Name: Ex-vivo-Imaging von T-Zellen in Murine Lymph Node Slices mit Weitfeld und konfokale Mikroskope (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Lernen Sie ein Ex-vivo-Imaging-Verfahren für T-Zellen in murinen Lymphknotenschnitten mit Weitfeld- und konfokaler Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Analysen der T-Zellmigration.

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Die Autoren bedanken sich bei Dr. Alain Trautmann, der uns zu Lymphknoten-Scheiben durchzuführen ermutigt danken. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse aus dem Ligue Nationale Contre le Cancer, der Fondation pour la Recherche Médicale en France und die Association pour la recherche sur le Cancer unterstützt.

1. Vorbereitung Scheiben von Lymphknoten <ol><li> Bereiten Sie eine 4% niedriger Schmelzpunkt Agarose-Lösung für die Einbettung. Verdünnen Agarose in PBS und Mikrowelle dieser Lösung. Wenn der Agarose vollständig gelöst ist, warten die Lösung bei 37 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Bereiten Sie eine 6-well Gewebekulturplatte. Fügen Sie 1,1 ml RPMI komplettem Kulturmedium pro Vertiefung, und fügen Sie ein organotypischen Filter in jede Vertiefung. Legen Sie die 6-Well-Platte bei 4 ° C bis zu seiner Scheiben übertragen. </li><li> Legen Sie Unterlegscheiben aus Edelstahl, mit einem Innendurchmesser von 4 mm, in einer Plastikschale mit RPMI komplett gefüllt ist. Unterlegscheiben weiter verwendet werden, um die Zellen auf der Vibratom Anschnitt zu konzentrieren. </li><li> Sacrifice der Maus in Übereinstimmung mit den örtlichen Tierschutzvorschriften. Entfernen Sie vorsichtig den peripheren Lymphknoten aus dem umgebenden Gewebe und legen Sie sie in einer Plastikschale mit eiskaltem PBS. Es ist darauf zu achten, dass die Lymphknoten Struktur beschädigt werden, da diese Organe sehr weich sind. </li><li> Gießen Sie die 4%-igen Agarosegel in eine 35-mm-Kunststoff-Schale und zart Übertragung der Knoten in das Gel. Lassen Sie das Agarosegel auf Eis für 5 min zu verhärten. </li><li> Entfernen Sie den Block aus der Schale und schneiden Sie die Agar um 3-5 mm Gel um jeden Lymphknoten zu verlassen. </li><li> Befestigen Sie den eingebetteten Knoten auf der Probe Festplatte des Vibratom mit ungiftigen Gewebekleber. Installieren Sie die Probe Festplatte in das Fach mit eiskaltem PBS gefüllt. </li><li> Section der Agar-eingebetteten Gewebe bei 320 mu m Dicke mit dem Vibratom Geschwindigkeit auf einem langsamen Bereich eingestellt (0,3 mm / s) und die Schwingungsfrequenz auf einem mittleren Bereich (1,5 mm) eingestellt. </li><li> Sorgfältig Transfer Lymphknoten Scheiben, wie sie sein auf der organotypischen Kultur Inserts mit feinen Pinzetten geschnitten werden. Platz 3 Scheiben auf jeder Einsatz. Seien Sie sehr vorsichtig, als Scheiben leicht beschädigt werden kann. Eine typische periphere Lymphknoten wird Ausbeute 5 Abschnitte, wenn sie bei 320 um geschnitten. Entsorgen Sie die erste und letzte Scheiben, als sie enthalten nur oberflächliche Gewebe. </li><li> Legen Sie Unterlegscheiben aus Edelstahl auf jedem einzelnen Stück. Stellen Sie sicher, Unterlegscheiben sind auf dem Agarose umgebende Gewebe positioniert. </li><li> Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C in einer 5% CO 2 befeuchteten Inkubator bis ready-to-Plate-T-Zellen. </li></ol> 2. Isolating T-Zellen aus der Maus Lymphknoten <ol><li> Isolieren T-Zellen nach dem zuvor