Name: Mess-bakterielle Belastung und Immunreaktionen in Mäuse Infizierte mit Listeria monocytogenes /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 50 s
Description: Erfahren Sie die Messung bakterieller Belastung und Immunreaktionen bei Mäusen mit Listeria monocytogenes. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Einzelzellsuspensionen aus Leber und Milz mittels FACS.

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Die Autoren bedanken sich bei Anna Walduck, Christina Cheers, Stuart Berzins, Dale Godfrey, Yifan Zhan und Jonathan Wilksch für Beratung und Reagenzien zu danken. Diese Arbeit wurde von der Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2008-602) und die Australian National Health and Medical Research Council (575552) gefördert. NW wird von einem Australian Postgraduate Award unterstützt. OW wird von einer RD Wright Fellowship von der Australian National Health Medical Research Council unterstützt.

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<li>Marco, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetration+of+Listeria+monocytogenes+in+mice+infected+by+the+oral+route%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Pathog%22%5BJournal%5D)">Penetration of Listeria monocytogenes in mice infected by the oral route.</a> Microb Pathog. 23, 255-263 (1997).</li>
<li>Busch, D. H., Vijh, S., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+model+for+infection+with+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Animal model for infection with Listeria monocytogenes.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter. 19, 19-19 (2001).</li>
<li>Neuenhahn, M., Schiemann, M., Busch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCs+in+mouse+models+of+intracellular+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">DCs in mouse models of intracellular bacterial infection.</a> Methods Mol Biol. 595, 319-329 (2010).</li>
<li>Conlan, J. W., North, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+are+essential+for+early+anti-Listeria+defense+in+the+liver%2C+but+not+in+the+spleen+or+peritoneal+cavity%2C+as+revealed+by+a+granulocyte-depleting+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Neutrophils are essential for early anti-Listeria defense in the liver, but not in the spleen or peritoneal cavity, as revealed by a granulocyte-depleting monoclonal antibody.</a> J Exp Med. 179, 259-268 (1994).</li>
<li>Czuprynski, C. J., Brown, J. F., Wagner, R. D., Steinberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+antigranulocyte+monoclonal+antibody+RB6-8C5+prevents+expression+of+acquired+resistance+to+Listeria+monocytogenes+infection+in+previously+immunized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Administration of antigranulocyte monoclonal antibody RB6-8C5 prevents expression of acquired resistance to Listeria monocytogenes infection in previously immunized mice.</a> Infect Immun. 62, 5161-5163 (1994).