Rat Mesenterium Angiogenese Assay

Willkommen an der Abteilung für Pathologie des GaN-Universitätsklinikums in Guttenburg, Schweden. Ich bin Dr. Klaus Norby, und die Methode, die Sie gleich sehen werden, wurde in meinem Labor entwickelt. Klinisch relevante Angiogenese, die im Zusammenhang mit Hypoxie, soliden Tumoren oder jeder anderen angiogenetischen Erkrankung auftritt, findet nahezu ausschließlich in nativ vaskularisiertem Gewebe statt. Bei erwachsenen kleinen Nagetieren enthält das Mesenterium, das den Dünndarm mit der Hinterwand des Körpers verbindet, eine Reihe dünner membranöser Abschnitte. Bei Ratten gibt es etwa 40 bis 50 dieser mesenterischen Fenster. Sie sind praktisch durchsichtig und daher mit bloßem Auge fensterartig, wobei jedes Fenster bei erwachsenen männlichen Ratten von Fettgewebe umgeben ist.

Die mesenterialen Fenster sind von Natur aus gefäßbildend und weisen keine messbare physiologische Angiogenese auf. Sie bieten daher die Möglichkeit, die de-novo-Angiogenese in erwachsenem, von Natur aus gefäßbildetem Säugetiergewebe zu untersuchen. Das heißt, die Initiierung einer vollständigen angiogenen Reaktion von Grund auf, wobei die angiogenen Hemmstoffe überwunden werden müssen, die im Testgewebe endogen wirken, wie in allen normalen Geweben von Mäusen. Native Mikrogefäße, die als Ausgangsgefäße fungieren könnten, fehlen in vielen Fenstern, was den Assay in Mäusen in seiner nativen Form leider unvorhersehbar macht.

Die mesenterialen Fenster bei Ratten enthalten normalerweise eine relativ geringe Anzahl kleiner Blutgefäße, die bei erwachsenen Ratten peripher liegen. Diese mesenterialen Fenster sind von Natur aus nur fünf bis zehn Mikrometer dick. Dadurch kann intaktes Gewebe auf Objektträgern ausgebreitet und mikroskopisch untersucht werden, wodurch alle Gefäße in jedem Fenster beobachtet werden können und den Gefäßen im Wesentlichen eine zweidimensionale Ausdehnung verliehen wird.

Die Methode bietet eine beispiellose Gelegenheit, quantitative Messungen der räumlichen Ausdehnung, Dichte, Musterbildung und Größe der Blutmikrogefäße durchzuführen. Der subkutane Ort ist für Angiogenesestudien beliebt; aufgrund der Heterogenität endothelialer Zellen und gewebespezifischer Eigenschaften kann die Kontrolle der Angiogenese in subkutanen Geweben und subkutan wachsenden Tumoren jedoch nicht notwendigerweise die Kontrolle der Angiogenese in metastatischen viszeralen Organen wie Lunge, Leber, Knochen und Gehirn vorhersagen. Dies ist bemerkenswert, da viszerale Metastasen gewöhnlich letztendlich für die Letalität von Krebserkrankungen verantwortlich sind.

Die Tatsache, dass das mesenteriale Fenster viszeral ist, sollte in dieser Hinsicht vorteilhaft sein. Das Ziel unseres Projekts besteht darin, Aspekte der de-novo-Angiogenese quantitativ zu untersuchen. Daher injizieren wir einen etablierten pro-angiogenen Faktor oder eine Testsubstanz intraperitoneal.

Normalerweise injizieren wir fünf Milliliter auf einmal in erwachsene, nicht anästhetisierte Ratten. Ein Volumen dieser Art führt schnell dazu, dass die gesamte Mesenterie der injizierten Flüssigkeit ausgesetzt wird. Jede Lösung, die intraperitoneal verabreicht wird, solange ihr Volumen nicht vernachlässigbar klein ist, sollte alle Zellen im Testgewebe beeinflussen, insbesondere da die mesotheliale Zellschicht, die das äußerst dünne mesenteriale Fenster bedeckt, für gelöste Stoffe hochgradig permeabel ist. Da kein chirurgischer Eingriff erforderlich ist, wird die im mesenterialen Fenster zu untersuchende Angiogenese nicht durch wundheilungsbedingte Angiogenese beeinträchtigt; daher erfolgt die angiogene Behandlung in Form intraperitonealer Injektionen.

