Name: Rat Mesenterium Angiogenese Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 30 s
Description: Erfahren Sie quantitative Angiogenese-Analyse im Rattenmesenterium zur Untersuchung von Gefäßneubildung und Krebsmetastasen. Diese Methode ermöglicht präzise Messungen von Mikrogefäßdichte und räumlicher Ausdehnung.

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Finanzielle Unterstützung für die meisten Studien wurde von der schwedischen Medical Research Council (Stipendium 5942) zur Verfügung gestellt.

1. Animals <ol><li> Kleine Nagetiere wie Ratten, Mäuse und Meerschweinchen haben als Tiermodelle verwendet worden. Leider neigen erwachsenen Mäusen (viele Mausstämme wurden bewertet), um fehlende oder nur eine sehr geringe Anzahl von potenziellen Elternteil Mikrogefäßen (von denen die Angiogenese entstehen können) innerhalb ihrer mesenterialen Fenster, was Studien mit Mäusen unzuverlässig. Deshalb hat der Test vor allem für Ratten entwickelt. </li><li> Die Ratten, die zu einer Standard-Umgebung für mindestens 7 Tage nach Auslieferung vom Züchter sind akklimatisiert, sind in der Regel paarweise in einem Standard-Käfig untergebracht unter einem 12-Stunden Licht / Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Wasser und Pellets. Jedes Tier ist markiert. Wir verwenden meist jungen erwachsenen Ratten (in der Regel 7-10 Wochen alt verschiedener Stämme aber in der Regel männlichen Sprague-Dawley Ratten; bei Ratten jünger als 5-6 Wochen im Alter von der Zahl der einheimischen Mikrogefäßen eher gering zu sein) aus verschiedenen Züchtern erhalten. In der Zeit vor dem Experiment und während des Experiments werden die Tiere gewogen jeden zweiten Tag, und immer am Tag des Opfers. Wenn die Tiere behandelt werden, gleichzeitig ip (für die Induktion der Angiogenese, siehe unten) und sc oder iv oder po, sie werden gewogen jeden Tag. Dies ermöglicht die Einrichtung von Versuchs-und Kontrollgruppen gleich Körpergewicht zu Beginn des Experiments, und erlaubt die Überwachung der Einfluss der Behandlung auf Körper-weight-gain im Verlauf des Experiments. Da erwachsenen männlichen Ratten robust wachsen physiologisch (Gewinnung etwa 40-60 g pro Woche, je nach Art der Belastung), ist Gewichtszunahme Retardierung ein sensibles Ersatz-Marker der Toxizität, systemische Wohlbefinden, Appetitlosigkeit und Gedeihstörungen. </li></ol> Wir arbeiten in einem High-Standard-Tierstation und erhebliche Anstrengungen unternommen werden, um die Höhe der Belastung durch die Tiere erlebt zu minimieren. Die aktuellen ethischen Richtlinien sind die von Workman P. et al. (Richtlinien für das Wohlergehen und die Verwendung von Tieren in der Krebsforschung. Br. J. Cancer 102, 1555-77, 2010). The Animal Ethikkommission der Universität Göteborg genehmigt diese Studien. 2. Pro-angiogenen intraperitoneale Behandlung <ol><li> Der Kandidat pro-angiogenen Faktor getestet werden gelöst und verdünnt in die Endotoxin-freie Kochsalzlösung zur Infusion von Patienten verwendet werden (auch bei extrem niedrigen Niveau, ist die Endotoxin-pro-angiogenen). Alle Lösungen sind bis frisch am Tag der Injektion, sterilfiltriert (Millipore 0,22-um Filtration) gemacht, geprüft neutralen pH-Wert (7.1-7.3), und verwendet bei Raumtemperatur. Der Test-Agent wird bei niedrigen oder sehr niedrigen Konzentrationen injiziert. Zum Beispiel, Ratte rVEGF 164 (564-RV/CF; R &amp; D Systems Europe, Ltd, Oxon, UK) ist, die die vorherrschende VEGF-A-Isoform bei Ratten ist, auf 96 pmol / ml in Endotoxin-freie Kochsalzlösung verdünnt, gefroren und aufgetaut und einem Volumen von 5 ml injiziert ip in der Ratte. Wir verwenden eine 5-ml-Spritze mit 0,8-mm-Nadel (grüne Nadel, 21G) für ip-Injektion. Diese Behandlung, zweimal täglich über 4,5 Tage, dh. Gegeben, von Montag Morgen (Tag 0) bis Freitagmorgen (Tag 4), führt zu einem robusten sprießen Angiogenese Reaktion in den mesenterialen Test Gewebe mit einem Spitzenwert von rund Day 21. Die Verwaltung der Lösung ip sorgt dafür, dass das gesamte Volumen in die Bauchhöhle (und nicht in den Darm, Blase oder jedes andere Organ) geliefert wird. Die schnelle Injektion von 5 ml ermöglicht taktile Bestätigung durch den Betreiber, dass der Flüssigkeitsstrahl hat durch die Bauchdecke in die Bauchhöhle geleitet. Nach, vor oder gleichzeitig mit der IP-pro-angiogenen Therapie kann jeder testen Mittel der Wahl systemisch verabreicht werden. </li></ol> 3. Systemische Administation der Angiogenese-modulierenden Agents <ol><li> Jede Route anderes als die ip route kann verwendet werden, da ip Behandlung der laufenden angiogenen Reaktion durch die Induktion der Entzündung oder möglicherweise durch die Aktivierung der Mastzellen im Test Gewebe, was zu einer starken pro-angiogene Reaktion führen kann beeinflussen können. Neben oralen Verabreichung oder einzelne Injektion sc oder