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Listeria ist eines der am häufigsten verwendeten Organismen, um die Immunantwort des Wirts gegenüber intrazellulären Bakterien zu charakterisieren6. Das hier vorgestellte Protokoll ermöglicht es, die bakterielle Belastung und die Immunzellantworten im selben Gewebe einer einzelnen Maus zu messen. Diese Doppelbestimmung eines bestimmten Gewebes für jede infizierte Maus ermöglicht robustere Vergleiche innerhalb und zwischen Maus-Kohorten (die entweder verschiedene Mausstämme oder verschiedene Zeitpunkte nach der Infektion repräsentieren). Obwohl eine Listeria-Infektion durch orale Verabreichung ebenfalls zur Untersuchung der Immunantworten bei Mäusen verwendet werden könnte, wird häufig die intravenöse Injektion gewählt, da sie: 1) eine schnelle und effektive Freisetzung in den Blutstrom sicherstellt; 2) eine synchronisierte und konsistente systemische Infektion hervorruft; und 3) die Art Mus eine Mutation im Gen besitzt, das den E-Cadherin-Rezeptor kodiert, wodurch die Listeria-Infektion über die orale Route eingeschränkt wird (diese Mutation beeinträchtigt die Fähigkeit von Listeria, an den murinen E-Cadherin-Rezeptor zu binden und die epitheliale Schicht des Magen-Darm-Trakts effizient zu durchqueren)16–18.
Es gibt einige kritische Schritte in diesem Protokoll. Zunächst sollte der Listeria-Inokulumvorrat aus einer frischen Übernachtkultur auf HBA hergestellt werden, um Vitalität und Virulenz sicherzustellen. Zweitens ist es wichtig, die KBE-Konzentration des Inokulums vor und nach der Injektion aller Mäuse genau zu bestimmen, um sicherzustellen, dass die KBE-Konzentration zwischen dem ersten und dem letzten injizierten Tier nicht stark variiert. Drittens muss die Injektion von Listeria in die Schwanzvene bei allen Mäusen konsistent erfolgen. Schließlich ist es notwendig, die Leber zu perfundieren, um nicht-residente Leukozyten zu entfernen, um eine genaue Quantifizierung der Immunzellen in der Leber und nicht der durch das periphere Blut zirkulierenden Leukozyten sicherzustellen. Sollten all diese Schritte nicht erfolgreich durchgeführt werden, kann dies zu unerwünschten Variabilitäten bei der bakteriellen Belastung und/oder den Immunantworten zwischen einzelnen mit Listeria infizierten Mäusen führen.
Zwei Einschränkungen dieses Protokolls sind die Fähigkeiten des Untersuchers bei der intravenösen Infektion von Mäusen und die Detektion der bakteriellen Belastung in Geweben. Wenn eine Person eine große Anzahl von Mäusen injiziert, kann die Lebensfähigkeit von Listeria (d. h. die KBE-Konzentration) im Laufe der Zeit abnehmen, sobald das eingefrorene Inokulum aufgetaut ist (z. B. &gt;2 Stunden zwischen der Injektion der ersten und der letzten Maus). Es liegt in der Verantwortung des Untersuchers zu bestimmen, wie viele Mäuse er/sie injizieren kann, bevor das Inokulum beeinträchtigt wird. Eine weitere Einschränkung dieses Verfahrens besteht darin, dass die Listeria-Belastung aufgrund der relativ geringen Mengen an kultiviertem Gewehomogenat nicht genau unter 100 KBE/Organ gemessen werden kann (z. B. zeigt Abbildung 3, dass 100 KBE/Organ die Nachweisgrenze darstellt). Um niedrigere Werte der KBE/Organ genauer zu bestimmen, kann eine größere Menge des Gewehomogenats kultiviert werden (bis zu 0,5 mL pro Platte, mehrere Platten können verwendet werden), sodass ein größerer Anteil des Gewebes zur Detektion von Listeria untersucht wird. Falls kein Stomacher verfügbar ist, können alternative Methoden zur Homogenisierung des Gewebes, wie beispielsweise ein Gewehomogenisator, für die Schritte 7.1–7.2 verwendet werden. Praktischer Hinweis: Falls im 37 °C-Inkubator begrenzter Platz für die Kultivierung von Gewebeproben infizierter Mäuse zur Verfügung steht, können HBA-Kulturplatten 2–3 Tage bei Raumtemperatur inkubiert werden (die Kolonien wachsen bei Raumtemperatur langsamer). Raumtemperatur sollte jedoch nicht verwendet werden, wenn Kulturen zur Herstellung eingefrorener Listeria-Stämme angezüchtet werden.
