Aseptische Labortechnik: Überzug Methoden

[Erzähler] Dieses Protokoll beinhaltet aseptische Techniken bei Anzuchtmethoden, die zur Isolierung, Vermehrung oder Zählung von Mikroorganismen wie Bakterien und Phagen verwendet werden. Zu den Verfahren gehören Strichverimpfungen bakterieller Kulturen zur Isolierung einzelner Kolonien, Gießplatten zur Bestimmung der Bakterienkonzentration und Aufstrichplatten zur Zählung lebensfähiger bakterieller Kolonien. Weiche Agarüberlagerungen dienen der Isolierung von Phagen und der Zählung von Plaques, während Abdruckverimpfungen Zellen von einer Platte auf eine andere in einem identischen räumlichen Muster übertragen. Letztendlich reichen die praktischen Anwendungen dieser Techniken zur Kultivierung von Mikroorganismen von der Identifizierung von Bakterien in Umgebungen bis hin zu technologischen Fortschritten in der molekularen Genetik und Hochdurchsatz-Bioassays.

– Personen, die mit diesen Ausstrichmethoden unerfahren sind, haben in der Regel Schwierigkeiten, da die Handgriffe sorgfältige und koordinierte Bewegungen erfordern, um Kontakt mit nicht sterilen Oberflächen zu vermeiden. Das Erlernen dieser Routineverfahren erfordert Schulung und Übung. Die Demonstration der Verfahren übernimmt meine Laborleiterin, Dr. Kris Reddi.

- [Erzähler] Beginnen Sie die Arbeit mit Mikroorganismen, indem Sie die Laborregeln und Sicherheitsvorkehrungen kennen, einschließlich der Biohazard-Klassifizierung, der Dekontamination und Entsorgung von Abfällen. Stellen Sie sicher, dass alle Geräte, Lösungen und Medien für die Ausplattierungsverfahren steril sind. Richten Sie außerdem einen aufgeräumten Arbeitsplatz ein und reinigen Sie ihn mit Desinfektionsmittel. Stellen Sie einen Bunsenbrenner mit einem an eine Gasleitung angeschlossenen Schlauch auf, ordnen Sie die benötigten Materialien an und beschriften Sie diese ordnungsgemäß. Waschen Sie anschließend gründlich Hände mit antiseptischer Seife und warmem Wasser. Befeuchten Sie zunächst die Hände mit warmem, fließendem Wasser, tragen Sie dann Seife auf und verteilen Sie sie gründlich. Reiben Sie die Hände kräftig, wobei Sie Reibung auf allen Flächen erzeugen, einschließlich Daumen, Finger- und Handrücken sowie unter den Fingernägeln. Spülen Sie anschließend gründlich, um die restliche Seife zu entfernen, und trocknen Sie die Hände mit aus einem Halter entnommenen Papiertüchern ab. Schalten Sie schließlich den Wasserhahn mit einem frischen Papiertuch aus. Das Strichstrich-Verfahren dient dazu, reine Kulturen von Bakterien oder Kolonien aus gemischten Populationen durch einfache mechanische Trennung zu isolieren. Entnehmen Sie eine Agarplatte aus einem Kühlschrank mit vier Grad Celsius und temperieren Sie sie auf Raumtemperatur vor. Wählen Sie ein Werkzeug aus dem Sortiment an Instrumenten zur Ausstrichplatten-Behandlung aus. Stellen Sie sicher, dass die Platte trocken ist und keine Kondensation auf dem Deckel vorhanden ist. Beschriften Sie den Boden einer Agarplatte am Rand. Wenn Sie geübt sind, verwenden Sie eine einzelne Platte für mehrere Proben. Zünden Sie dann einen Bunsenbrenner an, um die Metallöse zu flammen. Beginnen Sie drei bis vier Zoll von der Metallöse entfernt, indem Sie den Draht in die Spitze des blauen Kegels halten, dem heißesten Teil der Bunsenbrenner-Flamme. Wenn das Metall rotglühend ist, bewegen Sie den Draht so, dass die Flamme sich der Öse nähert. Zum Abkühlen der Öse berühren Sie den Rand des Agarmediums, wodurch ein Zischgeräusch entsteht. Nehmen Sie anschließend den Inokulum mit der Öse auf. Heben Sie die untere Hälfte der Platte an. Bewegen Sie die Öse im ersten Quadranten der Platte im Zickzackmuster vom Rand zur Mitte. Stellen Sie die umgedrehte Platte wieder auf den Deckel. Flammen Sie die Metallöse erneut. Drehen Sie die Petrischale um 90 Grad. Berühren Sie die Öse nahe dem Ende des letzten Strichs, verwenden Sie das Zickzackmuster, kreuzen Sie die