Name: Platzieren Growth Factor-Coated Perlen auf Early Stage Hühnerembryonen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Erfahren Sie die Platzierung wachstumsfaktorbeschichteter Perlen auf Hühnerembryonen im Frühstadium. Diese in-ovo-Methode ermöglicht präzise Manipulationen zur Untersuchung von Zellfate-Determinierung.

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1. Entfernen Sie Eier aus dem Inkubator Bei E2-2.5 (~ St. 17 HH), entfernen Sie die Eier und bereiten sie entsprechend. Sie können sofort oder arbeitete wieder in den Inkubator für ein paar Stunden. Die Eier können bei Raumtemperatur vorgelegt sicher über eine Stunde. Eier können draußen bleiben für die Dauer der Manipulationen. Manchmal sind diese kann eine Stunde oder mehr. Hinweis: Je länger sie sitzen bei Raumtemperatur, desto weniger wahrscheinlich werden sie überleben. 2. Vorbereitung der Tusche <ol><li> Bereiten Sie eine frische Lösung von 4% Tusche in sterile PBS. </li><li> Füllen Sie ein 3-ml-Spritze mit der Lösung. </li><li> Legen Sie eine 27-Gauge-, ½ Zoll-Nadel auf die Spritze. </li><li> Mit einem Paar Hämostatika, biegen Sie die Nadel in einem 90 ° Winkel. </li></ol> 3. Das Öffnen der Eier und Injektion von Tusche <ol><li> Mit einer Pinzette, schälen Sie das Band ab und öffnen Sie das Fenster, denn es sicherte, indem Sie die Rückseite des Bandes auf der Rückseite des Eies. </li><li> Guide in den abgewinkelten Nadel, bis es gerade liegt unterhalb des Embryos. Platzierung der Nadel unter die schwebende Scheibe sicher, dass die Tinte, die giftig für den Embryo ist, wird nicht in direkten Kontakt kommen. </li><li> Sie müssen sich nur genügend Tinte spritzen, um einen angenehmen Kontrast zu schaffen. Dieser ist in der Regel weniger als ¼ mL. </li></ol> 4. Eröffnung des Neuralrohrs <ol><li> Nehmen Sie ein Paar von feinen Sezierung Schere und schnitt die dünne Membran, die auf der Oberseite liegt, oder manchmal herum, den Embryo. </li><li> Nehmen Sie ein Paar von 55 Zange oder einer Wolfram-Sonde und öffnen Sie das Neuralrohr von posterior nach anterior. Achten Sie darauf, die Öffnung ist groß genug, um eine Perle darin Platz. </li></ol> Hinweis: Je nach Alter, ein feines Wolfram Sonde kann verwendet werden, um die gleiche Sache zu tun. 5. Abrufen einer beschichteten Heparin-Acryl-Perlen <ol><li> Mit einem Paar von 55 Pinzetten, finden eine intakte Perle in der Lösung. Lassen Sie die Raupe hängt sich an die Spitze, langsam schließen Sie die Zange. </li><li> Entfernen Sie die Perle aus der Lösung und bringen Sie es oben auf dem Ei. </li><li> Sobald die Kügelchen aus seiner Lösung, wird es wahrscheinlich nicht aus, bis es in das Albumin gelegt zu kommen. </li></ol> 6. Platzierung der Perle <ol><li> Sobald die Raupe hat auf der Oberseite des Zielbereichs gelegt, mit einem Wolfram-Sonde, um es in Richtung Vorderhirn Anleitung oder fix it in der Hinterhirn. </li><li> Fügen Sie ein paar Tropfen PBS mit einem 10 ul Pipette. </li></ol> 7. Closing the egg <ol><li> Schließen Sie das Ei mit dem dünnen Stück Klebeband, um das Fenster zu schließen. </li><li> Seal das Ei nach dem prepping Protokoll, verfügbar unter <a href="http://jove.com/index/Details.stp?ID=306" target="_blank">http://jove.com/index/Details.stp?ID=306</a> . </li></ol>

<ol><li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+Chicken+Eggs+for+Developmental+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Jounal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies.</a> Jounal of Visualized Experiments. 8, 