Dieses Protokoll beschreibt eine grundlegende Methode zur Charakterisierung der Listeria-Infektion bei Mäusen und kann auch mit anderen Listeria-Stämmen neben EGD verwendet werden. Zusätzlich zu Leber und Milz können Einzelzell-Suspensionen auch aus Lymphknoten gewonnen werden. In beiden Fällen lassen sich diese Einzelzell-Suspensionen für verschiedene Analysen verwenden, einschließlich der Bestimmung von Immunzellsubpopulationen und der in vitro-Stimulation sortierter Immunzellen. Sobald die grundlegenden Techniken beherrscht sind, kann dieses Protokoll außerdem modifiziert werden, um Listeria-spezifische T-Zellen zu isolieren19, dendritische Zellen zu charakterisieren20 oder zu bestimmten Zeitpunkten nach der Infektion eine Ausschöpfung von Immunzellen durchzuführen21,22, um die Immunantwort bei mit Listeria infizierten Mäusen umfassender zu charakterisieren.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Pferd Blut-Agar-Basis No.2 </td><td> Oxoid </td><td> CM0271 </td><td> Vorbereitung der Agar-Basis für HBA-Platten </td></tr><tr><td> Pferd Blut (defibriniertes) </td><td> Oxoid </td><td> HB1000 </td><td> Fügen Sie 5-10% auf Agar-Basis </td></tr><tr><td> Brain Heart Infusion (BHI) Brühe (10 mL) </td><td> Oxoid </td><td> TM456 </td><td></td></tr><tr><td> Brain Heart Infusion dehydrierte Medien </td><td> Oxoid </td><td> CM1135 </td><td></td></tr><tr><td> 96-well Flachboden Platte </td><td> BD Biosciences </td><td> 353072 </td><td></td></tr><tr><td> 70 um Zellsieb </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Kleine Petrischale </td><td> BD Biosciences </td><td> 351007 </td><td></td></tr><tr><td> Stomacher 80 Biomaster Lab-System </td><td> Seward </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Plastic Stomacherbeuteln </td><td> Sarstedt </td><td> 86 9924 530 </td><td></td></tr><tr><td> Rinderserumalbumin </td><td> Sigma </td><td> A3912 </td><td></td></tr><tr><td> FACS-Puffer </td><td></td><td></td><td> 0,1% (w / v) Rinderserumalbumin in PBS </td></tr><tr><td> Isotonischen Percoll (33,75% Percoll in PBS) </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-01 </td><td> 33.75mL Percoll, 3.75mL 10x PBS, macht 62.5mL 1x PBS 100ml isotonischer Percoll </td></tr><tr><td> TAC Buffer </td><td></td><td></td><td> 17mm Tris, 140mm Ammoniumchlorid in destilliertem Wasser </td></tr><tr><td> FCS / EDTA-Puffer </td><td></td><td></td><td> Fötalem Kälberserum mit 10mm EDTA </td></tr><tr><td> FACS / EDTA-Puffer </td><td></td><td></td><td> FACS-Puffer + 5 mM EDTA </td></tr><tr><td> Trypanblau </td><td> Sigma </td><td> T6146 </td><td> 0,4% (w / v) in PBS, sterilfiltriert </td></tr><tr><td> 2 ml-Kryoröhrchen </td><td> Greiner Bio One </td><td> 121263 </td><td></td></tr><tr><td> 27 gauge/1mL Insulinspritze </td><td> Terumo Medical Products </td><td> SS10M2713 </td><td></td></tr><tr><td> Nadel </td><td> Terumo Medical Products </td><td> NN-2516R (25G 5/8in) NN-2613R (26G 1/2in) </td><td></td></tr><tr><td> Spritze </td><td> Terumo Medical Produkte </td><td> SS-01T (1 mL), SS-053 (5 mL), SS-10S (10 mL) </td><td></td></tr></tbody></table>