letzte Hälfte der Striche im ersten Quadranten und bewegen Sie sich dann in den leeren zweiten Quadranten. Sobald der zweite Quadrant gefüllt ist, stellen Sie die Platte ab. Wiederholen Sie den Ausstrichvorgang für den dritten und vierten Quadranten, wobei Sie den Kontakt mit dem ersten Quadranten vermeiden. Bei der Ausstrichung mit einem sterilen, flachen Holzstäbchen halten Sie das schmale Ende vorsichtig zwischen Daumen und Ringfinger in einem Winkel von 10 bis 20 Grad zum Medium und verwenden das breite Ende, um die Quadranten auszustreichen. Drehen Sie die Platte zwischen den Quadranten wieder auf den Deckel und entsorgen Sie das Holzstäbchen ordnungsgemäß. Inkubieren Sie die ausgestrichenen Platten anschließend verkehrt herum. Das Gießplatten-Verfahren dient der Zählung der Gesamtanzahl koloniebildender Einheiten auf der Oberfläche und innerhalb des Agars einer einzelnen Platte. Stellen Sie einen Timer auf 10 Minuten, überführen Sie dann 18 Milliliter geschmolzenes Agarmedium aus einem Wasserbad mit 55 Grad Celsius in einen Wärmespeicher mit 48 Grad Celsius und lassen Sie es 10 Minuten lang einklimatisieren. Beschriften Sie den Boden einer sterilen Petrischale. Falls zutreffend, geben Sie den Verdünnungsfaktor an. Dispensieren Sie nun ein Milliliter Probe in die Mitte der Petrischale. Schließen Sie den Deckel. Entfernen Sie die Kappe vom Rohr mit geschmolzenem Agar und führen Sie den Rand des offenen Rohrs durch eine Flamme. Gießen Sie das Agar vorsichtig in die Petrischale. Schließen Sie den Deckel und mischen Sie die Probe mit dem Agar, indem Sie die Platte sanft schwenken. Warten Sie 30 Minuten, bis das Agar erstarrt ist. Sobald das Agar erstarrt ist, drehen Sie die Platte um und stellen Sie sie in einen warmen Raum. Beim Ausstreichen soll die Verteilung von Mikroorganismen innerhalb eines kleinen Probenvolumens bewirkt werden, sodass die resultierenden Kolonien gleichmäßig über die Agaroberfläche verteilt sind. Einklimatisieren Sie eine Platte auf Raumtemperatur und beschriften Sie sie entsprechend. Platzieren Sie die Platte auf dem Drehteller. Pipettieren Sie 0,1 Milliliter Probe in die Mitte des Agars und schließen Sie den Deckel. Entsorgen Sie die Pipettenspitze in einen Abbehälter. Tauchen Sie die Metallstange in einen Becher mit 70 %igem Ethanol, sodass der gesamte untere Teil des Ausstreichers und der erste Zoll des Stiels bedeckt sind, und lassen Sie sie abtropfen. Entzünden Sie überschüssigen Ethanol, indem Sie die Stange durch die Flamme eines Bunsenbrenners führen. Öffnen Sie anschließend den Deckel der Agarplatte und kühlen Sie den Ausstreicher, indem Sie ihn am Rand nahe der Peripherie auf das Agar setzen. Drehen Sie den Drehteller langsam. Halten Sie den Ausstreicher vorsichtig auf der Oberfläche des Agars und verteilen Sie die Probe gleichmäßig über die gesamte Platte mit einer Zickzackbewegung, während sich der Drehteller dreht. Schließen Sie den Deckel und lassen Sie die Probe mindestens fünf Minuten lang vollständig eindringen. Inkubieren Sie anschließend die umgedrehte Platte. Beschriften Sie zunächst die Agarplatte entsprechend. Öffnen Sie den Deckel der Agarplatte. Öffnen Sie dann den Behälter mit vorsterilisierten Glaskügelchen und flammen Sie den Rand ab. Geben Sie vorsichtig 10 bis 12 sterile Glaskügelchen auf eine Agarplatte. Schließen Sie den Deckel der Platte und flammen Sie den Rand des Glaskügelchenbehälters ab, bevor Sie die Kappe wieder aufsetzen. Pipettieren Sie nun die Probe in die Mitte des Agars. Schütteln Sie die Kügelchen im horizontalen Bewegungsablauf siebenmal sanft über die Oberfläche des Agars. Wenn dies korrekt ausgeführt wird, klingt der Vorgang wie das Schütteln von Maracas. Drehen Sie die Platte um 60 Grad und schütteln Sie erneut horizontal siebenmal. Drehen Sie die Platte erneut um 60 Grad und wiederholen Sie das Schütteln. Überprüfen Sie, ob die Probe vollständig eingezogen ist. Gießen Sie