Aus praktischen Gründen verwenden wir einen Behandlungsprotokoll, der zwei tägliche Injektionen über einen Zeitraum von fünf Tagen, von Montagmorgen bis Freitagmorgen, umfasst, wie es üblich ist, wenn die angiogenen Wirkungen definierter Proteine wie VEGF 1 65, 1 64 und basisches FGF untersucht werden. Üblicherweise wird Pharmacia-Infusionslösung als Trägersubstanz verwendet. Die Anzahl der Behandlungen mag hoch erscheinen, doch es hat sich gezeigt, dass es nicht immer möglich ist, eine statistisch signifikante Angiogenese hervorzurufen, selbst wenn so starke pro-angiogene Faktoren wie VEGF und basisches FGF in etwa physiologischen Konzentrationen in einer Einzeldosis oder wenigen zeitlich getrennten Dosen verabreicht werden; es sollte beachtet werden, dass starke endogene Angiogenesehemmer im Gewebe wirksam sind.

Die Verabreichung angiogenese-modulierender therapeutischer Modalitäten ahmt eine klinische therapeutische Situation nach. Ein oder mehrere angiogenese-modulierende Faktoren können systemisch, subkutan, intravenös oder oral verabreicht werden. Zum Beispiel.

Dies simuliert eine klinische Behandlungssituation, da nicht nur die Wirkung des Ausgangsmoleküls, sondern auch der Metaboliten untersucht werden kann. Das System ermöglicht einen gewissen Grad an Kontrolle über die toxischen Wirkungen systemisch verabreichter angiogenese-modulierender Substanzen. Da erwachsene Ratten physiologisch wachsen und während eines zwei- bis dreiwöchigen Experiments um etwa 40 % an Gewicht zunehmen können, ist es durch Wägung der Tiere möglich, zu ermitteln, inwieweit die Behandlung die Gewichtszunahme verlangsamt hat, was als Ausdruck toxischer Effekte angesehen werden kann.

Dadurch können toxische Dosen von angiogenese-modulierenden Tests und Substanzen vermieden werden. Ein wichtiger Vorteil, da es andernfalls unmöglich sein könnte, die Ergebnisse im Hinblick auf spezifische anti-angiogenetische Wirkungen zu interpretieren. Da erwachsene Ratten deutlich schneller wachsen als erwachsene Mäuse, sollte die Wirkung toxischer Substanzen auf das Körpergewichtszunahme ein empfindlicherer Indikator für allgemeine toxische Effekte bei Ratten im Vergleich zu Mäusen sein.

Wir möchten Ihnen nun zeigen, wie Mesenteriumfenster-Präparate hergestellt werden. Diese Tiere wurden mittels CO2 getötet. Die Mesenteriumfenster werden beginnend distal im Mesenterium auf gewöhnlichen Plus-Objektträgern mit den Maßen drei mal ein Zoll verteilt.

Die Angiogenese ist im Mesenteriumsfenster mit bloßem Auge nicht sichtbar, beginnend am Ileozökalklappenbereich und in retrograder Richtung fortlaufend. Die vier Fenster, die aus dem am weitesten distalen Teil des Mesenteriums entnommen werden, werden verwendet. Die Probe auf dem Objektträger wird 20 Minuten bei Raumtemperatur getrocknet.

Der Darmstumpf wird abgeschnitten. Die Proben werden anschließend bei minus 20 Grad Celsius eingefroren. Auf diese Weise können die Proben mehrere Monate, vielleicht sogar Jahre lang aufbewahrt werden, ohne dass eine deutliche Qualitätsminderung eintritt.

Die Färbung erfolgt mit einem monoklonalen Antikörper gegen das Rattenendothel. Lassen Sie die Probe an der Luft trocknen, montieren Sie sie nicht mit einem Deckglas. Die Quantifizierung der Blutgefäße in einzelnen mesenterischen Fenstern erfolgt mittels computerunterstützter morphometrischer Mikroskopie unter Verwendung eines Zeichenmikroskops mit einer gesamten optischen Vergrößerung zwischen 14 und 34. Das gesamte mesenterische Fenster wird visualisiert.