mess-bakterielle belastung und immunreaktionen in mäuse infizierte mit listeria monocytogenes</em

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listerien) ist ein Gram-positive fakultativ intrazellulären Erregers 1. Maus-Studien typischerweise intravenöser Injektion von Listeria, was zu einer systemischen Infektion 2. Nach der Injektion Listeria schnell verbreitet, die Milz und Leber durch die Aufnahme durch CD8α + dendritischen Zellen und Kupffer-Zellen 3,4. Sobald phagozytiert, ermöglichen verschiedene bakterielle Proteine ​​Listeria dem Phagosom entkommen, überleben im Cytosol und infizieren benachbarte Zellen 5. In den ersten drei Tagen der Infektion, vermitteln verschiedene angeborene Immunsystem-Zellen (zB Monozyten, Neutrophilen, NK-Zellen, dendritische Zellen) bakterizide Mechanismen, Listeria Verbreitung zu minimieren. CD8 + T-Zellen werden anschließend rekrutiert und für den eventuellen Clearance von Listerien aus dem Host, in der Regel innerhalb von 10 Tagen der Infektion 6. Erfolgreiche Clearance von Listerien aus infizierten Mäusen hängt von der entsprechenden Auftreten von Host Immunantwort 6. Es gibt ein breites Spektrum an Empfindlichkeiten unter Inzucht-Mausstämmen 7,8. Generell sind Mäuse mit einer erhöhten Anfälligkeit für Listeria Infektion weniger in der Lage, bakterielle Vermehrung steuern, zeigen erhöhte bakterielle Belastung und / oder verzögerte Clearance im Vergleich zu resistenten Mäusen. Genetische Studien, einschließlich Kopplungsanalyse und Knockout-Maus-Stämme wurden verschiedene Gene für die Sequenzvariation betrifft Host Reaktionen auf Listeria Infektion 6,8-14 identifiziert. Ermittlung und Vergleich der Infektion Kinetik zwischen verschiedenen Mausstämmen ist daher eine wichtige Methode zur Identifizierung von Host-genetischen Faktoren, die die Immunantwort gegen Listeria beitragen. Vergleich der Host-Reaktionen auf verschiedene Listeria-Stämme ist auch ein effektiver Weg zur bakteriellen Virulenzfaktoren, die als potenzielle Ziele für Antibiotika-Therapie oder Impfstoff-Design dienen könnten, zu erkennen. Wir beschreiben hier eine einfache Methode zur Messung der Keimbelastung (Kolonie bildende Einheiten [KBE] pro Gewebe) und die Vorbereitung Single-Cell-Suspensionen der Leber und der Milz für FACS-Analyse von Immunantworten in Listeria-infizierten Mäusen. Diese Methode ist besonders nützlich für die erstmalige Charakterisierung von Listeria-Infektionen bei neuartigen Maus-Stämme, sowie Vergleich der Immunantworten zwischen verschiedenen Mausstämmen mit Listeria infiziert. Wir nutzen die Listeria monocytogenes EGD-Stamm 15, die, wenn sie auf Blutagar kultiviert, weist eine charakteristische halo-Zone um jede Kolonie durch β-Hämolyse 1 (Abbildung 1). Bakterielle Belastung und Immunreaktionen können jederzeit-Punkt nach der Infektion durch Kultivierung Gewebehomogenat auf Blutagarplatten und Vorbereitung Gewebe Zellsuspensionen für FACS-Analyse unter Verwendung der Protokolle im Folgenden beschrieben wird. Wir möchte darauf hinweisen, dass Personen, die immungeschwächte oder schwanger sind, sollten nicht mit Listeria, und die einschlägigen institutionellen Kommission für Biosicherheit und Tier Facility Management sollte konsultiert werden, bevor die Arbeit beginnt werden.

Listeria monocytogenes ist ein Modellorganismus für die Untersuchung Immunreaktionen und die genetische Anfälligkeit für Bakterien bei Mäusen intrazellulär. Diese Methode ermöglicht ein bis bakterielle Belastung zu messen und generieren Single-Cell-Suspensionen der Leber und Milz von Mäusen für FACS-Analyse auf Veränderungen in Immunzellen durch Listeria-Infektion zu bestimmen.

Mess-bakterielle Belastung und Immunreaktionen in Mäuse Infizierte mit Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) ist ein grampositiver, fakultativ intrazellulärer Pathogen1. In Mausstudien wird in der Regel die intravenöse Injektion von ... angewandt.