veröffentlichten JoVE Artikel 3. </li><li> Verwenden Sie T-Zellen sofort und gehen zum nächsten Abschnitt. Andernfalls könnte Lymphozyten über Nacht in komplettem RPMI-Medium mit 10 ng / ml IL-7 ergänzt kultiviert werden. </li></ol> 3. Kennzeichnung von isolierten T-Zellen <ol><li> Wash-Zellen in HBSS. Resuspendieren sie in dem gleichen Puffer bei 10 x 10 6 pro ml. </li><li> Fügen Sie das gleiche Volumen HBSS mit 1 uM Zelle Tracker grünen CMFDA eine endgültige Konzentration von 0,5 uM. </li><li> Inkubieren Sie die Zellsuspension bei 37 ° C während 5 min. Wash Zellen zweimal mit komplettem RPMI-Medium. </li><li> Die Zellen in einer Endkonzentration von 10 x 10 6 pro ml in komplettem RPMI-Medium. Diese markierten Zellen werden auf die Scheiben beschichtet werden. </li></ol> Andere fluoreszierende Farbstoffe als CMFDA könnte auch genutzt werden, aber bedenken Sie, dass diese Moleküle potentiell toxischen oberhalb bestimmter Konzentrationen sind. 4. Plating markierten T-Zellen auf Lymphknoten-Scheiben <ol><li> Entfernen Sie überschüssiges Medium in den inneren Teil der Scheibe mit einer Pipette enthalten. Nicht in das Gewebe trocken werden, die Arbeit schnell bei diesem Schritt. </li><li> Gently verzichten 10 bis 20 ul markierten T-Zellen, die 1 bis 2 x 10 5 Zellen in den inneren Teil der Scheibe entspricht. Vorsicht ist geboten, um das Gewebe mit der Spitze der Pipette berühren. Achten Sie darauf, dass der Rückgang der Zellsuspension in Ort und Stelle bleibt. </li><li> Legen Sie die Schnitte mit Zellen im Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2 für mindestens 30 min, damit Lymphozyten in das Gewebe zu migrieren. </li></ol> 5. Imaging-T-Zellen im Lymphknoten Scheiben In diesem Video-Beitrag, wir Bild fluoreszierenden T-Zellen in Lymphknoten Scheiben mit einem Weitfeld inversen Mikroskop und einem konfokalen Mikroskop aufrecht. <ol><li> Stellen Sie die Temperatur bei 37 ° C. Unsere Mikroskope sind mit kontrollierter Temperatur Kammern ausgestattet. </li><li> Installieren Sie eine Perfusion System ermöglicht kontinuierliche Perfusion des Lymphknotens Scheibe mit Sauerstoff (5% CO 2, 95% O 2) Phenolrot-freiem RPMI-Medium. In unserem System gibt perfundierten Medien in der Imaging-Kammer von einer Seite durch die Schwerkraft. Das Medium wird mit einer Pumpe verbunden zu einer Sammelstelle Kolben gesaugt. Legen Sie die Medien Durchfluss auf 1 ml / min. </li><li> Mit feinen Pinzette vorsichtig herausnehmen Scheibe aus dem 6-Well-Platte und tauchen die Vorbereitung in erwärmt Sauerstoff RPMI-Medium für ein paar Sekunden, um loszuwerden, fluoreszierende Zellen nicht in das Gewebe infiltriert. </li></ol> ImaGing T-Zellen mit einem Weitwinkel-inversen Mikroskop <ol start="4"><li> Platzieren Sie die Scheibe nach oben auf eine maßgeschneiderte Imaging Kammer, die von Nylonfäden auf den inneren Teil einer Glasboden Teller geklebt besteht. In dieser Kammer, heben die Nylonfäden die Scheibe aus dem Glas und aktivieren Sie die Sauerstoff-Lösung in das Gewebe diffundieren. Dies ist erforderlich, da T-Zell-Migration in den Lymphknoten ist stark abhängig von Sauerstoff. Befestigen Sie die Scheibe, indem auf sie ein Edelstahl-Unterlegscheibe. Unter diesen Bedingungen liegt die Scheibe wenige Mikrometer über dem Boden der Schale, die Erneuerung der Perfusionslösung erleichtert. </li><li> Um eine Aufnahme zu großes Sehfeld (800 x 800 um etwa ein Drittel des Knotens Scheibenoberfläche), sammeln