Die Vergrößerung wird in festen Schritten gewählt, sodass möglichst großer Teil des Sichtfeldes vom Präparat abgedeckt wird. Der gesamte Bereich des Fensters lässt sich leicht darstellen, da die Grenze zwischen dem Fenster und dem umgebenden Fettgewebe deutlich erkennbar ist. Anschließend werden alle vascularisierten Anteile gemäß sorgfältig definierter Kriterien eingezeichnet.

Selbst die kleinsten neu gebildeten Blutgefäße, deren Durchmesser bei höherer Vergrößerung auf etwa 2,5 bis 3,0 Mikrometer bestimmt wurde, sind deutlich erkennbar. Die Tatsache, dass der mittlere Durchmesser eines erythrozyten Rattentieres gleich oder größer als 6,3 Mikrometer ist, verdeutlicht, wie klein diese Gefäße sind. Der Bereich aller vascularisierten Anteile in einem Fenster als Prozentsatz der Fläche des gesamten Fensters wird als relativer vascularisierter Bereich va bezeichnet.

Es handelt sich im Wesentlichen um eine Messung der räumlichen Ausdehnung der Gefäße, da diese im Grunde eine zweidimensionale Ausdehnung aufweisen; die VA kann beispielsweise mithilfe einer computergestützten Telemetrie leicht bestimmt werden. Der nächste Schritt beinhaltet die Erfassung der Dichte der Mikrogefäße und der Musterbildung in drei zentralen Bereichen der vascularisierten Areale jedes Fensters. Diese Bereiche werden systematisch zufällig bei einer optischen Vergrößerung von 80 ausgewählt.

Jedes Gefäß wird mithilfe eines Zeichenmikroskops als einzelne Linie dargestellt. Das Bild jedes Sichtfelds wird in ein digitalisiertes Bild übertragen und an einen Bildanalysator weitergeleitet, wobei jedes Gefäß im digitalisierten Bild auf eine Dicke von einem Pixel reduziert wird. Die Maschine misst anschließend die Anzahl der Pixel, die die Gefäße repräsentieren, und gibt diese als Bruchteil aller Pixel im Sichtfeld an.

Diese prozentuale Zahl, die mikrovaskuläre Länge oder MVL, stellt die Länge der Mikrogefäße pro Einheit des vascularisierten Bereichs dar und ist eine zusammengesetzte Messgröße für die Dichte der Mikrogefäße. Durch Multiplikation des mittleren Gefäßareals (VA) aus vier Fenstern pro Tier mit der mittleren MVL der entsprechenden Behandlungsgruppe wird die gesamte mikrovaskuläre Länge pro Tier, die TMVL, berechnet. Darüber hinaus haben wir Techniken zur detaillierten quantitativen Analyse der Mikrogefäße, ihrer Dichte und Zusammensetzung mittels Bildanalyse entwickelt.

Dazu gehören die Messung des tatsächlichen Abstands zwischen zwei aufeinanderfolgenden Mikrogefäßen, Verzweigungspunkten, IE, der Länge einzelner Mikrogefäße, Segmente LEMS, der Anzahl von Mikrogefäßen, Segmenten pro Einheit des Gewebevolumens, NOMS, und der Anzahl von Mikrogefäße-Verzweigungspunkten pro Einheit des Gewebevolumens. NOBP. Der Grad der Tortuosität in den Mikrogefäßen MVT ergibt sich aus der Differenz zwischen der kürzesten Distanz und der tatsächlichen Distanz zwischen zwei aufeinanderfolgenden Verzweigungspunkten, dem Auftreten von Mikrogefäßen, die sich kreuzen, dem Index der Intersektion INIS, sowie der Bildung interkonnektierter Schleifen. Der Index der Schleifenbildung INLF kann ebenfalls genau gemessen werden, unter Verwendung ähnlicher Techniken am Rand des Mikrogefäßenetzwerks.