Dieses Video zeigt eine Methode zur Messung der bakteriellen Belastung sowie zur Erzeugung und Analyse von Einzelzell-Suspensionen aus Maus, Leber und Milz. Zunächst wird ein Listeria-Inokulum hergestellt und intravenös in Mäuse injiziert. Anschließend werden Blut, Leber und Milz zu definierten Zeitpunkten aus euthanasierten Mäusen entnommen.Einzellösungen werden aus geernteten Geweben und Gewehomogenaten hergestellt und auf Pferdeblut-Agar-Platten kultiviert. Die resultierenden Zellsuspensionen können anschließend mittels FACS-Analyse auf Vitalität und Gehalt an Immunzellen analysiert werden, während die bakterielle Belastung anhand von koloniebildenden Einheiten bestimmt wird. Diese Methode kann zur Charakterisierung von Immunantworten auf Steroidinfektionen beitragen, wie beispielsweise bei vergleichenden Analysen zwischen empfänglichen und resistenten Mausstämmen, und ermöglicht gleichzeitig die Bestimmung der Bakterienlast in infizierten Organen.Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie den Listeria-Inokulum auf die gewünschte Konzentration vorbereiten. Anweisungen zum Kultivieren, Lagern und Vorbereiten von Listeria finden sich im beigefügten schriftlichen Protokoll. Sobald der Inokulum bereit ist, überführen Sie zwei Aliquote von jeweils 100 µL in sterile Mikrozentrifugenröhrchen, die 900 µL PBS enthalten, um eine Verdünnung von 1:10 herzustellen. Überführen Sie anschließend jeweils 100 µL jeder Verdünnung auf Harnblutagar (HBA)-Platten und verteilen Sie diese gründlich mit einem sterilen Verteilerglas. Führen Sie zur Bestimmung der koloniebildenden Einheiten (CFU) die Auszählung durch und inkubieren Sie die Platten danach über Nacht bei 37 °C in umgekehrter Position. Überführen Sie danach die Mäuse in einen sauberen Käfig.Platzieren Sie den Käfig 50 Zentimeter unter einer 250-Watt-Infrarotlampe für fünf Minuten, um sicherzustellen, dass die Schwanzvene dilatiert ist. Dies ermöglicht eine bessere Visualisierung während der Injektion. Hier die Liste der Listeria-resistenten Mausstämme, C 57 black six, und der Listeria-empfänglichen Mausstämme. Ventil C wird injiziert; mischen Sie die Listeria-Suspension vorsichtig, indem Sie das Röhrchen mehrmals umdrehen.Füllen Sie dann eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 27-Gauge-Nadel, um 200 Mikroliter pro Maus zu injizieren. Stellen Sie sicher, dass vor der Injektion alle Luftblasen aus der Spritze abgelassen werden. Legen Sie die Maus in eine Fixiervorrichtung.Suchen Sie dann die seitliche Schwanzvene der Maus, indem Sie zuerst die Schwanzarterie lokalisieren, die sich in der Mitte der dorsalen Seite befindet. Drehen Sie anschließend den Schwanz leicht zur Seite, um die Vene zu identifizieren. Wischen Sie den Schwanz vorsichtig mit einem 70 %igen Ethanol-Tupfer ab und injizieren Sie, nachdem Sie die Spritze zurückgezogen haben.Drücken Sie kurz mit einem sterilen Mulltupfer auf die Einstichstelle. Beachten Sie, dass es nach der Injektion deutlich schwieriger ist, die Schwanzvene bei schwarzen Mäusen zu identifizieren. Stellen Sie die Maus nach der Injektion aller Mäuseplatte in ihren Käfig zurück und inkubieren Sie das verbleibende Inokulum zur Bestimmung der koloniebildenden Einheiten.Wie am Vortag zählen Sie am nächsten Tag die Anzahl der Kolonien und bestimmen die Konzentrationen des Listeria-Inokulums vor und nach der Injektion. Der charakteristische Hof um einzelne Kolonien, wie hier gezeigt, beruht auf Beta-Hämolyse. Sobald die Koloniezahlen vor und nach der Injektion ermittelt wurden, berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl an koloniebildenden Einheiten, indem Sie die Anzahlen der koloniebildenden Einheiten vor und nach der Injektion addieren und durch zwei teilen.Abschließend werden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion Blut entnommen und Leber sowie Milz von euthanasierten Mäusen gewonnen. Falls eine Fax-Analyse durchgeführt wird, muss die Leber vor der Entnahme perfundiert werden, um Blut zu gewinnen; führen Sie unmittelbar nach der Euthanasie eine Herzaussage durch und sammeln Sie so viel Blut wie möglich