Rat Mesenterium Angiogenese Assay

Willkommen an der Abteilung für Pathologie am GaN-Universitätsklinikum in Guttenburg, Schweden. Ich bin Dr. Klaus Norby, und die Methode, die Sie gleich sehen werden, wurde in meinem Labor entwickelt. Klinisch relevante Angiogenese, die im Zusammenhang mit Hypoxie, soliden Tumoren oder jeder anderen angiogenetischen Erkrankung auftritt, findet nahezu ausschließlich in nativ vaskularisiertem Gewebe statt. Bei erwachsenen kleinen Nagetieren enthält das Mesenterium, das den Dünndarm mit der Hinterwand des Körpers verbindet, eine Reihe dünner membranöser Abschnitte. Bei Ratten gibt es etwa 40 bis 50 dieser mesenterischen Fenster. Sie sind praktisch durchsichtig und daher mit bloßem Auge fensterartig, wobei jedes Fenster von Fettgewebe umgeben ist, und zwar bei erwachsenen männlichen Ratten.

Die mesenterialen Fenster sind von Natur aus vaskularisiert und weisen keine messbare physiologische Angiogenese auf. Sie bieten daher die Möglichkeit, die de-novo-Angiogenese in erwachsenem, von Natur aus vaskularisiertem Säugetiergewebe zu untersuchen. Das heißt, die Initiierung einer vollständigen angiogenen Reaktion von Grund auf, wobei die endogen im Testgewebe wirkenden Angiogenesehemmer überwunden werden müssen, wie sie in allen normalen Geweben von Mäusen vorkommen. Native Mikrogefäße, die als Ausgangsgefäße fungieren könnten, fehlen in vielen Fenstern, was den Assay in Mäusen in seiner nativen Form leider unvorhersehbar macht.

Die mesenterialen Fenster bei Ratten enthalten normalerweise eine relativ geringe Anzahl kleiner Blutgefäße, die bei erwachsenen Ratten peripher gelegen sind. Diese mesenterialen Fenster sind von Natur aus nur fünf bis zehn Mikrometer dick. Dadurch kann intaktes Gewebe auf Objektträgern ausgebreitet und mikroskopisch untersucht werden, wodurch alle Gefäße in jedem Fenster sichtbar werden und den Gefäßen im Wesentlichen eine zweidimensionale Ausdehnung verliehen wird.

Die Methode bietet eine beispiellose Gelegenheit, quantitative Messungen der räumlichen Ausdehnung, Dichte, Musterbildung und Größe der Blutmikrogefäße durchzuführen. Der subkutane Ort ist für Angiogenesestudien beliebt; aufgrund der Heterogenität endothelialer Zellen und gewebespezifischer Eigenschaften kann die Kontrolle der Angiogenese in subkutanen Geweben und subkutan wachsenden Tumoren jedoch nicht notwendigerweise die Kontrolle der Angiogenese in metastatischen viszeralen Organen wie Lunge, Leber, Knochen und Gehirn vorhersagen. Dies ist bemerkenswert, da viszerale Metastasen gewöhnlich letztendlich für die Letalität von Krebserkrankungen verantwortlich sind.

Die Tatsache, dass das mesenteriale Fenster viszeral ist, sollte diesbezüglich vorteilhaft sein. Das Ziel unseres Projekts besteht darin, Aspekte der de-novo-Angiogenese quantitativ zu untersuchen. Daher injizieren wir einen etablierten pro-angiogenen Faktor oder eine Testsubstanz intraperitoneal.

Normalerweise injizieren wir fünf Milliliter auf einmal in erwachsene, nicht anästhetisierte Ratten. Ein solches Volumen führt dazu, dass die gesamte Mesenterie rasch mit der injizierten Flüssigkeit in Kontakt kommt. Jede Lösung, die intraperitoneal verabreicht wird, solange ihr Volumen nicht minimal ist, sollte alle Zellen im Testgewebe beeinflussen, insbesondere da die Mesothelschicht, die das äußerst dünne mesenteriale Fenster bedeckt, für gelöste Stoffe hochgradig permeabel ist. Da kein chirurgischer Eingriff erforderlich ist, wird die im mesenterialen Fenster zu untersuchende Angiogenese nicht durch wundheilungsbedingte Angiogenese beeinträchtigt. Daher erfolgt die angiogenetische Behandlung in Form von intraperitonealen Injektionen.