iv, benutzen wir oft sc Verabreichung mit osmotische Minipumpen (eine oder mehrere, mit unterschiedlichen Volumina und Pumpzeiten) zu der Lösung mit einer konstanten Rate von bis zu liefern, um zwei oder mehrere Wochen. </li><li> Die kontinuierliche subkutane Infusion von Test-Agenten Abfüll-und Implantation von osmotischen Minipumpen In der Regel an Tag 5, also einen Tag nach dem Ende der ip Behandlung mit VEGF, osmotische Minipumpen (z. B. Modell 2ML2, mit konstanter Pumprate von 5,0 ul / h für 14-15 Tage; Alzet osmotische Pumpen, Mountain View, CA , USA) werden unter sterilen Bedingungen mit dem Test-Agent oder das passende Fahrzeug gefüllt. Nach der Lagerung in 0,9% (w / v) NaCl über Nacht bei 37 ° C, die Pumpe (n) werden chirurgisch sc auf dem Rücken implantiert (an der Seite des Rückenmarks Column in den Bereich der Schulterblätter) von Ratten, die betäubt wurden mit Isofluran-Gas (Isoba Tierarzt; Schering-Plough Animal Health, Merck &amp; Co., Inc., Whitehouse Station, NJ, USA), zunächst in einer luftdichten Kammer und transparent anschließend über eine Maske (um den Stress verursacht die folgenden Tier zu minimieren, wird die Kammer mit Luft gespült, bevor sie wiederverwendet wird). Der Hautschnitt für Pumpe Implantation gemacht wird vernäht sofort nach der Implantation mit seidenen Faden. Da die Tiere an Gewicht zunehmen physiologisch während der experimentellen Phase und der Test-Agenten sind mit einer konstanten Rate verabreicht wird, ist die tatsächliche Dosis für einen Test Droge pro kg Körpergewicht höher gewählt werden als die durchschnittliche Dosierung zu Beginn der Infusion und niedriger als der durchschnittliche Dosis am Ende der Infusion. Kontinuierliche Infusion, wie hier beschrieben, kann als eine erweiterte Form der metronomischer Behandlung angesehen werden. </li></ol> 4. Beenden des Experiment <ol><li> Ein Tier zu einer Zeit, in einem transparenten luftdichten Kammer, die mit CO 2-Gas, die sich schnell tötet das Tier gespült platziert wird. Die Kammer ist mit Luft, bevor sie wieder verwendet werden gespült. </li></ol> 5. Harvesting Gewebeproben <ol><li> Wie in der DVD gezeigt, ist die Bauchdecke geöffnet und die kleinen Darm Mesenterium identifiziert, darunter die meisten distalen Teil, dass die Ileocoecalklappe (der Kreuzung der Dünndarm und den Dickdarm) erreicht. Vier (oder mehr) der distal gelegen &quot;Fenster&quot; sind gezählt und die Ausbreitung auf objektiven Maßstab unbehandelten Superfrost Plus-Objektträger (DAKO Denmark A / S, Glostrup, Dänemark). Es ist wichtig, um zu vermeiden, wenn möglich, Kontamination der Proben mit Blut, Darminhalt oder anderen Körperflüssigkeiten, da diese Materialien können gebeizt unspezifisch, obwohl dies nicht die Unwirksamkeit nicht die anschließende immunhistochemische Visualisierung von Mikrogefäßen. </li><li> Jeder mesenterialen Fenster Probe mit angeschlossenem kleinen Darm-Segment befindet sich auf einem Objektträger ausgestrichen und getrocknet bei Raumtemperatur für 20 Minuten. Dann wird der Darm Stumpf abgeschnitten, während die intakte membranöse Mesenterium Proben bei -20 ° C über einen längeren Zeitraum gespeichert werden. Dies wird in der DVD gezeigt. </li></ol> Es sollte erwähnt werden, dass das Gewebe und zum Patent Gefäßsystem visualisiert werden können, bevor sie mit Durchlicht Intravitalmikroskopie Ernte. 6. Protokoll für die immunhistochemische Färbung von Mikrogefäßen <ol><li> Tag 0 Die Proben dürfen von -20 ° C bis Raumtemperatur, in einem Schrank bei 60 ° C getrocknet 1 Stunde auftauen und hielt über Nacht bei Raumtemperatur. </li><li> Tag 1 Legen Sie die Folien in Färbung Objektträgerhalter (in jeder zweiten Spur) in einer Küvette und waschen zweimal mit TBS (pH 7,8) für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Die Lösung wird verworfen und durch die nächste Lösung, und so weiter für alle folgenden Schritte. </li><li> Trypsin-Behandlung Füllen Sie die Küvette, dass die Färbung Diahalter mit Trypsin-Lösung (25 ° C für 20 Minuten) wird den Hafen. Entsorgen Sie die Lösung, Inkubation zweimal mit 2,5% Saccharose-Lösung (Raumtemperatur für jeweils 10 Minuten Zeit). Entsorgen Sie die Lösung und spülen Sie ein paar Mal in aqua dest (Raumtemperatur für ein paar Minuten). </li><li> Sperrung Füllen Sie die Küvette, dass die Färbung Diahalter mit 0,5% H 2 O 2 in Methanol (Raumtemperatur 30 Minuten) wird den Hafen. Entsorgen Sie die Lösung und spülen mit Aqua dest (Raumtemperatur für ein paar Minuten). Entsorgen Sie die Lösung und spülen Sie zweimal mit TBS (pH 7,4) (Raumtemperatur für 8 Minuten jedes Mal). </li><li> Incubation Alle Inkubationen werden in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur. Etwa 150 ul jeder der aufgeführten Lösungen sind pro Folie verwendet. Die Folien sind in einer feuchten Kammer gelegt und die Lösungen