in einem geeigneten Sammelröhrchen. Um die Leber zu perfundieren, öffnen Sie zuerst die Bauchhöhle und entfernen sowie entsorgen Sie die Gallenblase.Die Vena cava inferior ist eine Vene, die parallel zur Wirbelsäule verläuft und Blut aus dem unteren Körperteil, einschließlich der Leber, zum Herzen transportiert. Durchtrennen Sie mit einer Schere die Vene direkt unterhalb des Herzens, um einen Auslass für die perfundierende Flüssigkeit zu schaffen. Drehen Sie danach die Leberlappen in Richtung Kopf und schieben Sie den Darm nach rechts, um die Pfortader freizulegen, die in die Unterseite der Leber mündet.Führen Sie von der unteren rechten Seite aus eine gebogene Nadel der Größe 26 mit einer Länge von einem halben Zoll in die Pfortader ein und injizieren Sie 10 Milliliter PBS. Nachdem ein bis zwei Milliliter PBS injiziert wurden, verändert sich die Farbe der Leber von dunkelrot zu hellbraun. Die injizierte Lösung tritt aus der durchtrennten unteren Hohlvene aus. Die Leberperfusion stellt sicher, dass die gewonnenen Zellen aus der Leber stammen und nicht aus dem zirkulierenden Blut.Als Nächstes entfernen Sie die perfundierte Leber aus der Körperhöhle der Maus und tauchen sie in das Gefäß mit FACS-Puffer auf Eis. Entfernen Sie anschließend die Milz und legen Sie sie zur weiteren Verarbeitung auf Eis, wie im nächsten Abschnitt beschrieben. Um aus der Leber eine einzelne Leberzell-Suspension herzustellen, überführen Sie die perfundierte Leber zunächst vom FACS-Puffer in einen 70-Mikron-Zellsieb, der in einer 60 Millimeter großen Petrischale platziert ist.Drücken Sie das Gewebe mit einem Kolben eines Fünf-Liter-Spritze durch das Zellfilter in die Petrischale. Überführen Sie die Einzelzell-Suspension in ein 50-Milliliter-Konischschraubglas und stellen Sie das Gesamtvolumen auf 40 Milliliter ein. Mit kaltem Fax-Puffer.Vortexen Sie die Zellsuspension. Stellen Sie dann ein Aliquot von einem Milliliter zur Bestimmung der bakteriellen Belastung beiseite. Später im Verfahren wird der 50-Milliliter-Becher in die Zentrifuge gegeben, und die Zellen werden durch Zentrifugation bei 500 ×g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius pelletiert.Nachdem das Überstand entfernt wurde, diesen Waschschritt wiederholen, indem das Pellet in 40 Milliliter kaltem Fax-Puffer resuspendiert und zentrifugiert wird. Erneut resuspendieren. Das Pellet in 20 Millilitern isotonischem Puffer pro Bohrung bei Raumtemperatur resuspendieren und die Zellsuspension 12 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 700 ×g zentrifugieren.Nach dem Zentrifugieren schwimmt eine scheibenförmige Schicht von Hepatozyten auf der Perol-Lösung, während die Leukozyten am Boden des Reaktionsrohrs pelletiert werden. Entsorgen Sie die Hepatozytenschicht und die Perol-Lösung, indem Sie sie in einen Abfallbehälter gießen. Suspendieren Sie das Pellet, das die Leukozyten enthält, erneut in vier Milliliter TAC-Puffer, um Erythrozyten zu lysieren, und inkubieren Sie die Zellen bis zu 10 Minuten bei Raumtemperatur unter häufigem Invertieren. Nach der Inkubation filtrieren Sie die Zellsuspension durch eine 100-Mikron-Nylon-Membran in ein neues 10-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Legen Sie die gefilterte Zellsuspension mit einem Milliliter Fax-EDTA-Puffer wie hier gezeigt unter. Zentrifugieren Sie dann bei 350 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Nach dem Zentrifugieren resuspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern Fax-EDTA-Puffer, zentrifugieren erneut und resuspendieren das Pellet in 0,5 bis drei Millilitern Fax-EDTA-Puffer, abhängig von der Größe des Pellets. Bestimmen Sie die Anzahl der vitalen hepatischen Leukozyten mithilfe eines Hämozytometers basierend auf der Ausschlussmethode mit Trypanblau für Leber.Einzellösungen können anschließend mit Antikörpern markiert werden, die spezifisch für gewünschte Oberflächenmarker der Zellen sind, und mittels FACS analysiert werden. Sobald Einzellösungen aus Leber- und Milzgewebe erzeugt wurden, werden die bakteriellen Belastungen für Teile des Verfahrens bestimmt. Eine Magenquetschmaschine