 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306</a> (2007).</li>
<li>Crossley, P. H., Martinez, S., Ohkubo, Y., Rubenstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+expression+of+Fgf8%2C+Otx2%2C+Bmp4%2C+and+Shh+in+the+rostral+prosencephalon+during+development+of+the+telencephalic+and+optic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Coordinate expression of Fgf8, Otx2, Bmp4, and Shh in the rostral prosencephalon during development of the telencephalic and optic vesicles.</a> Neuroscience. 108, 183-206 (2001).</li>
<li>Alexandre, P., Bachy, I., Marcou, M., Wassef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+regulations+by+FGF8+contribute+to+midbrain+roof+plate+developmental+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%22%5BJournal%5D)">Positive and negative regulations by FGF8 contribute to midbrain roof plate developmental plasticity.</a> Development . 133, 2905-2913 (2006).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Je nach Protein, das Sie verwenden möchten, gibt es verschiedene Protokolle, wie die Perlen vorzubereiten. In diesen Experimenten verwenden wir Heparin-Acryl-Perlen, aber Affi-Gel-Kügelchen können ebenfalls verwendet werden. Wir haben festgestellt, dass die Heparin-Acrylperlen einfacher, in der wässrigen Umgebung des Eieralbumin zu manipulieren sind. Beads sind in 5 l Protein über Nacht bei 4 ° C eingeweicht Control-Kügelchen werden in sterile PBS bis zum Zeitpunkt der Platzierung gelegt. Der Vorteil in der Verwendung eines in-ovo-Zubereitu...

<table><tbody><tr><td>Eier</td><td>Tier</td><td></td><td></td><td>Befruchtet, E2-2,5 (~ St. 17 HH)</td></tr><tr><td>Brutschrank</td><td>Profi-I</td><td>Lyon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Indiatinte</td><td>Werkzeug</td><td>Higgins</td><td></td><td>Eine 4%ige Lösung in steriler PBS herstellen.</td></tr><tr><td>Sterile PBS</td><td></td><td></td><td></td><td>Alternativ kann ein Antikörperserum verwendet werden</td></tr><tr><td>1-ml-Spritze</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>27G 1/2-Nadeln</td><td>Werkzeug</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td>Im 90-Grad-Winkel abgewinkelt</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Werkzeug</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td>Größe 55</td></tr><tr><td>Blutstillungszange</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Präzisionsschere</td><td>Werkzeug</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500086</td><td>Vannas, 8,5 cm</td></tr><tr><td>Parafilm-Band</td><td></td><td></td><td></td><td>zum Versiegeln der Eier</td></tr><tr><td>Wolframsonde</td><td>Werkzeug</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62091</td><td>Werkzeug #24. Griff optional.</td></tr></tbody></table>

platzieren growth factor-coated perlen auf early stage hühnerembryonen

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

Das Neuralrohr drückt viele Proteine ​​in bestimmten raumzeitlichen Muster während der Entwicklung. Diese Proteine ​​haben gezeigt, dass entscheidend sein für die Zell-Schicksal Bestimmung, Zellwanderung, Bildung von neuronalen Schaltkreisen. Neuronale Induktion und Musterbildung beteiligt knochenmorphogenetisches Protein (BMP), Sonic Hedgehog (SHH), Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), unter anderem. Insbesondere ist das Expressionsmuster von Fgf8 in unmittelbarer Nähe zu Regionen zum Ausdruck BMP4 und SHH. Dieser Ausdruck Muster steht im Einklang mit Entwicklungsstörungen Interaktionen, die Strukturierung erleichtern im Telencephalon. Hier bieten wir eine bildliche Darstellung eines Verfahrens, in dem ein in-ovo-Herstellung verwendet werden, um die Auswirkungen von FGFs bei der Bildung des Vorderhirns getestet werden können. Beads sind mit Protein beschichtet und in den Entwicklungsländern Neuralrohr Gegen dauerhafte bieten. Da das Verfahren verwendet kleine, sorgfältig platzierten Perlen, ist es minimal-invasiv und erlaubt mehrere Perlen in einer einzigen Neuralrohr platziert werden. Darüber hinaus erlaubt das Verfahren für die weitere Entwicklung, so dass Embryonen in einem reiferen Stadium untersucht werden kann, um Veränderungen in der Anatomie und in neuronalen Mustern zu erkennen. Diese einfache, aber nützliche Protokoll ermöglicht Echtzeit-Bildgebung. Es bietet die Möglichkeit, räumlich und zeitlich begrenzten Änderungen an endogene Protein-Ebene zu machen.

Eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren und Proteinen interagieren zu induzieren Zellen auf verschiedene Zell-Schicksal während der Entwicklung zu nehmen. Hier zeigen wir die Verwendung eines in-ovo-Vorbereitung auf mögliche Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Proteinen in der Entwicklung, indem sie Perlen auf E2.5 Hühnerembryonen Adresse.

Platzieren Growth Factor-Coated Perlen auf Early Stage Hühnerembryonen

Das Neuralrohr exprimiert während der Entwicklung viele Proteine in spezifischen raumzeitlichen Mustern. Es wurde gezeigt, dass diese Proteine entscheidend für die zelluläre ...