anschließend die kontaminierten Kügelchen in einen markierten Sammelbecher mit 10 % Chlorbleiche. Inkubieren Sie die umgedrehte Platte. Der Plaque-Assay wird häufig zur Detektion und Quantifizierung von Bakteriophagen verwendet. Kultivieren Sie die Indikatorbakterien bis zur exponentiellen Phase und lagern Sie sie auf Eis. Beschriften Sie anschließend zwei sterile Mikrozentrifugenröhrchen als Phage und Kontrolle und geben Sie jeweils 50 Mikroliter Phagenprobe oder Puffer hinein. Schwenken Sie anschließend die Bakterienkultur im Kolben, überführen Sie ein Aliquot Bakterien in ein steriles Röhrchen, vortexen Sie die Indikatorbakterien vorsichtig und geben Sie 500 Mikroliter Bakterien in jedes Absorptionsröhrchen. Mischen Sie durch vorsichtiges Anflicken der Röhrchen. Vortexen oder pipettieren Sie Phagenproben niemals heftig. Inkubieren Sie das Phagen-Bakterien-Gemisch bei einer für den Indikatorstamm geeigneten Temperatur 20 Minuten lang. Überführen Sie inzwischen zwei Weichagar-Röhrchen aus einem Wasserbad mit 55 Grad Celsius in einen Wärmespeicher mit 48 Grad Celsius. Lassen Sie sie 10 Minuten lang einklimatisieren. Beschriften Sie zwei kondensationsfreie Nährstoff-Agar-Platten, die zuvor auf Raumtemperatur vortemperiert wurden. Entnehmen Sie ein Weichagar-Röhrchen aus dem Wärmespeicher und prüfen Sie, ob der Inhalt nicht zu heiß zum Anfassen ist. Überführen Sie anschließend das Gemisch aseptisch aus dem Phagen-Absorptionsröhrchen in das Weichagar-Röhrchen. Drehen Sie das Röhrchen rasch zwischen den Handflächen, um den Inhalt zu mischen. Halten Sie das Röhrchen in einer Hand und öffnen Sie mit der anderen Hand den Deckel der harten Agarplatte. Gießen Sie sofort den gesamten Inhalt des Röhrchens auf die Oberfläche einer harten Agarplatte. Schwenken Sie die Platte rasch und sanft. Schließen Sie den Deckel und stellen Sie die Platte 30 Minuten lang waagerecht, bis der Weichagar erstarrt ist. Wiederholen Sie den Vorgang anschließend für das Kontroll-Absorptionsröhrchen, indem Sie das Kontrollgemisch in ein Weichagar-Röhrchen überführen, es mischen, den Inhalt auf eine harte Agarplatte gießen, diese schwenken und den Weichagar 30 Minuten lang erstarrten lassen. Prüfen Sie die Platten auf Plaque-Bildung. Um eine Plaque aus einer heterogenen Mischung zu isolieren, stechen Sie vorsichtig mit einem sterilen Holzstäbchen in das Zentrum und überführen das Inokulum in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 Mikroliter Phagenpuffer. Reinigen Sie diesen Lysat weiter, indem Sie den Plaque-Assay drei bis sechs Mal mit seriellen Verdünnungen wiederholen, falls erforderlich. Das Replikaplatieren nutzt ein selektierbares Phänotyp aus, indem es den Zellwachstumsvergleich zwischen einer Primärplatte und Sekundärplatten ermöglicht. Markieren Sie ein Raster auf der Unterseite der Platte, beschriften Sie die Primärplatte und nummerieren Sie die entstandenen Quadrate. Entnehmen Sie nun mit aseptischer Technik ein vorsterilisiertes Holzstäbchen aus dem Becher, tupfen Sie die Mitte jedes Quadrats mit einer Zellprobe an und entsorgen Sie das Holzstäbchen in einen geeigneten Abbehälter. Inkubieren Sie die Primärplatte. Stapeln Sie die Primärplatte und alle Sekundärplatten. Setzen Sie eine Orientierungsmarkierung an die Seite der unteren Hälfte der Platten. Entnehmen Sie nun ein steriles Samttuch aus der Verpackung und legen Sie es auf den zylindrischen Block. Platzieren Sie anschließend den Halter, wobei Sie die Markierungen am Halter mit denen am Block ausrichten. Beachten Sie die Orientierungsmarkierung am Block und am Halter. Entfernen Sie nun den Deckel der Primärplatte. Richten Sie die Orientierungsmarkierungen an Platte und Block aus. Senken Sie die Platte ab, sodass die Oberfläche des Agars mit dem Samttuch in Kontakt kommt. Drücken Sie mit den Fingerspitzen leicht, aber gleichmäßig auf die Rückseite der Primärplatte und heben Sie sie anschließend vorsichtig vom