Aus praktischen Gründen verwenden wir einen Behandlungsprotokoll, der zwei tägliche Injektionen über einen Zeitraum von fünf Tagen, von Montagmorgen bis Freitagmorgen, umfasst, wie es üblich ist, wenn die angiogenen Wirkungen definierter Proteine wie VEGF 1 65, 1 64 und basisches FGF untersucht werden. Üblicherweise wird Pharmacia-Infusionslösung als Träger verwendet. Die Anzahl der Behandlungen mag hoch erscheinen, doch es hat sich gezeigt, dass es nicht immer möglich ist, eine statistisch signifikante Angiogenese hervorzurufen, selbst wenn so starke pro-angiogene Faktoren wie VEGF und basisches FGF in etwa physiologischen Konzentrationen in einer Einzeldosis oder wenigen zeitlich getrennten Dosen verabreicht werden; es sollte berücksichtigt werden, dass starke endogene Angiogenesehemmer im Gewebe wirken.

Die Verabreichung angiogenese-modulierender therapeutischer Modalitäten ahmt eine klinische therapeutische Situation nach. Ein oder mehrere angiogenese-modulierende Faktoren können systemisch, subkutan, intravenös oder oral verabreicht werden. Zum Beispiel.

Dies simuliert eine klinische Behandlungssituation, da nicht nur die Wirkung des Ausgangsmoleküls, sondern auch der Metabolite untersucht werden kann. Das System ermöglicht ein gewisses Maß an Kontrolle über die toxischen Wirkungen systemisch verabreichter angiogenese-modulierender Wirkstoffe. Da erwachsene Ratten physiologisch wachsen und während eines zwei- bis dreiwöchigen Experiments um etwa 40 % an Gewicht zunehmen können, ist es durch Wägung der Tiere möglich, zu ermitteln, inwieweit die Behandlung den Gewichtszuwachs verlangsamt hat, was als Ausdruck toxischer Effekte angesehen werden kann.

Dadurch können toxische Dosen bei angiogenese-modulierenden Tests vermieden werden, wodurch Substanzen, die toxisch wirken, ausgeschlossen werden können. Ein wesentlicher Vorteil, da es andernfalls unmöglich sein könnte, die Ergebnisse im Hinblick auf spezifische antiangiogene Effekte zu interpretieren. Da erwachsene Ratten deutlich schneller wachsen als erwachsene Mäuse, sollte die Wirkung toxischer Substanzen auf die Körpergewichtszunahme bei Ratten ein empfindlicherer Indikator für allgemeine toxische Effekte sein als bei Mäusen.

Wir möchten Ihnen nun zeigen, wie Mesenteriumfenster-Präparate hergestellt werden. Diese Tiere wurden mittels CO2 getötet. Die Mesenteriumfenster werden beginnend distal im Mesenterium auf gewöhnlichen Plus-Objektträgern mit den Maßen drei mal ein Zoll verteilt.

Die Angiogenese kann im Mesenteriumsfenster mit bloßem Auge nicht beobachtet werden, ausgehend vom Ileozökalklappen und in retrograder Richtung fortgesetzt. Die vier Fenster, die vom am weitesten distal gelegenen Teil des Mesenteriums entnommen werden, werden verwendet. Die Probe auf dem Objektträger wird 20 Minuten lang bei Raumtemperatur getrocknet.

Der Darmstumpf wird abgeschnitten. Die Proben werden anschließend bei minus 20 Grad Celsius eingefroren. Auf diese Weise können die Proben mehrere Monate, vielleicht sogar Jahre lang aufbewahrt werden, ohne dass eine deutliche Qualitätsminderung eintritt.

Die Färbung erfolgt mit einem monoklonalen Antikörper gegen das Rattenendothel. Lassen Sie die Probe an der Luft trocknen, montieren Sie sie nicht mit einem Deckglas. Die Quantifizierung der Blutgefäße in einzelnen mesenterischen Fenstern erfolgt mittels computerunterstützter morphometrischer Mikroskopie unter Verwendung eines Zeichenmikroskops mit einer gesamten optischen Vergrößerung zwischen 14 und 34. Das gesamte mesenterische Fenster wird dabei sichtbar gemacht.