Willkommen im Raburn-Labor. Ich bin Matt Korn, Abteilung für Neurobiologie und Verhalten an der University of California Irvine. Heute werden wir ein Ei nehmen, es öffnen und eine Perle einsetzen, die zuvor in Wachstumsfaktor eingelegt wurde.Die wunderbare Präparation eines Eies ermöglicht es uns, einen Wachstumsfaktor hinzuzufügen, um das Schicksal verschiedener Gewebetypen in diesem frühen Stadium der embryonalen Entwicklung zu verändern. Tag zwei einhalb, oder Stadium 17. Gut, wir befinden uns hier am Mikroskop.Ich habe meine Eier und alle meine Werkzeuge. Also los, nehmen Sie ein Ei hier heraus und sehen Sie, wo sich unser Klebeband befindet. Fensterdichtung.Ich habe diesen netten kleinen Donut. Er besteht einfach aus künstlerischem Ton, den man in einem Kunstgeschäft bekommen kann. Und ich werde ein wirklich schlechtes Paar Fünf-Punkt-Präzisionspinzetten nehmen.Das gibt es schon seit langer Zeit. Die Spitzen sind ziemlich stumpf, aber sie eignen sich hervorragend dazu, das Klebeband gerade genug anzuheben, sodass das Fenster erscheint. Ich kann sie weglegen.Ich werde dies einfach zusammenfalten und das Ei, dieses Fenster, dahinter so verstauen. Jetzt kann ich es unter das Mikroskop stellen und jegliche Art von Manipulationen vornehmen. In diesem Fall werden wir die Kügelchen verwenden, und ich werde jetzt bereits meine Tusche holen, und zwar ohne die Tusche.Sie können sehen, dass sich hier eine kleine Keimscheibe befindet, die leicht zur Seite verschoben ist. Wenn ich das Ei also einfach drehe, kann ich erkennen, wo sich etwas Blut zu einem Kreis formt. Dann kann ich meine Nadel mit der Tusche vorbereiten.Und ich werde hier einfach zur Seite gehen und unter die Scheibe fahren, wo sich ein Embryo befindet. Ich möchte nicht zu viel hinzufügen, sondern gerade genug, um den Kontrast des Embryos gegenüber dem Schwarzen zu erkennen. Dann werde ich dies einfach weiterdrehen, sodass der Kopfbereich des Embryos nach vorne zeigt.Und hier können Sie die Cephalon-Region sehen. Der Neuralrohr verläuft hier zurück, und wir haben einige Somiten, anhand derer wir das Alter bestimmen können. Und wenn ich nun heranzoome, können wir erkennen, dass das Herz sehr langsam, aber gleichmäßig schlägt, was hervorragend ist.Das Herz war da, aber es schlug nicht. Wir müssten uns etwas Sorgen machen, ob dies eine vitale Probe war oder nicht. Da keine echte dicke Membran darüber liegt, kann ich einfach zu meinem Wolfram-Präparierspitze hier greifen.Ich, und hier ist eine dünne Membran, und ich werde sie einfach beiseite schieben, damit ich Zugang zum Embryo habe. Wir platzieren Kügelchen sowohl im Vorderhirn als auch im Hinterhirn. Und bei diesem Embryo werde ich ins Vorderhirn gehen.Nun, um dorthin zu gelangen, muss ich durch eine Membran schneiden. Wenn die Proben jünger sind, kann ich einfach eine Wolframelektrode verwenden, um durch den Neuralrohrkanal einzudringen, und erhalte dann Zugang zu dem Bereich, in den ich die Perle einbringen möchte. Jetzt werde ich zur Wolframelektrode übergehen.Und ich benutze beide Hände, um meine Hand zu stabilisieren. Ich werde nun das Embryo manövrieren. Sobald ich die Perle hier eingeführt habe, kann ich sie direkt in den Neuralrohr und bis in das Vorderhirn bringen.Okay, da ich nun das Embryo geöffnet habe, kann ich fortfahren und es vorbereiten sowie die Perle platzieren. Dazu stecke ich meine