sind auf die Proben (nicht-membranöse Teile müssen nicht durch die Lösungen abgedeckt werden) pipettiert. Für jede der folgenden Schritte sorgfältig abschütteln alle der Lösung vor der anschließenden Lösung versetzt. <ol><li> Inkubation mit Normal (Blockierung) im Serum (Pferd) (ABC-Kit) 3 Tropfen gelbe Lösung / 10 ml Verdünnungspuffer für 20 Minuten. </li><li> Inkubation mit primärem Antikörper ARU0181, die Ratte vaskulären Endothelzellen Etiketten. Der Antikörper wird 1:600 ​​mit Verdünnungspuffer (Biosource) (100 ul verdünnt 40-fach [gefrorenen] plus 900 ul Verdünnungspuffer) und Inkubation verdünnt erfolgt über Nacht bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Tag 2 Die Folien aus der feuchten Kammer entfernt werden, wird der primäre Antikörper verworfen, und die Folien sind in einer Färbung Diahalter, die in der Küvette eingetaucht ist und zweimal mit TBS gespült platziert(PH 7,8) für 8 Minuten. <ol><li> Inkubation mit biotinylierten Antikörper (ABC-Kit) Die Folien sind horizontal in einer befeuchteten Kammer platziert und mit 1 Tropfen blaue Lösung / 10 ml Verdünnungspuffer für 30 Minuten. Entsorgen Sie die Lösung und Objektträger in eine Färbung Diahalter in die Küvette eingetaucht und gründlich zweimal mit TBS (pH 7,4) für 8 Minuten. </li><li> Die Inkubation mit dem ABC-Reagenz Die Folien sind wieder horizontal in einer befeuchteten Kammer platziert und die folgenden Lösungen sind auf die membranöse Teile der Proben pipettiert: 2 Tropfen orange Lösung plus 2 Tropfen braune Lösung / 10 ml TBS (pH 7,4) für 30 Minuten. Vorsichtig mischen 30 Minuten vor Gebrauch! Entsorgen Sie die Lösung und Objektträger in den Diahalter in die Küvette und spülen Sie zweimal mit TBS (pH 7,4) für 8 Minuten. </li></ol></li><li> Färbung mit DAB (0,05%) Dieser Schritt muss in einem gut belüfteten chemische Abzug durchgeführt werden! Legen Sie die Folien und fügen Sie die 3,3-Diaminobenzidin (DAB, Sigma-Aldrich)-Lösung mit einer Pipette: 0,1% DAB-Lösung in TBS (pH 7,4) [gefrorenen] ist 1:1 mit einem Gemisch aus 10 ul H 2 O verdünnt 2 und 7,5 ml TBS (pH 7,4). Diese Lösung wird sterilfiltriert unmittelbar vor Gebrauch (um Partikel, die das mikroskopische Bild verdunkeln, zu beseitigen). Stain die Proben für 8 Minuten. Entsorgen Sie die Lösung und Objektträger in der Färbung Diahalter in die Küvette getaucht. Spülen unter fließendem Leitungswasser und dann in Aqua dest für ein paar Minuten. </li><li> Austrocknung Die Folien sind in der Färbung Diahalter gehalten. Spülen durch das Wegwerfen und Nachfüllen der Küvette mit aqua dest / Ethanol: aqua dest, 70% Alkohol, 95% Alkohol, absolutem Alkohol, mit 2 Minuten in jeder Lösung. </li></ol> 7. Imaging und Beurteilung der mikrovaskulären Netzwerk in jedem Mesenteriale Fenster Probe nach der immunhistochemische Färbung von vaskulären Endothelzellen Wie im Film gezeigt werden Mikrogefäßen mikroskopisch visualisiert in situ in das intakte Gewebe. <ol><li> Erstens verwenden wir eine Zeichnung Mikroskop mit Vergrößerungsbereich 14 bis 34 (Leica Wilde M 3Z) zu Bleistift auf weißem Papier die gesamte Fensterfläche, sowie die gesamte vaskularisierten Bereich (VA) pro mesenterialen Fenster. VA, als Prozentsatz der gesamten Fläche ist leicht gemessen anhand elektronischer oder nicht-automatisiert Planimetrie (oder einfach durch Ausschneiden und Gewichtung des Bildes des gesamten Fensters, und die Bilder von allen vaskularisierten Teile). </li><li> Mit einer anderen Zeichnung Mikroskop einzelne microvessel Profile, die leicht erkennbar sind, werden in schwarzer Tinte auf weißem Papier bei 80 Vergrößerung in zufällig ausgewählten Bereichen gezogen. Dies ist der Ausgangspunkt für die nachfolgende computergestützte morphometrische Beurteilung der mikrovaskulären Länge (MVL), die im Grunde eine Messung der mikrovaskulären Dichte. </li><li> Optional Variablen in Bezug auf mikrovaskuläre Musterbildung, können ebenso wie die für die Beurteilung der Anzahl der mikrovaskulären Sprossen und Länge der einzelnen mikrovaskuläre Sprossen (Nr. SP und Le. SP bezeichnet) ermittelt werden. -Der optimale Kontrast zwischen der abgebildeten schwarzen Gefäßstrukturen und den weißen Hintergrund ermöglicht detaillierte Analysen der Bilder in den meisten kommerziellen morphometrische EDV-Programme. </li><li> In den meisten Fällen sind die wichtigsten Variablen VA und MVL, die, wenn miteinander multipliziert erzeugen die insgesamt mikrovaskuläre Länge (TMVL). </li></ol> 8. Statistische Analyse Wir verwenden normalerweise den Standard nicht-parametrischen Mann-Whitney-U-Test zu ungepaarten (zweiseitig) Beobachtungen zu analysieren. Ein Mittelwert von vier mesenterialen Fenster pro Tier wird als unabhängige Daten-Punkt für jede Variable der mesenterialen Fenster verwendet. Das Kriterium für die statistische Signifikanz P ≤ 0,05.