Block ab. Stellen Sie sicher, dass der Abdruck der Zellen auf dem Samt sichtbar ist. Setzen Sie den Deckel wieder auf die Platte. Wiederholen Sie nun nacheinander das Protokoll auf dem Samttuch mit jeder der Sekundärplatten. Verwenden Sie den Samt-Abdruck der Zellen von der Primärplatte, um bis zu acht Sekundärplatten in der Reihenfolge von der am wenigsten bis zur am meisten begünstigenden Substanz zu beimpfen. Verwenden Sie schließlich als positiven Kontrollversuch für die letzte Platte in der Serie ein Agarmedium, auf dem alle getesteten Stämme wachsen sollten. Verbinden Sie die umgedrehten Platten mit Klebeband und inkubieren Sie sie. Prüfen Sie die Sekundärplatten auf Wachstum. Schalten Sie den Bunsenbrenner aus und räumen Sie alle Materialien weg. Stellen Sie kontaminierte Laborkleidung, Glaswaren und gefährliche Abfälle in die dafür vorgesehenen Entsorgungsbehälter. Reinigen Sie den Arbeitsbereich mit Desinfektionsmittel. Waschen Sie abschließend gründlich Hände mit antiseptischer Seife und warmem Wasser. Serratia marcescens ist ein gramnegatives, stabförmiges Proteobakterium, das ein rötliches Pigment namens Prodigiosin produziert. Es tritt häufig in Badezimmern und an Duschvorhängen auf. In diesem Beispiel erzeugt die Strichstrich-Technik einzelne Kolonien im vierten Quadranten. Diese Analyse von Bakterien in einer Wasserprobe aus einem öffentlichen Trinkbrunnen verwendet die Gießplatten-Technik. Beachten Sie den Unterschied im Erscheinungsbild der Kolonien. Oberflächenkolonien sind groß und kreisförmig, während einige Oberflächenkolonien sehr klein und unregelmäßig geformt sind. Die Ausstreichplatten-Technik ist ein wichtiger Bestandteil von Anreicherungs-, Selektions- und Screening-Experimenten. Beispielsweise ist die Copacabana-Methode ein Differenzierungsverfahren im klassischen blau-weiß-Screen in der rekombinanten DNA-Technologie. Phage T4 ist ein virulenter, doppelsträngiger DNA-Phage, der seinen Wirt Escherichia coli infiziert, um diesen zu lysieren und Nachkommen-Phagen freizusetzen. Dieser Plaque-Assay auf EHA-Agar zeigt Phagen in klaren Zonen mit einem Durchmesser von etwa einem Millimeter. In Abwesenheit infizierender Phagenpartikel führt das bakterielle Wachstum zu einer trüben Zellsuspension im Weichagar, in der keine diskreten Kolonien sichtbar sind. Bei der Weichagar-Überzugstechnik variieren die Plaque-Morphologien. Beispielsweise erzeugt hier der gleiche Mycobacterium-Wirtsstamm unterschiedliche Plaque-Morphologien in Gegenwart von Mycobacterium-Phagen „Destroyers“ im Vergleich zu Mycobacterium-Phagen MSSS. Die Stärke des Replikaplatierens liegt in der gleichzeitigen Untersuchung einer großen Anzahl von Mikroorganismen. In diesem Fall wurden vier Pseudomonas-Stämme dupliziert auf drei verschiedene Kohlenstoffquellen getestet: Acetamid, Lactose und Glycin. Hier ist die Primärplatte ein komplettes YTA-Medium, das mit den vier Stämmen wie angegeben beimpft wurde. Die Stämme zeigen variable Wachstumsmuster auf Replikaplatten aus minimalem MSA-Medium, das mit einer einzelnen Kohlenstoffquelle – Acetamid, Lactose oder Glycin – ergänzt wurde. Alle Stämme wachsen auf der letzten positiven Kontrollplatte, was bestätigt, dass die Zellen in dieser Serie auf alle Sekundärplatten übertragen wurden. Die tabellarische Auswertung dieser Replikaplatte-Ergebnisse zeigt die gleichzeitige Untersuchung verschiedener Wildtyp-Stämme hinsichtlich ihrer charakteristischen Wachstumsanforderungen.

– Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür entwickelt haben, wie man Ausstrichverfahren durchführt, ohne Medien oder Kulturen zu kontaminieren, und wie man die geeignete Ausstrichmethode für eine gegebene experimentelle Aufgabe im Labor auswählt. Die Beherrschung dieser Techniken erfordert Übung. Mit ausreichender Schulung werden die in diesem Video beschriebenen Ausstrichverfahren jedoch beim Arbeiten am Laborplatz zur Selbstverständlichkeit.