Sonde etwas tiefer hinein und öffne das Neuralrohr, was Sie dort sehen können. Ich werde nun etwas näher heranzoomen.Ich verändere hier einfach etwas meine Fokussierung. Und Sie können sehen, dass dort eine schöne kleine Öffnung ist, aber ich habe noch kein Loch oberhalb der Stelle angebracht, wo sich das Schwanzcephalon befindet, und das liegt daran, dass genau dort die Perle platziert werden soll. Daher möchte ich kein Loch haben, durch das die Perle herausragen könnte.Ich möchte es etwas weiter hinten haben, damit ich die Perle einsetzen und dann nach vorne schieben kann. Jetzt nehme ich eine Perle. Wie Sie sehen, gibt es viele verschiedene Größen.Das sind Heparin-Acryl, sie befinden sich in PBS. Ich werde nun einen Satz 55er Pinzetten nehmen. Wie Sie sehen, gehe ich in das PBS hinein und suche mir einfach ein Objekt aus, das mir zusagt.Und sobald es aus dem PBS heraus ist, bleibt es normalerweise an der Pinzette haften, man kann es dort sehen. Decken Sie die Kügelchen ab. Bringen Sie mein Ei zurück.Ich werde das Ei scharfstellen. Ich nehme nun die Perle mit der 55er Pinzette auf. Sie sitzt etwas höher an der Pinzette, als ich es bevorzuge, aber da ist sie.Und ich werde es einfach ein wenig dorthin führen, wo ich das Loch im Neuralrohr angelegt habe. Sobald es im Neuralrohr ist, lässt es sich leicht in Richtung vorderes Ende des sich entwickelnden Gehirns bewegen. Daher nehme ich jetzt meine Wolframelektrode und schiebe sie einfach vorwärts.Wenn Sie die Perle im Cephalon platzieren, müssen Sie vorsichtig sein, da beim Altern des Embryos eine Vorwärts- und anschließende Seitwärtsbiegung eintritt. Häufig passiert es, dass die Perle beim Einbringen in das Vorderhirn, also in den Cephalon, in Richtung Schnabel fällt, da der Schnabel im ventralen Bereich des Embryos entsteht, während das Gehirn im dorsalen Bereich liegt. Doch dies sieht ziemlich gut aus.Ich bin damit ziemlich zufrieden. Ich werde nun eine Pipette mit 10 µL sterilem PBS nehmen und einfach ein paar Tropfen hier hinzufügen. Okay, jetzt können wir fortfahren und das Ei schließen.Und was ich jetzt tun werde, ist, das Fenster hier nach oben und darüber zu führen, und das Ei ist noch nicht versiegelt. Damit es nicht austrocknet, werde ich etwas von dem Plastikband nehmen, das wir verwendet haben, und ein Stück abschneiden. Es ist etwa so groß, nur etwas größer als das Fenster.Und ich werde es etwas dehnen und es direkt über das Fenster hier legen, um sicherzustellen, dass es schön fest sitzt. Alle Löcher, die wir gemacht haben, entweder beim Ablassen des Albumins oder beim Schneiden des Fensters, werden so verschlossen. Nun ist das Ei also hermetisch versiegelt, es kann kein Eiweiß mehr verlieren und wird nicht austrocknen.Es sollte normal altern können. Damit ist die Platzierung der Kügelchen abgeschlossen. Viel Erfolg bei Ihren Küken-Experimenten, und ich hoffe, Sie erhalten die gewünschten Ergebnisse.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt zwei Methoden für die Erstellung und Platzierung Perlen, die mit Wachstumsfaktor beschichtet wurden, auf Explantate der Entwicklungsländer Großhirnrinde. Diese Perlen können verwendet werden, um räumlich begrenzte Genexpression auf die Entwicklung von neuronalen Gewebe wie Vorderhirn Explantate induzieren. Es werden Methoden für die Verwendung sowohl Affi-Gel Perlen und Heparin Acryl Perlen gegeben.