Sie Bilder mit einem 10x-Objektiv trocken. Wir fanden, dass die 10x Nikon S fluor 0,5 nA am besten geeignet für unsere Analysen war. </li></ol> Ein typisches Zeitraffer-Imaging-Experiment erfasst 5 optischen Flächen überspannt eine Gesamttiefe von 50 um in axialer (z) Dimension. Fluorescent T-Zellen sind in der Regel in Abständen zwischen 10 bis 30 Sekunden, während 10 bis 20 min belichtet. Imaging-T-Zellen mit einem konfokalen Mikroskop aufrecht Das konfokale Mikroskop im Sinne dieses Protokolls ist ein Leica SP5 mit einem 20x Wasser Immersionsobjektiv (Olympus, 20x/0.95 NA) ausgestattet. <ol start="6"><li> Befestigen Sie die Scheibe auf die Bildgebung des Mikroskops. Hinweis: Wir in der Regel statt einer Scheibe auf die Vorbereitung, um es zu fixieren. </li><li> Set ein bildgebendes Sitzung durch das Sammeln von einer Reihe von Bildern entlang der z-Achse. Um Bild-T-Zellen in intaktem Gewebe-Struktur, ist die Startposition in der Regel bei 5 bis 10 mu m unterhalb der ersten markierten T-Zellen gesetzt. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Durch Einhalten dieses video-Protokoll sollten Sie erwarten, dass eine große Anzahl von fluoreszierenden T-Zellen in der T-Zone des Knotens, ein Phänomen, das normalerweise in diesem besonderen Umfeld, in vivo (Abbildung 1) angesammelt zu visualisieren. Insbesondere sollte T-Zellen aus B-Zell-Zonen, die in der Regel sind nur unter der Kapsel ausgeschlossen werden. Ein erfolgreiches Experiment wird auch in T-Zellen in das Gewebe (Abbildung 2) rekrutiert Ergebnis und zeigt eine sehr bewegliche Verhalten (Abbildung 3) im Einklang mit publizierten Ergebnissen in intakten Lymphknoten 4 erhalten. Im Durchschnitt sollte die mittlere Geschwindigkeit der einzelnen T-Zellen innerhalb von Scheiben in der Nähe von 10 pm / min (Abbildung 4). <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. T-Zellen reichern sich in einem Lymphknoten in Scheiben schneiden. Fluoreszenzmarkierten T-Zellen (CMFDA, grün) zu einem Lymphknoten Scheibe 30 min vor der Bildaufnahme (Bild oben) wurden hinzugefügt. Das Bild ist die maximale Projektion von 5 Bilder für mehr als 50 mu m in z-Richtung. Die Hellfeldbild ist in unten dargestellt. Die Bilder wurden mit einem Weitfeld-Mikroskop aufgenommen. <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. T-Zellen werden in einem Lymphknoten Scheibe rekrutiert. Fluoreszenzmarkierten T-Zellen (CMFDA, grün) zu einem Lymphknoten Scheibe 30 min vor der Bildaufnahme mit einem konfokalen Mikroskop wurden hinzugefügt. Die Bilder wurden an der Schnittfläche (Bild oben) und 40 um unten (Bild unten) erfasst. <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. T-Zellen sind sehr beweglich in einem Lymphknoten in Scheiben schneiden. Fluoreszenzmarkierten T-Zellen während 12 min mit einem Weitfeld-Mikroskop wurden abgebildet. Flugbahnen der einzelnen T-Zellen werden als farbcodierte Tracks angezeigt zu erhöhen Verschiebungen von blau (geringe bewegliche Zellen) bis rot (hoch bewegliche Zellen) repräsentieren. Tracks wurden mit Imaris Software. Die weiße Linie folgt der Kante des Knotens, während die gestrichelten Oval begrenzt die vermeintliche B-Zell-Zone. <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Innerhalb einer Lymphknoten-Scheibe, wird die T-Zell-Geschwindigkeit in der Nähe von 10 pm / min. Die Geschwindigkeiten wurden mit Imaris Software von Tracks in Abbildung 3 dargestellt.