Wir sind außerdem in der Lage, entsprechende Variablen für Sprossungen zu quantifizieren, einschließlich der Länge der Sprossen, LESP, und der Anzahl der Sprossen pro Einheit Gewebelumen, NOSP, wobei Versuche so konzipiert werden, da erhebliche Unterschiede zwischen Tieren derselben Behandlungsgruppe sowie sogar zwischen mesenterialen Fenstern ein- und desselben Tieres auftreten können. Wir haben festgestellt, dass das folgende Design praktikabel sein kann: die Anzahl der Tiere pro Behandlungsgruppe während der Beobachtungszeit, acht bis zwölf; die Anzahl der Fenster pro Tier, die hinsichtlich VA analysiert werden; die Anzahl der Beobachtungsfelder pro Fenster, die hinsichtlich mikrovaskulärer Länge, MVL, analysiert werden; Länge der Mikrogefäße, Segmente, LEMS; Anzahl der Mikrogefäße, Segmente, NOMS; Anzahl der Mikrogefäße, Verzweigungsstellen, NOBP; Mikrogefäße-Tortuosität, MVT; Schnittpunktindex, I; Schleifenbildungsindex, INF. Drei mit einem Fahrzeug behandelte Tiere dienen als Kontrollen. Der Mesenterialfenster-Angiogenese-Assay eignet sich gut für Dosis-Wirkungs-Studien und für kinetische Analysen der Angiogenese.

Dies kann durch die Behandlung von Tiergruppen mit unterschiedlichen Dosen eines pro-angiogenen Faktors und die Tötung dieser Tiere zu verschiedenen Zeitpunkten während der angiogenen Reaktion erfolgen. Dadurch können die expansive Phase, der Höhepunkt und die anschließende angioregressive Phase quantitativ erfasst werden. Studien dieser Art haben gezeigt, dass die de-novo-angiogene Reaktion auf jeden getesteten Wachstumsfaktor-Zytokin spezifisch dosisabhängig hinsichtlich Geschwindigkeit, Potenz und Dauer ist.

Außerdem ist das Muster der neuen Gefäße hinsichtlich räumlicher Ausdehnung und Veränderungen in den Mikrogefäßen und der Dichte oft deutlich dosis- und zeitabhängig, verglichen mit der Angiogenese, die durch VEGF oder basisches FGF bei annähernd physiologischen Dosen vermittelt wird. Die von Mastzellen vermittelte Angiogenese, MCMA, die durch selektive Aktivierung von Mastzellen vor Ort induziert wird, zeichnet sich durch eine erheblich höhere Wirksamkeit und bemerkenswert längere Dauer aus. Tatsächlich wurde die von Mastzellen vermittelte Angiogenese erstmals mithilfe dieses Assays beschrieben, aufgrund der Möglichkeit, objektive Angiogenese-Variablen zu quantifizieren, des hohen Grades an biologischer Relevanz des Systems und der Möglichkeit, toxische Wirkungen der Behandlung zu überprüfen.

Die Methodik eignet sich einzigartig für Struktur-Wirkungs- und Dosis-Wirkungs-Analysen. Das Ratten-MWAA bietet ein Modell zur Untersuchung der Angiogenese in einem erwachsenen, ursprünglich vaskularisierten viszeralen Gewebe, das über keine physiologische Angiogenese verfügt und nicht durch chirurgische Eingriffe beeinflusst wird, wodurch jeglicher Einfluss einer wundheilungsbedingten Angiogenese ausgeschlossen ist. Der Test ist tatsächlich quantitativ und erfasst präzise eine Reihe biologisch relevanter objektiver Variablen, die die räumliche Ausdehnung, Dichte und Musterbildung von Mikrogefäßen beschreiben.

Der Test eignet sich gut für die Untersuchung der systemischen Wirkungen der Angiogenese sowie von modulierenden Faktoren und für Struktur-Wirkungs- sowie Dosis-Wirkungs-Studien. Die hier beschriebene Methodik wurde im Labor von Dr. Kloss Carl Norby an der Abteilung für Pathologie des Reka-Universitätsklinikums, jute Borg Universität Göteborg in Schweden entwickelt. Alle Studien in diesem Projekt wurden vom Schwedischen Medizinischen Forschungsrat, Projektnummer 5 9 4 2, unterstützt.

Wir danken Frau Gun Effer, die seit Beginn des Projekts beteiligt ist, Frau Monica Anderson, die nicht anwesend ist, und Frau Ann Nemar Lindgren für ihre kompetente technische Unterstützung.

Ich hoffe, dass diese kurze Präsentation Ihnen einen Eindruck von den Möglichkeiten des Assays vermittelt hat. Falls Sie diesen Assay in Ihrem Labor verwenden, stehe ich Ihnen gerne zur Verfügung, falls technische Probleme auftreten sollten. Außerdem würde ich mich sehr über jegliche Anregungen freuen, die Sie haben könnten.

Vielen Dank.