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</ol>

Der Assay wurde in 1986 3 eingeführt und hat sich sukzessive weiter entwickelt und verfeinert in unserem Labor 7,10-12. Wie in Übersichtsartikeln (invited) 1, 2 diskutiert, vergleicht der Test auch mit anderen Säugetieren in vivo Angiogenese-Assay in Bezug besonders auf wichtige Funktionen wie die erwachsenen Probanden Gewebe nativ vaskularisiert und fehlt physiologischen Angiogenese; minimales Trauma, wenn überhaupt, zugefügt auf das Gewebe, wirklich quantitative Variablen gemessen werden, die fundierte statistische Analyse im Hinblick auf Dosis-Wirkungs-und molekular-Aktivitäts-Studien ermöglicht, sprießen Angiogenese auftritt, was in normalen Geweben und Tumoren überwiegen, und Toxizitätsdaten sind leicht in Ratten, die kräftig wachsen angesammelt physiologisch im Erwachsenenalter. Nachteilige Eigenschaften kann die Tatsache, dass der Test relativ zeitaufwendig ist, vor allem bei der Beurteilung der Anzahl und Länge der einzelnen Segmente und microvessel microvessel Sprossen; dass es nicht möglich real-time/serial Beobachtungen, und dass es kaum geeignet für Mäuse da viele mesenterialen Fenster in Mäusen potenzielle Eltern Mikrogefäßen Mangel, aus dem neue Kapillaren entstehen können. Real-time Beobachtungen sind jedoch durch Intravitalmikroskopie wo die exteriorisierten aber intakt mesenterialen Fenster gespreizt werden über einen Mikroskoptisch, während das Tier narkotisiert, wie in 1 beschrieben aktiviert. Bedeutsame Fortschritte bei der Angiogenese-Forschung haben in den vergangenen Jahrzehnten mit Modellen wie dem Hornhaut-Micropocket, chick Chorioallantoismembran und sc Matrigel-Plug-Assays, die nützlich, aber letztlich begrenzt Werkzeuge sind erreicht worden. Zukünftige klinische Anwendungen von anti-angiogenen und pro-angiogenen Therapien erfordern die Etablierung und Validierung von empfindlicher und biologisch relevanten, wirklich quantitative vorklinischen Modellen, wie die im aktuellen Bericht beschrieben.

Puffer und Reagenzien 0,5 M Tris-HCl (pH 7,8) Stammlösung Tris (hydroxymethyl) aminomethan (60,57 g) wird in ~ 900 ml Aqua dest gelöst, und ~ 45 ml 25% HCl (konzentriert) wird hinzugefügt, um pH 7,8 durch Verdünnung auf 1 Liter mit Aqua dest gefolgt erreichen. Tris-Puffer-Kochsalzlösung (TBS, pH 7,8) Zu 200 ml der Stammlösung hinzugefügt wird 18 g NaCl in ~ 1800 ml Aqua dest mit Einstellung des pH auf 7,8 mit der Stammlösung durch Verdünnen auf 2 Liter mit Aqua dest gelöst und anschließend. TBS (pH 7,4) Zu 200 ml der Stammlösung beträgt 18 g NaCl gelöst in ~ 1800 ml Aqua dest mit Einstellung des pH auf 7,4 mit der Stammlösung durch Verdünnen auf 2 Liter mit Aqua dest gelöst und anschließend aufgenommen. Trypsin-Lösung (0,05% Trypsin, 0,1% CaCl 2) Enthält 0,1 g Trypsin und 0,2 g CaCl 2 in 200 ml TBS (pH 7,8). Saccharose-Lösung 2,5% Enthält 5 g Saccharose in 200 ml TBS (pH 7,8). Stammlösung von 1% Natriumazid in TBS (pH 7,4) Enthält 1 g Na-Azid in 100 ml mit TBS (pH 7,4). Verdünnungspuffer: 0,1% BSA, 0,01% Na-Azid (Verwendet, um Antikörper in der Vectastain ABC Kit verdünnen). Enthält 0,1 g Rinderserumalbumin (BSA) und 1 ml 1% Na-Azid, verdünnt auf 100 ml mit TBS (pH 7,4). ABC-Kit Vectastain PK 4002, ABC-Peroxidase-Maus IgG Normale Pferdeserum; Blockierserum; gelbe Lösung: 3 drops/10 ml Verdünnungspuffer. Biotinylierten Antikörper, anti-Maus IgG; blaue Lösung: 1 drop/10 ml Verdünnungspuffer. ABC-Reagenz: orange Lösung, 2 Tropfen plus brauner Lösung 2 drops/10 ml TBS (pH 7,4). Mix dieser Lösungen 20 Minuten vor Gebrauch! Maus (monoklonalen) Anti-Ratte Endothel (Biosource International, Camarillo, CA, USA) <table border="1"><tbody><tr><td> Catalog # </td><td> ARU0181 </td></tr><tr><td> Klon # </td><td> MRC OX-43 </td></tr></tbody></table> Dieser Antikörper ist gegen alle vaskulären Endothelzellen der Ratte gerichtet ist, mit Ausnahme der in das Gehirn. Vectastain Peroxidase Avidin Biotin Complex (ABC)-Kit Das Kit enthält primärer Antikörper, biotinylierten sekundären Antikörper, Avidin-biotinylierten Enzym-Komplex (ABC) und Enzym-Substrat. Siehe <a href="http://www.vectorlabs.com/">www.vectorlabs.com</a> oder <a href="http://www.immunkemi.se/">www.immunkemi.se</a> für Protokolle. Rinderserumalbumin (BSA) (Sigma-Aldrich, Katalog # A-4503). DAB = 3,3 &#39;-Diaminobenzidin Isopac (Sigma-Aldrich, Katalog Nr. D 9015). Trypsin aus Rinderpankreas (Sigma-Aldrich, Katalog # T 4665). Vectastain Peroxidase ABC-Kit, Maus IgG (Immunkemi F &amp; E-AB, Järfälla, Schweden)