<ol><li>Asperti-Boursin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR7+ligands+control+basal+T+cell+motility+within+lymph+node+slices+in+a+phosphoinositide+3-kinase-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase-independent manner.</a> J Exp Med. 204, 1167-1167 (2007).</li>
<li>Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+oscillations+regulate+thymocyte+motility+during+positive+selection+in+the+three-dimensional+thymic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment.</a> Nat Immunol. 6, 143-143 (2005).</li>
<li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+CD4%2B+T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1869 (2002).</li>
<li>Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+contribution+of+chemotaxis+and+substrate+restriction+to+segregation+of+immature+and+mature+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes.</a> Immunity. 31, 986-986 (2009).</li>
<li>Gollmer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL21+mediates+CD4%2B+T-cell+costimulation+via+a+DOCK2%2FRac-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CCL21 mediates CD4+ T-cell costimulation via a DOCK2/Rac-dependent pathway.</a> Blood. 114, 580-580 (2009).</li>
</ol>

Wir haben eine einfache, schnelle und robuste Technik zur Erzeugung von Lymphknoten Scheiben, die verwendet werden, um das Verhalten der eingeführten T-Zellen zu untersuchen beschrieben sind. In den letzten Jahren wurde diese Methode erfolgreich angewendet mit Thymus-und Lymphknoten-Scheiben an die extrazelluläre Faktoren, die T-Zell-Positionierung und Beweglichkeit 1,5 identifizieren. Es wurde auch verwendet, um Ca 2 + Antworten in Thymozyten messen während positive Selektion und in T-Zellen auf Antigen-Erkennung 2,6. Die Overlay-Scheibe-Test zeigt Vor-und Nachteile, die diskutiert werden sollten. Zu beachten ist, erlaubt dieses System den Zugriff auf das Gewebe, nützlich, wenn man braucht, um Scheiben pharmakologisch zu manipulieren, um mit der molekularen Kontrolle der Zellmigration stören. Im Anschluss an Bildgebung, können die Scheiben für die Immunhistochemie verarbeitet werden, um weitere Informationen über die Strukturen, die abgebildet sind zu sammeln. Darüber hinaus kann die Beobachtung mit einem traditionellen Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop vorgenommen werden. Obwohl die Auflösung nicht so gut wie mit einem konfokalen oder ein Zwei-Photonen-Mikroskop und daß Phototoxizität ist grundsätzlich schwerer mit Ein-Photonen als mit Zwei-Photonen-Mikroskopie, hat es den Vorteil der Einfachheit, niedrigere Kosten und größere Auswahl von Anregungswellenlängen. Die Abbildung von T-Zellen in einer intakten Lymphknoten erfordert intravenöse Injektion von markierten Lymphozyten, die anschließend nach Hause zu lymphatischen Organen. Wie wir bereits 1 gezeigt haben, ist die Scheibe Assay vollkommen kompatibel mit adoptiven Transfer zu experimentieren. Allerdings kann die Länge der Zeit für T-Zellen nach Hause in die Lymphknoten notwendig erschweren den Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen, dass eine Tendenz zur Undichtigkeit aus den Zellen im Laufe der Zeit haben. Dies ist der Fall der Ca 2 + Farbstoff Fura-2. Mit der schnellen Rekrutierung (&lt;30 min) von T-Zellen in das Gewebe, bietet die Scheibe Test die Möglichkeit, solche Farbstoffe verwendet werden. Schließlich hat diese Methode den großen Vorteil, auf T-Zell-Funktionen in verschiedenen menschlichen Geweben analysieren am Leben gehalten. Dieses experimentelle System stellt auch Einschränkungen, die man im Auge behalten werden müssen. Schaden mit dem Schneiden verbundenen beeinflussen können T-Zell-Funktion, vor allem im oberflächennahen Bereich des Gewebes in der Nähe der Schnittfläche. Um Zelltod innerhalb der Schicht zu beurteilen, haben wir den Fluoreszenzfarbstoff SYTOX grün, dass die Zellen dringt mit eingeschränkter Plasmamembran verwendet. Unsere Experimente zeigen, dass etwa 20% der gesamten Knotenpunkt Zellen, meist im oberflächennahen Bereich des Gewebes lokalisiert, fluoreszierend wurden mit diesem nuklearen Farbstoff markiert. Ein weiteres mögliches Problem mit dem Test wird die Fähigkeit der Scheiben, um wichtige lösliche Faktoren wie Chemokine zu behalten. Obwohl wir keinen Hinweis darauf, dass unsere Daten von solchen Problemen betroffen waren, da T-Zellen eine gute Beweglichkeit Anzeige innerhalb der Schicht haben, möchten wir die Bedeutung der bildgebenden T-Zellen in gesunde Regionen an mehreren zehn Mikrometern aus der Schnittfläche befindet Stress. Während diese mit traditionellen Mikroskopen (Weitfeld-oder konfokalen) wie in diesem Protokoll getan werden könnte, ist es wahrscheinlich, dass die Lymphknoten Scheibe Vorbereitung mit Zwei-Photonen-Imaging wird die räumliche Auflösung in der Tiefe zu erhöhen und die Phototoxizität kombiniert.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Konfokalen Mikroskop </td><td> Leica </td><td> SP5 </td><td></td></tr><tr><td> Vibratom </td><td> Leica </td><td> VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> Feine Pinzetten </td><td> World Precision Instruments </td><td> 14142 </td><td></td></tr><tr><td> 30 mm Kultur-Einsätze </td><td> Millipore </td><td> PICM0RG50 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Invitrogen </td><td> 61870010 </td><td> Vollständige RPMI-Medium wird durch Zugabe von 10% Hitze-inaktiviertem fetalem Kälberserum und Penicillin / Streptomycin gemacht </td></tr><tr><td> Hanks &#39;Balanced Salt Solution (HBSS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14170088 </td><td></td></tr><tr><td> Low Geliertemperatur Agarose, Typ VII-A </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0701 </td><td></td></tr><tr><td> Butyl Sekundenkleber, Vetbond </td><td> 3M </td><td> 1469 </td><td></td></tr><tr><td> Unterlegscheiben aus Edelstahl, 4 mm Innendurchmesser </td><td> Baumarkt </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Zell-Tracker grünen CMFDA </td><td> Invitrogen </td><td> C7025 </td><td></td></tr></tbody></table>

ex-vivo-imaging von t-zellen in murine lymph node slices mit weitfeld und konfokale mikroskope