Growth Factor-Coated Bead Platzierung auf Dorsal Vorderhirnneuronen Explantate

Dieses Video zeigt neue Kultur, eine Methode, durch die Hühnerembryonen außerhalb der Eizelle bis zu 24 h kultiviert. Diese Methode ermöglicht ein bis frühen Entwicklung (Primitivstreifens bis 14 som.), Ein Zeitraum entsprechend E7-9 in der Maus zu studieren. Anwendungen dieser Technik sind die Elektroporation, in situ Hybridisierung und Immunhistochemie.

Method for Culture of Early Hühnerembryonen ex vivo (New Culture)

Dieser Artikel beschreibt Oberfläche Kennzeichnung...

Tracking Morphogenetic Tissue Verformungen in der frühen Hühnerembryo

Ein Ansatz zur Analyse von Migration und schließlich das Schicksal der aviären Neuralleistenzellen in Wachtel-Küken chimären Embryos beschrieben wird. Diese Methode ist eine einfache und unkomplizierte Technik zum Aufspüren Neuralleistenzellen während der Migration und Differenzierung, die sonst schwer zu unmanipulierten innerhalb eines Hühnerembryo zu unterscheiden sind.

Die Analyse der Neuralleiste Migration und Differenzierung von Cross-Spezies Transplantation

Den Hühnerembryo während der Entwicklung zu betrachten und darauf zuzugreifen, kann eine Herausforderung sein. Wir haben eine Ex-Ovo-Methode entwickelt, die einfach und kostengünstig ist und problemlos in einem Klassenzimmer oder in der Forschung eingesetzt werden kann. Diese Methode ermöglicht den Zugang zum Embryo bis in die späten Stadien der Embryonalentwicklung (HH 40).

Optimierte Ex-ovo Züchtung von Hühnerembryonen zu fortgeschrittenen Entwicklungsstadium

Hier berichten wir über die doppelte Kennzeichnung von neuralen Kammzellen und Blutgefäßen mit KükenGFP Neuralröhre Intraspezies Transplantation kombiniert mit intravaskulären DiI-Injektion. Diese experimentelle Technik ermöglicht es uns, die Entwicklung des NCC-abgeleiteten (enterischen) Nervensystems und des Gefäßsystems während der Organogenese gleichzeitig zu visualisieren und zu untersuchen.

Dual-Kennzeichnung von neuralen Kammzellen und Blutgefäßen innerhalb von Hühnerembryonen mit ChickGFP Neural Tube Grafting und Carbocyanin Dye DiI Injektion

Durch das Pfropfen von Kügelchen, die mit Wachstumsfaktoren oder spezifischen Inhibitoren von Signalwegen getränkt sind, in sich entwickelnde Embryonen ist es möglich, ihre Wirkung direkt in vivo zu testen. Bei diesem Protokoll werden Kügelchen in die Knospe der Gliedmaßen transplantiert, um die Auswirkungen dieser Moleküle auf die Genexpression und Signaltransduktion zu bestimmen.

Pfropfen von Beads in die Entwicklung von Hühnerembryo-Glieder zu identifizieren Signaltransduktionswegen Beeinflussung der Genexpression

Protokolle, die undurchlässige Barrieren verwenden, um Induktionsereignisse zwischen Geweben der Hauptkörperachse und der Flanke im Hühnerembryo zu blockieren, die für die Gliedmaßenbildung erforderlich sind, werden beschrieben. Kügelchen, die mit induktiven Signalkandidaten getränkt sind, werden verwendet, um den Effekt der Barriereplatzierung zu überwinden, und die Analyse der Genexpression bestätigt dies.

Die Anwendung der undurchlässige Barrieren In Kombination mit Candidate Factor Soaked Beads zu studieren Induktive Signale im Küken

Hier stellen wir eine neue Technik vor, um Hühnerembryonen ex ovo für die Zeitrafferbildgebung mittels Durchlicht- und Fluoreszenzmikroskopie zu kultivieren. Das getauchte Filterpapiersandwich ist eine Variante der etablierten Filterpapierträgertechnik1, die die Kultivierung von Hühnerembryonen ermöglicht, die vollständig in ein flüssiges Kulturmedium getaucht sind.

Ein Abgetaucht Filterpapier Sandwich für Langzeit Ex Ovo Zeitraffer-Imaging von frühen Hühnerembryonen

Bei dieser Methode sind embryonale Herz Gewebe chirurgisch Microdissected, dissoziiert, Eindringmittel beschriftet und in Host embryonalen Gewebe implantiert. Dies bietet eine Plattform für das Studium der Einzelperson oder Gewebe Ebene Entwicklungen Organisation unter ektopische hämodynamischen Bedingungen und/oder veränderten parakrine/Juxtacrine Umgebungen.

Mikroinjektion basierenden System für In Vivo Implantation von embryonalen Kardiomyozyten des aviären Embryos

Der durchnässte Perlenassay beinhaltet die gezielte Abgabe von Testreagenzien zu jedem Entwicklungszeitpunkt, um die Regulation der Zelldifferenzierung und Morphogenese zu untersuchen. Es wird ein detailliertes Protokoll vorgestellt, das auf jedes Versuchstiermodell anwendbar ist, um drei verschiedene Arten von getränkten Perlen herzustellen und diese in die Zwischenziffer eines Hühnerembryos zu implantieren.

Analyse der Zelldifferenzierung, Morphogenese und Musterung während der Hühnerembryogenese mit dem Soaked-Bead-Assay

Erfahren Sie die Platzierung wachstumsfaktorbeschichteter Perlen auf Hühnerembryonen im Frühstadium. Diese in-ovo-Methode ermöglicht präzise Manipulationen zur Untersuchung von Zellfate-Determinierung.

Platzieren Growth Factor-Coated Perlen auf Early Stage Hühnerembryonen

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