rat mesenterium angiogenese assay

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

Die erwachsenen Ratte Mesenterium Fenster Angiogenese-Assay ist biologisch angemessenes und ist außergewöhnlich gut auf das Studium der Austrieb der Angiogenese in vivo geeignet [siehe Übersichtswerke], die die dominierende Form der Angiogenese in menschlichen Tumoren und Non-Tumor-Gewebe ist, wie in eingeladen Beitrag diskutierten Papiere 1,2. Angiogenese in den häutigen mesenterialen Teile durch intraperitoneale (ip) Injektion eines pro-angiogenen Faktor induziert werden kann durch subkutane (sc), intravenös (iv) oder oral (po) Behandlung mit Modifizierungsmitteln der Wahl moduliert. Jeder membranösen Teil des Mesenteriums ist durchscheinend und umrahmt von Fettgewebe, so dass es ein Fenster Aussehen. Der Test weist die folgenden vorteilhaften Eigenschaften: (i) der Test Gewebe nativ vaskularisiert, wenn auch spärlich, und da es extrem dünn ist, ist die microvessel Netzwerk nahezu zweidimensional, was kann das gesamte Netzwerk zu mikroskopisch in situ beurteilt werden; ( ii) bei erwachsenen Ratten den Test Gewebe fehlt signifikanten physiologischen Angiogenese, die die meisten normalen Erwachsenen Säugetiergewebe charakterisiert; der Grad der nativen Vaskularisation ist jedoch, korreliert mit dem Alter, wie in 1 beschrieben, (iii) die vernachlässigbares Niveau von Trauma-induzierte Angiogenese sorgt für eine hohe Empfindlichkeit, (iv) der Test bildet die klinische Situation, da die Angiogenese-modulierenden Medikamenten-Test systemisch und verwaltet werden die Antworten beobachtet spiegeln den Nettoeffekt aller Stoffwechsel-, zelluläre und molekulare Veränderungen, die durch die Behandlung induziert, (v) des Assays erlaubt Einschätzungen objektive, quantitative, objektive Variablen der mikrovaskulären räumliche Ausdehnung, Dichte und Netzwerk Musterbildung, sowie der Kapillare sprießen, wodurch robuste statistische Analysen der Dosis-Wirkungs-und molekulare Struktur-Aktivitäts-Beziehungen, und (vi ) der Test zeigt, mit hoher Empfindlichkeit die toxische oder schädliche Auswirkungen von Behandlungen in Form verringerter Satz von physiologischen Körper-Gewichtszunahme, als erwachsene Ratten robust wachsen. Mast-Zell-vermittelten Angiogenese wurde zum ersten Mal gezeigt, mit Hilfe dieses Tests 3,4. Das Modell zeigt ein hohes Maß an Diskriminierung in Dosis-Wirkungs-Beziehungen und den gemessenen Wirkungen von systemisch verabreichten chemisch oder funktional eng verwandten Medikamenten und Proteinen, einschließlich: (i) niedrig dosierte, metronomisch verabreichten Standard-Chemotherapeutika, die vielfältigen, Drogen-spezifischen Effekte ergeben (dh, Angiogenese-suppressive, neutral oder Angiogenese-stimulierenden Tätigkeiten 5), (ii) natürliches Eisen-ungesättigten humanes Lactoferrin, das VEGF-A-vermittelte Angiogenese 6 stimuliert und natürliche Eisen-ungesättigten bovinem Lactoferrin, das hemmt die VEGF-A- Angiogenese 7; und (iii) niedermolekulare Heparin Fraktionen mit verschiedenen Mitteln 8,9 produziert. Darüber hinaus ist der Test sehr zum Studium der kombinierten Effekte auf die Angiogenese von Agenten, die systemisch sind in einem parallel oder sequentiell verabreicht Mode geeignet. Die Idee, dieses Video entstand aus dem späten Dr. Judah Folkman, wenn er unserem Labor besucht und erlebt die Methode demonstriert. Bewertung Papiere (angefragt) diskutieren und Beurteilung des Tests Norrby, K. In-vivo-Modellen der Angiogenese. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006). Norrby, K. Drogentests mit Angiogenese-Modellen. Expert Opin. Drug. Entdeckung. 3, 533-549 (2008).

Normalen Erwachsenen vaskularisierten Säugetiergewebe, dass physiologische Angiogenese fehlt und die nicht zur chirurgischen Intervention wird verwendet, um Studie ausgesetzt worden: (i) die Initiierung und Entwicklung der Angiogenese nach intraperitonealer Verabreichung von Test-Agenten, und (ii) die Veränderung der Angiogenese nach systemischer Gabe von ausgewählten Test-Agenten.

Rat Mesenterium Angiogenese Assay

Der Angiogenese-Assay im Mesenterialfenster der erwachsenen Ratte ist biologisch angemessen und eignet sich außergewöhnlich gut für die Untersuchung der sprossenden Angiogenese in ...