wird verwendet, um das Gewebe zu homogenisieren, wobei ein Magen-ER-Beutel geschlossen gehalten wird, um ein Auslaufen zu verhindern.Legen Sie es zunächst flach auf eine saubere Arbeitsfläche. Rollen Sie einen dicken runden Stift über das Gewebe, bis das Gewebe innerhalb des Beutels zerkleinert ist. Geben Sie fünf Milliliter PBS zu jedem Magenbeutel mit zerkleinertem Gewebe hinzu.Geben Sie den Magen oder die Beutel in den Magen und zerkleinern Sie sie 10 Minuten lang bei hoher Geschwindigkeit. Die Magenmaschine verfügt über zwei Rührflügel, die den Magen oder die Beutel mit einer vorgegebenen Geschwindigkeit bearbeiten, wodurch der Inhalt zu einem homogenen Homogenat vermischt wird, und dabei eventuelle Aerosole enthalten. Mit einer Pipette wird das Homogenat im Beutel gemischt. Anschließend überführen Sie 300 Mikroliter im Duplikat in eine 96-Loch-Platte mit flachem Boden.In den Vertiefungen der 96er-Platte eine Verdünnungsreihe von 1:10 bis zur Verdünnung 10 hoch 5 durchführen. Für jede Gewebehomogenatprobe vorsichtig 0,1 Milliliter jeder Verdünnung mit einem sterilen Verteilstab auf einer vorgetrockneten HBA-Platte verteilen. Die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren.Am nächsten Tag die Anzahl der koloniebildenden Einheiten für jede Verdünnung zählen und die koloniebildenden Einheiten pro Gewebestück berechnen, unter Berücksichtigung des Anteils der Gewebeverdünnungsfaktoren und des Homogenatsvolumens. Überprüfen, ob C 57 black six Mäuse drei und sieben Tage nach der Infektion mit etwa 2000 koloniebildenden Einheiten von Listeria infiziert wurden, woraufhin die Mäuse getötet wurden und die Leber perfundiert und gemeinsam mit der Milz entnommen wurde. Verdünnungen des milzigen Homogenats oder der hepatischen Einzelzell-Suspension wurden auf HBA-Platten kultiviert, um die bakterielle Belastung zu bestimmen.In den hier gezeigten Ergebnissen kennzeichnet die gestrichelte Linie die Nachweisgrenze bei 100 koloniebildenden Einheiten pro Organ. Beachten Sie, dass die Listeria-Belastung am Tag drei höher ist als am Tag sieben. Dies liegt daran, dass bis zum Tag sieben verschiedene Immunzellen zur Eliminierung von Listeria führen.In diesen beiden Geweben, Milz und Leber, wurden Einzelzell-Suspensionen mit Trypanblau gefärbt und auf ein Hämocytometer aufgetragen. Zellen innerhalb des im roten Kasten markierten Zählbereichs werden gezählt. Nicht lebende Zellen nehmen Trypanblau auf und erscheinen blau, während lebende Zellen ungefärbt bleiben.Wie hier gezeigt, steigt die Anzahl der vitalen Zellen in der Milz, dargestellt auf der linken Seite, und die Anzahl der vitalen Leukozyten in der Leber, dargestellt auf der rechten Seite, im Verlauf der Infektion an. Dieser Anstieg ist auf Immunzellen zurückzuführen, einschließlich Neutrophiler und Lymphozyten, die aktiviert werden, proliferieren und zu diesen beiden Infektionsstellen wandern. Als Beispiel für den Verlauf der Immunzellzahlen während einer Listeria-Infektion sind hier repräsentative FACS-Diagramme und die Anzahl der CD8-positiven T-Zellen dargestellt.Die Anzahl der CD8-positiven T-Zellen nimmt vorübergehend aufgrund einer Lymphopenie in der Milz an den Tagen zwei bis drei ab, bevor sie ab Tag fünf postinfektion sowohl in der Milz als auch in der Leber deutlich ansteigt. Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie die Oszillation von Androgenen, antigenspezifischen T-Zellen und funktionelle Assays sortierter Immunzellen durchgeführt werden, um die Immunantwort auf eine Listeria-Infektion weiter zu charakterisieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Lo, B. C., et al. Chronische Salmonellen-Infektion induzierte Darmfibrose. J. Vis. Exp. (2019)Das Video demonstriert die Quantifizierung der Bakterienlast in einem Mausmodell einer chronischen Infektion mit streptomycinresistenter Salmonella-Typhimurium.  Nach Euthanasie und steriler Dissektion werden Müses- und Milzgewebe entnommen, mit Stahlperlen homogenisiert, um Bakterien freizusetzen, und seriell verdünnt. Verdünnungen werden auf selektivem Agar verdünnt, und sichtbare Kolonien...