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Naive T-Zellen kontinuierlich Verkehr zu sekundären lymphatischen Organen, einschließlich der peripheren Lymphknoten, um seltene Ausdruck Antigene. Die Migration von T-Zellen in Lymphknoten ist ein komplexer Prozess, der sowohl zelluläre und chemische Faktoren, einschließlich Chemokinen handelt. Kürzlich hat sich der Einsatz von Zwei-Photonen-Mikroskopie erlaubt T-Zellen in intakten Lymphknoten zu verfolgen und daraus einige quantitative Informationen über ihr Verhalten und ihre Interaktionen mit anderen Zellen. Zwar gibt es offensichtliche Vorteile einer in-vivo-System sind, erfordert dieser Ansatz eine komplexe und teure Instrumente und bietet nur begrenzten Zugang zu dem Gewebe. Zur Analyse des Verhaltens von T-Zellen innerhalb von murinen Lymphknoten, haben wir ein Stück Assay 1, ursprünglich von Neurobiologen gesetzt und vor kurzem auf murine Thymus transponierten 2. entwickelt. In dieser Technik werden fluoreszenzmarkierten T-Zellen nicht auf eine akut vorbereitet Lymphknoten Scheibe beschichtet. In diesem Video-Beitrag werden die Lokalisierung und die Migration von T-Zellen in das Gewebe in Echtzeit mit einem Weitfeld und einem konfokalen Mikroskop analysiert. Die Technik, die in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie bietet einen effektiven Ansatz zur Bild-T-Zellen in ihrer natürlichen Umgebung und Mechanismen, die T-Zell-Migration aufzuklären ergänzt.

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um Bild fluoreszierenden T-Zellen in Lymphknoten Scheiben eingeführt. Die Technik ermöglicht Echtzeit-Analysen der T-Zell-Migration mit traditionellen Weitfeld-Fluoreszenz-oder konfokalen Mikroskopen.

Ex-vivo-Imaging von T-Zellen in Murine Lymph Node Slices mit Weitfeld und konfokale Mikroskope