Willkommen an der Abteilung für Pathologie am GaN-Universitätsklinikum in Guttenburg, Schweden. Ich bin Dr. Klaus Norby, und die Methode, die Sie gleich sehen werden, wurde in meinem Labor entwickelt. Klinisch relevante Angiogenese, die im Zusammenhang mit Hypoxie, soliden Tumoren oder jeder anderen angiogenetischen Erkrankung auftritt, findet nahezu ausschließlich in nativ vaskularisiertem Gewebe statt. Bei erwachsenen kleinen Nagetieren enthält das Mesenterium, das den Dünndarm mit der Hinterwand des Körpers verbindet, eine Reihe dünner membranöser Abschnitte. Bei Ratten gibt es etwa 40 bis 50 dieser mesenterischen Fenster. Sie sind praktisch durchsichtig und daher mit bloßem Auge fensterartig, wobei jedes Fenster von Fettgewebe umgeben ist, und zwar bei erwachsenen männlichen Ratten.Die mesenterialen Fenster sind von Natur aus vaskularisiert und weisen keine messbare physiologische Angiogenese auf. Sie bieten daher die Möglichkeit, die de-novo-Angiogenese in erwachsenem, von Natur aus vaskularisiertem Säugetiergewebe zu untersuchen. Das heißt, die Initiierung einer vollständigen angiogenen Reaktion von Grund auf, wobei die endogen im Testgewebe wirkenden Angiogenesehemmer überwunden werden müssen, wie sie in allen normalen Geweben von Mäusen vorkommen. Native Mikrogefäße, die als Ausgangsgefäße fungieren könnten, fehlen in vielen Fenstern, was den Assay in Mäusen in seiner nativen Form leider unvorhersehbar macht.Die mesenterialen Fenster bei Ratten enthalten normalerweise eine relativ geringe Anzahl kleiner Blutgefäße, die bei erwachsenen Ratten peripher gelegen sind. Diese mesenterialen Fenster sind von Natur aus nur fünf bis zehn Mikrometer dick. Dadurch kann intaktes Gewebe auf Objektträgern ausgebreitet und mikroskopisch untersucht werden, wodurch alle Gefäße in jedem Fenster sichtbar werden und den Gefäßen im Wesentlichen eine zweidimensionale Ausdehnung verliehen wird.Die Methode bietet eine beispiellose Gelegenheit, quantitative Messungen der räumlichen Ausdehnung, Dichte, Musterbildung und Größe der Blutmikrogefäße durchzuführen. Der subkutane Ort ist für Angiogenesestudien beliebt; aufgrund der Heterogenität endothelialer Zellen und gewebespezifischer Eigenschaften kann die Kontrolle der Angiogenese in subkutanen Geweben und subkutan wachsenden Tumoren jedoch nicht notwendigerweise die Kontrolle der Angiogenese in metastatischen viszeralen Organen wie Lunge, Leber, Knochen und Gehirn vorhersagen. Dies ist bemerkenswert, da viszerale Metastasen gewöhnlich letztendlich für die Letalität von Krebserkrankungen verantwortlich sind.Die Tatsache, dass das mesenteriale Fenster viszeral ist, sollte diesbezüglich vorteilhaft sein. Das Ziel unseres Projekts besteht darin, Aspekte der de-novo-Angiogenese quantitativ zu untersuchen. Daher injizieren wir einen etablierten pro-angiogenen Faktor oder eine Testsubstanz intraperitoneal.Normalerweise injizieren wir fünf Milliliter auf einmal in erwachsene, nicht anästhetisierte Ratten. Ein solches Volumen führt dazu, dass die gesamte Mesenterie rasch mit der injizierten Flüssigkeit in Kontakt kommt. Jede Lösung, die intraperitoneal verabreicht wird, solange ihr Volumen nicht minimal ist, sollte alle Zellen im Testgewebe beeinflussen, insbesondere da die Mesothelschicht, die das äußerst dünne mesenteriale Fenster bedeckt, für gelöste Stoffe hochgradig permeabel ist. Da kein chirurgischer Eingriff erforderlich ist, wird die im mesenterialen Fenster zu untersuchende Angiogenese nicht durch wundheilungsbedingte Angiogenese beeinträchtigt. Daher erfolgt die angiogenetische Behandlung in Form von intraperitonealen Injektionen.Aus praktischen Gründen verwenden wir einen Behandlungsprotokoll, der zwei tägliche Injektionen über einen Zeitraum von fünf Tagen, von Montagmorgen bis Freitagmorgen, umfasst, wie es üblich ist, wenn die angiogenen Wirkungen definierter Proteine wie VEGF 1 65, 1 64 und basisches FGF untersucht werden. Üblicherweise wird Pharmacia-Infusionslösung als Träger verwendet. Die Anzahl der Behandlungen mag hoch erscheinen, doch es hat sich gezeigt, dass es nicht immer möglich ist, eine statistisch signifikante Angiogenese hervorzurufen, selbst wenn so starke pro-angiogene Faktoren wie VEGF und basisches FGF in etwa physiologischen Konzentrationen in einer Einzeldosis oder wenigen zeitlich getrennten Dosen verabreicht werden; es sollte berücksichtigt werden, dass starke endogene Angiogenesehemmer im Gewebe wirken.Die Verabreichung angiogenese-modulierender therapeutischer Modalitäten ahmt eine klinische therapeutische Situation nach. Ein oder mehrere angiogenese-modulierende Faktoren können systemisch, subkutan, intravenös oder oral verabreicht werden. Zum Beispiel.Dies simuliert eine klinische Behandlungssituation, da nicht nur die Wirkung des Ausgangsmoleküls, sondern auch der Metabolite untersucht werden kann. Das System