Die Vergrößerung wird in festen Schritten gewählt, sodass möglichst großer Teil des Sichtfeldes vom Präparat abgedeckt wird. Der gesamte Bereich des Fensters lässt sich leicht darstellen, da die Grenze zwischen dem Fenster und dem umgebenden Fettgewebe deutlich ist. Alle vascularisierten Anteile werden anschließend gemäß sorgfältig definierter Kriterien eingezeichnet.

Selbst die kleinsten neu gebildeten Blutgefäße, deren Durchmesser bei höherer Vergrößerung auf etwa 2,5 bis 3,0 Mikrometer bestimmt wurde, sind deutlich erkennbar. Die Tatsache, dass der mittlere Durchmesser der roten Blutkörperchen der Ratte gleich oder größer als 6,3 Mikrometer ist, verdeutlicht, wie klein diese Gefäße sind. Der Bereich aller durchbluteten Partien in einem Fenster, angegeben als Prozentsatz der Fläche des gesamten Fensters, wird als relativer durchbluteter Bereich va bezeichnet.

Es handelt sich im Wesentlichen um eine Messung der räumlichen Ausdehnung der Gefäße, da diese im Grunde eine zweidimensionale Ausdehnung aufweisen, und die VA beispielsweise mithilfe einer computergestützten Telemetrie leicht gemessen werden kann. Der nächste Schritt beinhaltet die Erfassung der Dichte der Mikrogefäße sowie der Musterbildung in drei zentralen Bereichen der vascularisierten Zonen jedes Fensters. Diese Bereiche werden systematisch zufällig bei einer optischen Vergrößerung von 80 ausgewählt.

Jedes Gefäß wird mithilfe eines Zeichenmikroskops als einzelne Linie dargestellt. Das Bild jedes Sichtfelds wird in ein digitalisiertes Bild übertragen und an einen Bildanalysator weitergeleitet, wobei jedes Gefäß im digitalisierten Bild anschließend auf eine Dicke von einem Pixel reduziert wird. Die Maschine misst dann die Anzahl der Pixel, die die Gefäße repräsentieren, und gibt diese als Bruchteil aller Pixel im Sichtfeld an.

Diese prozentuale Zahl, die mikrovaskuläre Länge oder MVL, stellt die Länge der Mikrogefäße pro Einheit des vascularisierten Bereichs dar und ist eine zusammengesetzte Messgröße für die Dichte der Mikrogefäße. Durch Multiplikation des mittleren Gefäßareals (VA) aus vier Fenstern pro Tier mit der mittleren MVL der entsprechenden Behandlungsgruppe wird die gesamte mikrovaskuläre Länge pro Tier, die TMVL, berechnet. Darüber hinaus haben wir Techniken zur detaillierten quantitativen Analyse der Dichte und Zusammensetzung von Mikrogefäßen mittels Bildanalyse entwickelt.

Dazu gehören die Messung des tatsächlichen Abstands zwischen zwei aufeinanderfolgenden Mikrogefäßen, Verzweigungsstellen, IE, der Länge einzelner Mikrogefäße, Segmente LEMS, der Anzahl von Mikrogefäßen, Segmenten pro Einheit des Gewebevolumens, NOMS, sowie der Anzahl von Mikrogefäße-Verzweigungsstellen pro Einheit des Gewebevolumens. NOBP. Der Grad der Tortuosität in den Mikrogefäßen MVT ergibt sich aus der Differenz zwischen der kürzesten Distanz und der tatsächlichen Distanz zwischen zwei aufeinanderfolgenden Verzweigungsstellen, dem Auftreten von Mikrogefäßen, die sich kreuzen, gemessen am Index der Überschneidung INIS, sowie der Bildung von miteinander verbundenen Schleifen. Der Index der Schleifenbildung INLF kann ebenfalls präzise gemessen werden, unter Verwendung ähnlicher Techniken am Rand des Mikrogefäße-Netzwerks.