Naive T-Zellen wandern kontinuierlich in sekundäre lymphatische Organe, einschließlich peripherer Lymphknoten, um selten exprimierte Antigene zu detektieren. Die Migration ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, fluoreszierende T-Zellen in Lymphknotenschnitten mittels Weitfeld- und konfokaler Mikroskopie abzubilden. Dies wird zunächst erreicht, indem ein Lymphknoten von einer Maus entfernt und in Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt eingebettet wird. Anschließend wird der Knoten mit einem Vibratom in 320 Mikrometer dicke Schnitte geschnitten.Anschließend werden fluoreszenzmarkierte T-Zellen auf eine Lymphknotenschnittpräparat aufgebracht. Schließlich werden die in das Präparat eingewanderten T-Zellen mittels Weitfeld- und konfokaler Mikroskopie sichtbar gemacht. Letztendlich können Standbilder und Videosequenzen gewonnen werden, die zeigen, wie T-Zellen in den Lymphknoten rekrutiert werden und welche Art von beweglichem Verhalten sie im Lymphgewebe zeigen. Okay.Der Hauptvorteil dieser Techniken bei vorhandenem Metall, wie etwa der Zwei-Photonen-Mikroskopie und intakten Organen, liegt darin, dass die T-Zellen hier mit einem konventionellen Weißfeldmikroskop in einem dreidimensionalen System sichtbar gemacht werden können. Darüber hinaus erlauben die geringen Präparationsaufwände und der Zugang zum Gewebe. Beginnen Sie mit der Herstellung einer 4 %igen Lösung aus niedrigschmelzendem Agarose, indem Sie Agarose in PBS verdünnen und das resultierende Gemisch im Mikrowellenherd erwärmen, nachdem sich die Agarose vollständig aufgelöst hat.Halten Sie die Lösung bis zur Verwendung bei 37 Grad Celsius. Füllen Sie als Nächstes eine Plastikschale mit RPMI. Komplettes Kulturmedium und geben Sie Edelstahlringe mit Innendurchmessern von vier Millimetern in die Schale. Füllen Sie eine andere Schale mit eiskaltem PBS und geben Sie dann etwa 1,1 Milliliter RPMI vollständiges Kulturmedium pro Vertiefung in eine sechswellige Gewebekulturplatte. Setzen Sie einen organotypischen Filter in jede Vertiefung der sechswelligen Platte ein und stellen Sie die Platte bei vier Grad Celsius ab. Entfernen Sie vorsichtig die peripheren Lymphknoten aus dem umgebenden Gewebe einer euthanasierten Maus. Dissezieren Sie die Lymphknoten sorgfältig, da sie sehr weich sind. Es ist sehr wichtig, das gesamte Fettgewebe aus dem Präparat zu entfernen, da es für die Zellen sehr toxisch ist.Legen Sie die Lymphknoten in die Plastikschale mit dem PBS auf Eis. Gießen Sie nun das 4%ige Aro-Gel in eine 35-Millimeter-Plastikschale und überführen Sie die Knoten vorsichtig in das Gel. Stellen Sie danach das Aro für fünf Minuten auf Eis, um es zu verfestigen. Nachdem das Aro erstarrt ist, nehmen Sie den Block aus der Schale und schneiden Sie das Agar zurecht, sodass etwa drei bis fünf Millimeter Gel um jeden Lymphknoten verbleiben.Verwenden Sie anschließend einen ungiftigen Kleber, um die eingebetteten Knoten auf der Probenscheibe eines Vioms zu befestigen. Bringen Sie die Probenscheibe in das entnehmbare Fach des Vioms an und füllen Sie das Fach mit eiskalter PBS-Lösung. Stellen Sie die Vimo-Geschwindigkeit auf einen niedrigen Bereich und die Vibrationsfrequenz auf einen mittleren Bereich ein, und schneiden Sie das in Agar eingebettete Gewebe in einer Dicke von 320 Mikrometer. Entfernen Sie die erste Schnittfläche, da sie nur oberflächliches Gewebe enthält, und überführen Sie dann mit feiner Pinzette vorsichtig die Lymphknotenschnitte, während sie geschnitten werden, in die organotypischen Kulturinserts. Legen Sie Edelstahlringe auf jeden einzelnen Schnitt, wobei sichergestellt werden muss, dass die Ringe auf dem Agar liegen und das Lymphknotengewebe umgeben, aber nicht bedecken. Inkubieren Sie anschließend die Kulturplatte mit den Lymphknotenschnitten bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid.Während der Vorbereitung der T-Zellen für diesen Schritt verwenden Sie T-Zellen aus einer Übernachtkultur, die mit IL-7 ergänzt wurden und zuvor mittels CD4-positiver Kugelselektion unter Verwendung der Miltenyi-MAX-Reinigung isoliert wurden, wie in dem zuvor veröffentlichten JoVE-Artikel von Matthew und Callaghan beschrieben. Waschen Sie die T-Zellen fünf Minuten lang bei 300 × g und 20 °C in HBSS. Resuspendieren Sie sie anschließend in frischem HBSS bei einer Konzentration von 10 × 10⁶ Zellen pro Milliliter.Anschließend fügen Sie einen mikromolaren Cell Tracker Green C-M-F-D-A einem Röhrchen mit HBSS hinzu und mischen diese Lösung mit der Zelllösung, um eine Endkonzentration des Farbstoffs von 0,5 µM zu erreichen. Inkubieren