ermöglicht ein gewisses Maß an Kontrolle über die toxischen Wirkungen systemisch verabreichter angiogenese-modulierender Wirkstoffe. Da erwachsene Ratten physiologisch wachsen und während eines zwei- bis dreiwöchigen Experiments um etwa 40 % an Gewicht zunehmen können, ist es durch Wägung der Tiere möglich, zu ermitteln, inwieweit die Behandlung den Gewichtszuwachs verlangsamt hat, was als Ausdruck toxischer Effekte angesehen werden kann.Dadurch können toxische Dosen bei angiogenese-modulierenden Tests vermieden werden, wodurch Substanzen, die toxisch wirken, ausgeschlossen werden können. Ein wesentlicher Vorteil, da es andernfalls unmöglich sein könnte, die Ergebnisse im Hinblick auf spezifische antiangiogene Effekte zu interpretieren. Da erwachsene Ratten deutlich schneller wachsen als erwachsene Mäuse, sollte die Wirkung toxischer Substanzen auf die Körpergewichtszunahme bei Ratten ein empfindlicherer Indikator für allgemeine toxische Effekte sein als bei Mäusen.Wir möchten Ihnen nun zeigen, wie Mesenteriumfenster-Präparate hergestellt werden. Diese Tiere wurden mittels CO2 getötet. Die Mesenteriumfenster werden beginnend distal im Mesenterium auf gewöhnlichen Plus-Objektträgern mit den Maßen drei mal ein Zoll verteilt.Die Angiogenese kann im Mesenteriumsfenster mit bloßem Auge nicht beobachtet werden, ausgehend vom Ileozökalklappen und in retrograder Richtung fortgesetzt. Die vier Fenster, die vom am weitesten distal gelegenen Teil des Mesenteriums entnommen werden, werden verwendet. Die Probe auf dem Objektträger wird 20 Minuten lang bei Raumtemperatur getrocknet.Der Darmstumpf wird abgeschnitten. Die Proben werden anschließend bei minus 20 Grad Celsius eingefroren. Auf diese Weise können die Proben mehrere Monate, vielleicht sogar Jahre lang aufbewahrt werden, ohne dass eine deutliche Qualitätsminderung eintritt.Die Färbung erfolgt mit einem monoklonalen Antikörper gegen das Rattenendothel. Lassen Sie die Probe an der Luft trocknen, montieren Sie sie nicht mit einem Deckglas. Die Quantifizierung der Blutgefäße in einzelnen mesenterischen Fenstern erfolgt mittels computerunterstützter morphometrischer Mikroskopie unter Verwendung eines Zeichenmikroskops mit einer gesamten optischen Vergrößerung zwischen 14 und 34. Das gesamte mesenterische Fenster wird dabei sichtbar gemacht.Die Vergrößerung wird in festen Schritten gewählt, sodass möglichst großer Teil des Sichtfeldes vom Präparat abgedeckt wird. Der gesamte Bereich des Fensters lässt sich leicht darstellen, da die Grenze zwischen dem Fenster und dem umgebenden Fettgewebe deutlich ist. Alle vascularisierten Anteile werden anschließend gemäß sorgfältig definierter Kriterien eingezeichnet.Selbst die kleinsten neu gebildeten Blutgefäße, deren Durchmesser bei höherer Vergrößerung auf etwa 2,5 bis 3,0 Mikrometer bestimmt wurde, sind deutlich erkennbar. Die Tatsache, dass der mittlere Durchmesser der roten Blutkörperchen der Ratte gleich oder größer als 6,3 Mikrometer ist, verdeutlicht, wie klein diese Gefäße sind. Der Bereich aller durchbluteten Partien in einem Fenster, angegeben als Prozentsatz der Fläche des gesamten Fensters, wird als relativer durchbluteter Bereich va bezeichnet.Es handelt sich im Wesentlichen um eine Messung der räumlichen Ausdehnung der Gefäße, da diese im Grunde eine zweidimensionale Ausdehnung aufweisen, und die VA beispielsweise mithilfe einer computergestützten Telemetrie leicht gemessen werden kann. Der nächste Schritt beinhaltet die Erfassung der Dichte der Mikrogefäße sowie der Musterbildung in drei zentralen Bereichen der vascularisierten Zonen jedes Fensters. Diese Bereiche werden systematisch zufällig bei einer optischen Vergrößerung von 80 ausgewählt.Jedes Gefäß wird mithilfe eines Zeichenmikroskops als einzelne Linie dargestellt. Das Bild jedes Sichtfelds wird in ein digitalisiertes Bild übertragen und an einen Bildanalysator weitergeleitet, wobei jedes Gefäß im digitalisierten Bild anschließend auf eine Dicke von einem Pixel reduziert wird. Die Maschine misst dann die Anzahl der Pixel, die die Gefäße repräsentieren, und gibt diese als Bruchteil aller Pixel im Sichtfeld an.Diese prozentuale Zahl, die mikrovaskuläre Länge oder MVL, stellt die Länge der Mikrogefäße pro Einheit des vascularisierten Bereichs dar und ist eine zusammengesetzte Messgröße für die Dichte der Mikrogefäße. Durch Multiplikation des mittleren Gefäßareals (VA) aus vier Fenstern pro Tier mit der mittleren MVL der entsprechenden Behandlungsgruppe wird die gesamte mikrovaskuläre Länge pro Tier, die TMVL, berechnet. Darüber hinaus haben wir Techniken zur detaillierten quantitativen Analyse der Dichte und Zusammensetzung von Mikrogefäßen mittels Bildanalyse entwickelt.Dazu gehören die Messung des tatsächlichen Abstands zwischen zwei aufeinanderfolgenden Mikrogefäßen, Verzweigungsstellen, IE, der Länge einzelner Mikrogefäße, Segmente