Quantifizierung der bakteriellen Gewebebelastung in einem Mausmodell chronischer Darminfektion

Quelle: McMullen, P. D., Freitag, N. E. Bewertung bakterieller Invasion von Herzzellen in Kultur und Herzkolonisierung bei infizierten Mäusen mit Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (2015)Dieses Video demonstriert die Injektion von Listeria monocytogenes in die Schwanzvene einer Maus, um systemische Infektionen zu etablieren. Sie zeigt die bakterielle Zirkulation, Organbesiedlung und die Quantifizierung der bakteriellen Belastung im Herzen durch Homogenisierung von Gewebe, serielle...

Quantifizierung der bakteriellen Last im Mausherz nach der Injektion von Listeria monocytogenes in die Schwanzvene

Source: Ahn, J. J., et al. Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (2016)The video demonstrates bacterial load measurement in spleen and liver tissues isolated from mice infected with an intracellular bacterial pathogen. Bacteria, accumulated within tissue-resident phagocytes during systemic infection, are released using detergent-based lysis and mechanical disruption. Serial dilutions of the homogenates are plated on...

Quantification of Bacterial Load in Mouse Spleen and Liver After Systemic Infection

Source: Ahn, J. J., et al., Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the preparation of mouse splenocyte cultures from Listeria monocytogenes-infected mice for downstream cytokine analysis. It includes ex vivo bacteria-derived antigen stimulation and sample processing to study T cell responses.

In Vitro Stimulation of Mouse Splenocytes with Heat-Killed Listeria monocytogenes

Dieses Video zeigt die Quantifizierung der infektiösen Bakterienlast aus dem perfundierten Mäusegehirn, das mit Listeria monocytogenes infiziert ist.

Beurteilung der bakteriellen Besiedlung in einem Mäusegehirn nach einer Infektion mit Listeria monocytogenes

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Mündliche Übertragung von<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; In Mäusen über die Aufnahme von kontaminierten Speisen

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Dieses Protokoll beschreibt , wie C57BL / 6J - Mäuse mit dem Stamm EGD von Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) und zur Messung der Interferon-γ (IFN-γ) Antworten , die durch natürliche Killer (NK) Zellen, natürliche Killer - T (NKT) -Zellen zu inokulieren, und adaptive T-Lymphozyten nach der Infektion. Dieses Protokoll beschreibt auch , wie Überlebensstudien bei Mäusen mit einer modifizierten LD 50 Dosis des Erregers nach der Infektion zu führen.

Experimentelle Infektion mit<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Als Modell für die Untersuchung Host-Interferon-γ Antworten

Während der Infektion kann Listeria Monocytogenes überqueren der Blut - Hirn-Schranke um das Gehirn zu besiedeln. In diesem Protokoll veranschaulichen wir die bakterielle Besiedlung der Organe nach Infektion der Mäuse zu beurteilen. Ein Verfahren zur gesamten Organ Perfusion zur spezifischen Bestimmung der bakteriellen Zahlen in der Anwesenheit von durchführen steht zur Verfügung.

Listeria monocytogenes Infektion des Gehirns

Wir beschreiben beide in vitro und in vivo Infektion-Assays, die verwendet werden können, um die Aktivitäten des Host-Codierung Faktoren zu analysieren.

Verwenden eine bakterielle Erreger, Sonde für zelluläre und organismische Ebene Host Antworten

Hier präsentieren wir eine elegante Protokoll für in Vivo Evaluierung der Impfstoff Wirksamkeit und Host Immunantworten. Dieses Protokoll kann für Impfstoff-Modelle, die studieren, virale, bakterielle oder parasitäre Erreger angepasst werden.

Bewertung der Wirt-Pathogen-Antworten und Wirksamkeit des Impfstoffes bei Mäusen

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