Sie die Zellsuspension fünf Minuten bei 37 °C. Nachdem die Zellen anschließend zweimal fünf Minuten lang bei 300 × g und 20 °C mit komplettem RPMI-Medium gewaschen wurden, resuspendieren Sie die markierten T-Zellen in einer Endkonzentration von 10 × 10⁶ Zellen pro Milliliter.In frischem RPMI, komplettem Kulturmedium, entnehmen Sie die Lymphknotenschnitte aus dem Inkubator. Entfernen Sie das überschüssige Medium in der Mitte des Waschers mit einer Pipette, ohne das Gewebe zu berühren. Geben Sie mit der Pipettenspitze vorsichtig 10 bis 20 Mikroliter markierte T-Zellen in die Mitte des Waschers. Stellen Sie sicher, dass der Tropfen mit der Zellsuspension an seiner Position verbleibt. Inkubieren Sie die Schnitte und T-Zellen mindestens 30 Minuten lang, damit die Lymphozyten in das Gewebe einwandern können. Um mit der Bildaufnahme zu beginnen, stellen Sie die Temperaturkammer am Mikroskop auf 37 Grad Celsius ein.Füllen Sie ein Fusionssystem, um eine kontinuierliche Perfusionsversorgung der Lymphknotenschnittstelle mit mit Sauerstoff angereichertem, phenolrotfreiem RPMI-Medium zu ermöglichen, und erwärmen Sie gleichzeitig eine kleine Kunststoffschale mit mit Sauerstoff angereichertem RPMI. In dem hier gezeigten System strömt das perfundierte Medium durch Schwerkraft von einer Seite in die Abbildungskammer. Das Medium wird über eine Pumpe, die mit einer Abfallauffangvorrichtung verbunden ist, abgesaugt.Entnehmen Sie mit feinen Pinzetten die T-Zellen enthaltenden Lymphknotenschnitte aus dem Inkubator. Entfernen Sie vorsichtig einen Lymphknotenschnitt aus der 6-Well-Platte. Tauchen Sie den Schnitt für einige Sekunden in das erwärmte, mit Sauerstoff angereicherte RPMI-Medium, um fluoreszierende Zellen abzuwaschen, die nicht in das Gewebe eingewandert sind.Danach die frisch gewaschene Schnittprobe mit der Unterseite nach oben in die Abbildungskammer legen. Die Nylonfäden heben die Probe vom Glas ab und ermöglichen die Diffusion der mit Sauerstoff angereicherten Lösung in das Gewebe. Dies ist erforderlich, da die T-Zell-Migration in Lymphknoten stark von Sauerstoff abhängig ist.Befestigen Sie dann die Schnittfläche, indem Sie eine Edelstahlunterlegscheibe darauflegen, um ein großes Sichtfeld zu erfassen. Sammeln Sie die Bilder mithilfe eines 10-fachen Trockenobjektivs. Übertragen Sie die frisch gewaschene Lymphknotenschnittfläche mit der Schnittfläche nach oben in eine Kunststoffschale.Platzieren Sie eine Unterlegscheibe auf der Probe, um sie zu fixieren. Die Schnitte sind nun bereit zur Bildaufnahme. Befestigen Sie die Probe am Objekttisch des aufrechten konfokalen Mikroskops und fokussieren Sie mit dem 20-fachen Objektiv.Dann starten Sie eine Bildgebungssitzung und beginnen die Aufnahme. C-M-F-D-A. Markierte T-Zellen in grün wurden 30 Minuten vor der Bildaufnahme, wie hier gezeigt, einem Lymphknotenschnitt hinzugefügt. Die Aufnahme ist die maximale Projektion von fünf Bildern, die 50 Mikrometer in Z-Richtung umfassen und hier mit einem Weitfeldmikroskop aufgenommen wurden.Derselbe Ausschnitt ist in diesem Video als Hellfeldaufnahme zu sehen. Grüne fluoreszierende T-Zellen, die in eine Lymphknotenschnittscheibe eingewandert sind, wurden mit einem Weitfeldmikroskop neun Minuten lang aufgenommen. Die Animation stellt eine Z-Projektion über 50 Mikrometer dar.Beachten Sie die aktive Migration von T-Zellen innerhalb des Schnitts. Die Trajektorien einzelner T-Zellen aus dem gleichen Mikroskopfeld werden hier als farbkodierte Spuren dargestellt, um ihre zunehmende Beweglichkeit von blau (geringe Motilität) bis rot (hohe Motilität) zu veranschaulichen. Die Spuren wurden mithilfe eines Mars berechnet.Die weiße Linie zeigt den Rand des Lymphknotens an, während die gestrichelten Ovale die putativen B-Zell-Zonen abgrenzen. Hier wurden T-Zellen, die einer Lymphknotenschnittpräparation hinzugefügt wurden, 10 Minuten lang mit einem Konfokalmikroskop abgebildet. Die Animation stellt eine Z-Projektion über 50 Mikrometer dar.Ja, diese Technik kann an andere Gewebetypen angepasst werden. Interessant ist, dass das Schnittpräparat die einzige Möglichkeit darstellt, die Mechanismen der T-Zell-Migration und -Lokalisation in menschlichen Tumoren zu untersuchen. Zum Beispiel.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Zwei-Photonen-Imaging hat Lymphozyten Motilität und zellulären Interaktionen im Lymphknoten unter basalen Bedingungen und während einer Immunantwort Antwort 1 aufgedeckt. Hier zeigen wir, adoptiven Transfer von T-Zellen, Isolierung von Lymphknoten und Imaging-Motilität der CD4 + T-Zellen in der explantierten Lymphknoten.