Wir sind außerdem in der Lage, entsprechende Variablen für Sprossen zu quantifizieren, einschließlich der Sprosslänge, LESP, und der Anzahl der Sprossen pro Einheit Gewebelumen, NOSP, wobei Versuche so angelegt werden, da erhebliche Unterschiede zwischen Tieren derselben Behandlungsgruppe sowie sogar zwischen mesenterischen Fenstern desselben Tieres auftreten können. Wir haben festgestellt, dass das folgende Design praktikabel sein kann: die Anzahl der Tiere pro Behandlungsgruppe während der Beobachtungszeit, acht bis zwölf; die Anzahl der Fenster pro Tier, die hinsichtlich VA analysiert werden; die Anzahl der Beobachtungsfelder pro Fenster, die hinsichtlich der mikrovaskulären Länge, MVL, analysiert werden; Länge der Mikrogefäße, Segmente, LEMS; Anzahl der Mikrogefäße, Segmente, NOMS; Anzahl der Mikrogefäße, Verzweigungsstellen, NOBP; Mikrogefäße-Tortuosität, MVT; Schnittstellenindex, I; Bildungsindex von Schleifen, INF. Drei mit einem Fahrzeug behandelte Tiere dienen als Kontrollen. Der Mesenterikus-Fenster-Angiogenese-Assay eignet sich gut für Dosis-Wirkungs-Studien und für kinetische Analysen der Angiogenese.

Dies kann erreicht werden, indem Gruppen von Tieren mit unterschiedlichen Dosen eines pro-angiogenen Faktors behandelt und die Tiere zu verschiedenen Zeitpunkten während der angiogenen Reaktion getötet werden. So lassen sich die expansive Phase, der Höhepunkt und die anschließende angioregressive Phase quantitativ unterscheiden. Studien dieser Art haben gezeigt, dass die de-novo-angiogene Reaktion auf jeden getesteten Wachstumsfaktor-Zytokin in Bezug auf Geschwindigkeit, Potenz und Dauer spezifisch dosisabhängig ist.

Außerdem ist das Muster der neuen Gefäße hinsichtlich räumlicher Ausdehnung und Veränderungen in den Mikrogefäßen und der Dichte oft deutlich dosis- und zeitabhängig, verglichen mit der Angiogenese, die durch VEGF oder basisches FGF bei annähernd physiologischen Dosen vermittelt wird. Die von Mastzellen vermittelte Angiogenese, MCMA, die durch selektive Aktivierung von Mastzellen in situ induziert wird, zeichnet sich durch eine erheblich höhere Wirksamkeit und bemerkenswert längere Dauer aus. Tatsächlich wurde die von Mastzellen vermittelte Angiogenese erstmals mithilfe dieses Assays beschrieben, aufgrund der Möglichkeit, objektive Angiogenese-Variablen zu quantifizieren, des hohen Grades an biologischer Relevanz des Systems und der Möglichkeit, toxische Wirkungen der Behandlung zu überprüfen.

Die Methodik eignet sich einzigartig für Struktur-Wirkungs- und Dosis-Wirkungs-Analysen. Das Ratten-MWAA bietet ein Modell zur Untersuchung der Angiogenese in einem erwachsenen, ursprünglich vaskularisierten viszeralen Gewebe, das über keine physiologische Angiogenese verfügt und nicht durch chirurgische Eingriffe beeinflusst wird, wodurch jeglicher Einfluss einer wundheilungsbedingten Angiogenese ausgeschlossen ist. Der Test ist tatsächlich quantitativ und erfasst präzise eine Reihe biologisch relevanter objektiver Variablen, die die räumliche Ausdehnung, Dichte und Musterbildung von Mikrogefäßen beschreiben.

Der Test eignet sich gut für die Untersuchung der systemischen Wirkungen von Angiogenese, modulierenden Faktoren sowie für Struktur-Wirkungs- und Dosis-Wirkungs-Studien. Die hier beschriebene Methodik wurde im Dr.Kloss Carl Norby Labor am Institut für Pathologie des Reka University Hospital, jute Borg University Gothenburg in Schweden entwickelt. Alle Studien in diesem Projekt wurden vom Schwedischen Medizinischen Forschungsrat, Projektnummer 5 9 4 2, unterstützt.

Wir danken Frau Gun Effer, die seit Beginn des Projekts beteiligt ist, Frau Monica Anderson, die nicht anwesend ist, und Frau Ann Nemar Lindgren für die geschickte technische Unterstützung.

Ich hoffe, dass diese kurze Darstellung Ihnen einen Eindruck vom Potenzial des Assays vermittelt hat. Wenn Sie diesen Assay in Ihrem Labor verwenden, stehe ich Ihnen gerne zur Verfügung, falls technische Probleme auftreten sollten. Außerdem würde ich mich sehr über jegliche Anregungen freuen, die Sie haben könnten.

Vielen Dank.