflächengitters eines helikalen Objekts. Jede Schichtlinie wird durch N und L charakterisiert und entspricht einer Menge von Linien auf dem Oberflächengitter, gekennzeichnet durch die Indizes H und K.

Um mit der helikalen Indizierung zu beginnen, verwenden Sie das Programm Helix boxer von Iman, um ein relativ langes und gerades Rohr mit gleichmäßigem Durchmesser auszuwählen und das Bild im MRC-Format zu speichern. Anschließend messen Sie den Radius des Rohrs mithilfe des Programms boxer von Iman. Bestimmen Sie den HEL-Wiederholungsabstand unter Verwendung eines auf Kreuzkorrelation basierenden Programms wie I-M-G-C-C-F im MRC-Paket.

Berechnen Sie dann die Eingangshalle. Transformieren Sie mit einer neuen Kastenlänge, die ein Vielfaches der Wiederholungsdistanz ist. Wählen Sie anschließend zwei Haupt-Ebenenlinien aus, die zwei grundlegende Gittervektoren der Oberfläche definieren, und zwar „eins null“ und „null eins“ in Einheiten von FFT-Pixeln.

Bestimmen Sie die Schichtliniennummern sowie die Radien der maximalen Amplitude für die beiden Haupt-Schichtlinien in der Fourier-Transformation. Aus den Schichtliniennummern und den Werten der Bessel-Ordnungen für die beiden Haupt-Schichtlinien können unter Verwendung der Auswahlregel, wie im schriftlichen Verfahren beschrieben, die Rotation zwischen den Untereinheiten und der axiale Anstieg der Ein-Stern-Helix ermittelt werden. Diese beiden reellen Zahlen beschreiben die Schraubensymmetrie des Rohrs.

Die 3D-Rekonstruktion beginnt mit der Partikelsegmentierung mithilfe des Iman-Programms Boxer. Nachdem ein Mikrograf mit helikalen Partikeln geöffnet wurde, schneiden Sie im Steuerfeld von Boxer einen Partikel in überlappende Segmente. Wählen Sie den Helix-Modus und stellen Sie die Parameter für das Einrahmen ein.

Die Größe der Box sollte größer als der Durchmesser des Partikels sein, und der Wert für OLA sollte etwa 90 % der Boxgröße betragen. Nach einem Klick auf eines der Enden des Partikel-Boxers wird automatisch eine Reihe von Partikelboxen entlang der Helixlänge generiert; zudem werden die boxed Segmente sowie ihre Koordinaten gespeichert. Der nächste Schritt besteht darin, eine initiale 3D-Rekonstruktion mithilfe der iterativen helikalen Rekonstruktion im reellen Raum (I-H-R-S-R) durchzuführen, bevor die Verarbeitung mit I-H-R-S-R erfolgt.

Stellen Sie den Kontrast der Kryo-EM-Bilder um und wenden Sie eine TIEFPASS-Filterung an. Öffnen Sie dann die grafische Oberfläche des I-H-R-S-R-Programms, indem Sie generator eingeben. Geben Sie der grafischen Oberfläche alle erforderlichen Informationen für den Stapel der markierten Partikel an, einschließlich Name und Pfad des Stapels, Anzahl der Bilder im Stapel sowie der Werte für die Symmetrieparameter.

Klicken Sie auf die Schaltfläche „Fertig stellen“, um das Rekonstruktionsskript zu erstellen. B 25 SP.I verwende einen Voll- oder Hohlzylinder als initiale Referenz und lasse den Vorgang so lange zyklisch durchlaufen, bis sich die definierte Schraubensymmetrie nicht mehr ändert, was üblicherweise nach wenigen Zyklen der Fall ist. Eine rechtsdrehende Helixsymmetrie sollte eine stabil konvergierte Rekonstruktion ergeben.

Die in der letzten Zyklen erzeugte Rekonstruktion wird als anfänglicher Referenzwert für weitere Verfeinerungen verwendet. Führen Sie abschließend eine 3D-Rekonstruktion mit iterativer Verfeinerung durch, wobei die durch I-H-R-S-R erzeugte 3D-Dichtekarte als anfänglicher Referenzwert für zusätzliche Verfeinerungen während der Verfeinerung dient. Die helikale Symmetrie ist auf die Rotation zwischen den Untereinheiten und den axialen Anstieg festgelegt, die aus dem I-H-R-S-R-Verfahren bestimmt wurden.

Als Nächstes bestimmen Sie die im Mikrograf vorhandene Defokussierung und das Astigmatismus mit den Programmen CTF find three und CTF tilt unter Verwendung von SPIDER-Programmen, die als FT und mu bezeichnet werden. Multiplizieren Sie Partikelsegmente mit der Kontrastübertragungsfunktion, abgekürzt CTF, und führen Sie eine Projektionsanpassung durch, indem Sie Projektionen der Referenzvolumina mit den CTF-korrigierten Bildern unter Verwendung einer Multi-Referenz-Ausrichtung vergleichen. Die Variation des Aus-der-Ebene-Tiltwinkels ist auf plus oder minus 10 Grad begrenzt und in Ein-Grad-Schritten abgetastet; dabei werden Nebenbedingungen eingeführt, wie hohe Korrelationskoeffizienten für Neigungswinkel nahe null Grad oder 180 Grad sowie begrenzte X-Verschiebungen.

Fügen Sie für die Alignierungsparameter jedes Segments nur die Segmente in die Rekonstruktion ein, die die Beschränkungen erfüllen. Nach jedem iterativen Verfeinerungszyklus wird eine 3D-Rekonstruktion mittels Rückprojektion erzeugt und durch einige über das CTF-Quadrat dividiert, um die helikale Symmetrie anzuwenden und ein symmetrisches Volumen zu erzeugen. Die iterative Verfeinerung wird beendet, wenn keine weitere Verbesserung der Auflösung der neuen 3D-Rekonstruktion mehr auftritt.

Eine einzelne HIV-1-Kapsid-Assembly, eine 92-e-Röhre, wurde ausgeschnitten und ihre Fourier-Transformation zur Helix-Indexierung berechnet; dabei wurden die beiden Radien, die Schichtliniennummern sowie die Radien der maximalen Amplitude für die Schichtlinien 10 und 01 bestimmt. Die Endwerte von −12 und 11 wurden anschließend für 10 bzw. 01 berechnet, bei einer Wiederholungsdistanz von 5195,48 Ångström. Die Schraubensymmetrie der Röhre wurde als ΔZ = 6,81 Ångström und Δφ = 328,88 Grad ermittelt; ΔZ und Δφ wurden mittels I-H-R-S-R auf 7,13 Ångström und 328,86 Grad verfeinert, und nach 10 iterativen Zyklen wurde eine erste Rekonstruktion erstellt.

Die endgültige Rekonstruktion nach iterativer Verbesserung zeigte eine deutliche Verbesserung der Dichtekarte im Vergleich zum anfänglichen Modell, das mit I-H-R-S-R berechnet wurde. Die Dichtekarte der Kapsid-Assemblierungsröhren wird als drei orthogonale Schnittebene angezeigt, die parallel zur Röhrenachse und nahe der Oberfläche, senkrecht zur Röhrenachse sowie parallel und entlang der Röhrenachse verlaufen. Die dargestellte Struktur ergibt sich aus der Oberflächen-Darstellung der 3D-Dichtekarte, die bei 1,8 Sigma konturiert ist und 100 % des Volumens einschließt.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein sehr gutes Verständnis dafür haben, wie man mithilfe der Kryo-Elektronenmikroskopie eine dreidimensionale Struktur eines in Lösung assemblierten Moleküls erhält.