Dissection und 2-Photonen-Imaging der peripheren Lymphknoten in Mäusen

Jüngste Fortschritte in der 2-Photonen-Mikroskopie sind in Echtzeit...

Bildgebung des dem Maus-Kniekehlen-Lymphknoten

Dieses Video beschreibt die Bildgebung von residenten tumorinfiltrierenden CD8-T-Zellen, die mit fluoreszenzgekoppelten Antikörpern in menschlichen Lungentumorschnitten markiert wurden. Diese Technik ermöglicht Echtzeitanalysen der Migration von CD8-T-Zellen mittels konfokaler Mikroskopie.

Echtzeit-Analyse der residenten T-Zell-Migration in verschiedenen Tumorregionen mittels konfokaler Mikroskopie

Hochauflösende intravitalen Bildgebung mit Kontrastverstärkung von bis zu 120 &amp;mgr; m Tiefe in Lymphknoten von erwachsenen Mäusen durch räumliches Modulieren des Erregungsmusters einer multifokalen Zwei-Photonen-Mikroskop erreicht. In 100 um Tiefe gemessen wir Auflösungen von 487 nm (lateral) und 551 nm (axial) und damit umgehen, Streuung und Beugung Grenzen.

Hochaufgelöste Intravitalmikroskopie Striped-Beleuchtung von Keimzentren

Die Mechanismen, die die interstitielle Motilität von CD4 Effektor T-Zellen an Entzündungsstellen bestimmen, sind relativ unbekannt. Wir stellen eine nicht-invasive Ansatz zu visualisieren und in vitro -geprimte CD4 - T - Zellen in den entzündeten Ohr Dermis, so dass für das Studium des dynamischen Verhaltens dieser Zellen in situ zu manipulieren.

Imaging CD4 T-Zell-Interstitial Migration in den entzündeten Dermis

Wir beschreiben hier ein transgenes Reporter-Mausmodell, um die IL-22-produzierenden Zellen in verschiedenen Mausgeweben sichtbar zu machen. Mit dieser Methode kann die Position anderer Zytokine oder Sekretärsproteine in der Maus verfolgt werden.

Visualisierung von IL-22-exprimierenden Lymphozyten unter Verwendung Reporter Mäuse

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um Bild resident Tumor infiltrieren CD8 T-Zellen beschriftet mit Gewebekulturen gekoppelten Antikörpern im menschlichen Lunge Tumor Scheiben. Diese Technik ermöglicht Echtzeit-Analysen von CD8 T Zelle Migration mit der konfokalen Mikroskopie.

Ex-Vivo Bildgebung von Resident CD8-T-Lymphozyten in menschlichen Lungentumor Scheiben mit konfokalen Mikroskopie

Das Ziel des Protokolls ist längs intravitalen Echtzeitverfolgung der Thymozyten durch Laser-scanning-Mikroskopie in der zebrafischembryonen Implantate in die Vorderkammer des Auges Maus zeigen. Die Transparenz der Hornhaut und Vaskularisierung des Transplantats ermöglicht kontinuierlich aufzeichnen Stammvater Zelle Rekrutierung und Reife T-Zell-Ausstieg.

Echtzeit- In Vivo Verfolgung von Thymozyten in die Vorderkammer des Auges durch Laser-Scanning-Mikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik, um verschiedene Zellpopulationen in entwässernden Lymphknoten ohne Veränderungen in der Organstruktur abzubilden.

Visualisierung der Lymphknotenstruktur und Zelllokalisierung mittels Ex-Vivo Konfokalmikroskopie

Wir beschreiben eine Methode zur Visualisierung von GFP-markierten IELs mit intravitaler Bildgebung des murinen Dünndarms durch invertierte Konfokalmikroskopie der Spinnscheibe. Diese Technik ermöglicht die Verfolgung von lebenden Zellen innerhalb der Schleimhaut für bis zu 4 h und kann verwendet werden, um eine Vielzahl von darmen immun-epitheliale Wechselwirkungen zu untersuchen.

Intravitale Bildgebung von intraepitheliale Lymphozyten im murinen Dünndarm

Die Kombination aus Antikörperkennzeichnung, optischer Lichtreinigung und fortschrittlicher Lichtmikroskopie ermöglicht die dreidimensionale Analyse kompletter Strukturen oder Organe. Hier wird eine einfache Methode beschrieben, um die Immunkennzeichnung dicker Nierenscheiben, die optische Reinigung mit Ethyl-Cinnamat und die konfokale Bildgebung zu kombinieren, die die Visualisierung und Quantifizierung dreidimensionaler Nierenstrukturen ermöglicht.

Optische Seimierung und Bildgebung von immunomarkiertem Nierengewebe

Lernen Sie ein Ex-vivo-Imaging-Verfahren für T-Zellen in murinen Lymphknotenschnitten mit Weitfeld- und konfokaler Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Analysen der T-Zellmigration.

Ex-vivo-Imaging von T-Zellen in Murine Lymph Node Slices mit Weitfeld und konfokale Mikroskope

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