LEMS, der Anzahl von Mikrogefäßen, Segmenten pro Einheit des Gewebevolumens, NOMS, sowie der Anzahl von Mikrogefäße-Verzweigungsstellen pro Einheit des Gewebevolumens. NOBP. Der Grad der Tortuosität in den Mikrogefäßen MVT ergibt sich aus der Differenz zwischen der kürzesten Distanz und der tatsächlichen Distanz zwischen zwei aufeinanderfolgenden Verzweigungsstellen, dem Auftreten von Mikrogefäßen, die sich kreuzen, gemessen am Index der Überschneidung INIS, sowie der Bildung von miteinander verbundenen Schleifen. Der Index der Schleifenbildung INLF kann ebenfalls präzise gemessen werden, unter Verwendung ähnlicher Techniken am Rand des Mikrogefäße-Netzwerks.Wir sind außerdem in der Lage, entsprechende Variablen für Sprossen zu quantifizieren, einschließlich der Sprosslänge, LESP, und der Anzahl der Sprossen pro Einheit Gewebelumen, NOSP, wobei Versuche so angelegt werden, da erhebliche Unterschiede zwischen Tieren derselben Behandlungsgruppe sowie sogar zwischen mesenterischen Fenstern desselben Tieres auftreten können. Wir haben festgestellt, dass das folgende Design praktikabel sein kann: die Anzahl der Tiere pro Behandlungsgruppe während der Beobachtungszeit, acht bis zwölf; die Anzahl der Fenster pro Tier, die hinsichtlich VA analysiert werden; die Anzahl der Beobachtungsfelder pro Fenster, die hinsichtlich der mikrovaskulären Länge, MVL, analysiert werden; Länge der Mikrogefäße, Segmente, LEMS; Anzahl der Mikrogefäße, Segmente, NOMS; Anzahl der Mikrogefäße, Verzweigungsstellen, NOBP; Mikrogefäße-Tortuosität, MVT; Schnittstellenindex, I; Bildungsindex von Schleifen, INF. Drei mit einem Fahrzeug behandelte Tiere dienen als Kontrollen. Der Mesenterikus-Fenster-Angiogenese-Assay eignet sich gut für Dosis-Wirkungs-Studien und für kinetische Analysen der Angiogenese.Dies kann erreicht werden, indem Gruppen von Tieren mit unterschiedlichen Dosen eines pro-angiogenen Faktors behandelt und die Tiere zu verschiedenen Zeitpunkten während der angiogenen Reaktion getötet werden. So lassen sich die expansive Phase, der Höhepunkt und die anschließende angioregressive Phase quantitativ unterscheiden. Studien dieser Art haben gezeigt, dass die de-novo-angiogene Reaktion auf jeden getesteten Wachstumsfaktor-Zytokin in Bezug auf Geschwindigkeit, Potenz und Dauer spezifisch dosisabhängig ist.Außerdem ist das Muster der neuen Gefäße hinsichtlich räumlicher Ausdehnung und Veränderungen in den Mikrogefäßen und der Dichte oft deutlich dosis- und zeitabhängig, verglichen mit der Angiogenese, die durch VEGF oder basisches FGF bei annähernd physiologischen Dosen vermittelt wird. Die von Mastzellen vermittelte Angiogenese, MCMA, die durch selektive Aktivierung von Mastzellen in situ induziert wird, zeichnet sich durch eine erheblich höhere Wirksamkeit und bemerkenswert längere Dauer aus. Tatsächlich wurde die von Mastzellen vermittelte Angiogenese erstmals mithilfe dieses Assays beschrieben, aufgrund der Möglichkeit, objektive Angiogenese-Variablen zu quantifizieren, des hohen Grades an biologischer Relevanz des Systems und der Möglichkeit, toxische Wirkungen der Behandlung zu überprüfen.Die Methodik eignet sich einzigartig für Struktur-Wirkungs- und Dosis-Wirkungs-Analysen. Das Ratten-MWAA bietet ein Modell zur Untersuchung der Angiogenese in einem erwachsenen, ursprünglich vaskularisierten viszeralen Gewebe, das über keine physiologische Angiogenese verfügt und nicht durch chirurgische Eingriffe beeinflusst wird, wodurch jeglicher Einfluss einer wundheilungsbedingten Angiogenese ausgeschlossen ist. Der Test ist tatsächlich quantitativ und erfasst präzise eine Reihe biologisch relevanter objektiver Variablen, die die räumliche Ausdehnung, Dichte und Musterbildung von Mikrogefäßen beschreiben.Der Test eignet sich gut für die Untersuchung der systemischen Wirkungen von Angiogenese, modulierenden Faktoren sowie für Struktur-Wirkungs- und Dosis-Wirkungs-Studien. Die hier beschriebene Methodik wurde im Dr.Kloss Carl Norby Labor am Institut für Pathologie des Reka University Hospital, jute Borg University Gothenburg in Schweden entwickelt. Alle Studien in diesem Projekt wurden vom Schwedischen Medizinischen Forschungsrat, Projektnummer 5 9 4 2, unterstützt.Wir danken Frau Gun Effer, die seit Beginn des Projekts beteiligt ist, Frau Monica Anderson, die nicht anwesend ist, und Frau Ann Nemar Lindgren für die geschickte technische Unterstützung.Ich hoffe, dass diese kurze Darstellung Ihnen einen Eindruck vom Potenzial des Assays vermittelt hat. Wenn Sie diesen Assay in Ihrem Labor verwenden, stehe ich Ihnen gerne zur Verfügung, falls technische Probleme auftreten sollten. Außerdem würde ich mich sehr über jegliche Anregungen freuen, die Sie haben könnten.Vielen Dank.

Research

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JoVE Journal

Biology

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