Immunhistochemie: Paraffin Schnitte mit der Vectastain ABC Kit von Vector Labs

Hallo, ich bin Victor Chi und ich bin Doktorand im Chandy Lab in der Abteilung für Physiologie und Biophysik an der University of California Irvine. Heute zeige ich, wie man in Paraffin eingebettete Abschnitte mit dem A, B, C-Kit von Vector Laboratories färbt. Dieses Verfahren umfasst das Entwachen und Hydratisieren von in Paraffin eingebetteten Abschnitten, die Durchführung einer hitzeinduzierten Antigen-Extraktion zur Demaskierung von Antigenen, die Blockperoxidase und die unspezifische Proteinbindung, die Inkubation mit CD 4 und Tyrosinhydroxylase und Sekundärantikörpern sowie die Entwicklung und Montage des Objektträgers.

Also lasst uns loslegen. Da die Objektträger in Paraffin codiert sind, besteht der erste Schritt darin, die Objektträger zu entwachsen. Dies geschieht in der Regel in einem Abzug mit drei Gläsern Xylol nach drei Wäschen, die jeweils fünf Minuten dauern.

Anschließend werden die Objektträger in hundertprozentiges Ethanol eingelegt. Sie werden feststellen, dass das Wachs auf den Objektträgern verschwunden ist, aber achten Sie darauf, die Objektträger nicht mit Handschuhen zu berühren, da das Xylol das Gummi der Handschuhe auflöst. Von dort tragen Sie die Objektträger in dem hundertprozentigen Ethanol zurück ins Labor, wo sie einen Hydratationsgradienten durchlaufen.

Hier werde ich mit Ihnen über den Flüssigkeitsgradienten sprechen, den unsere Slides durchlaufen werden. Es beginnt zunächst mit zwei Bädern mit hundertprozentigem Ethanol. Von dort aus überführen wir unsere Rutschen in zwei Bäder, die zu 95 % aus Ethanol bestehen.

Dann überführen wir unsere Objektträger in ein Bad mit 70 % Ethanol, und von dort aus übertragen wir unsere Objektträger in ein Bad mit 50 % Ethanol. Danach überführen wir unsere Objektträger auf 30%iges Ethanol und zwei Minuten später auf doppelt destilliertes Wasser. Und nach der Behandlung mit doppelt destilliertem Wasser lassen wir unsere Folie in PBS sitzen.

Jetzt zeige ich Ihnen, wie Sie die Dias in den Waggons von einem Bad zum nächsten transportieren können. Der erste Schritt besteht also darin, Ihren Schlittenhalter zu verwenden, die Schieber zu entfernen und vorsichtig zu kratzen, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, damit Sie nicht zu viel Flüssigkeit zu Ihrem nächsten Bad mitnehmen. Tauchen Sie es von dort aus ein und warten Sie zwei Minuten, bis sich die nächste Steigungsänderung ändert.

Wenn sich das Gewebe fixiert, wird das Antigen so oft maskiert, dass der Antikörper nicht daran binden kann. Was ich jetzt tun werde, ist, Ihnen eine Methode zur hitzeinduzierten Antigengewinnung mit Natriumcitrat zu zeigen. Jetzt sind wir also hier in der Mikrowelle, wo ich mein Zöliakie-Acht-Antigen demaskieren werde, das ich mit Hilfe der Immunhistochemie nachweisen werde.

Und hier gebe ich meine Lösung hinein und erhitze sie 15 Minuten lang in der Mikrowelle. Also kochen wir unser Natriumcitrat mit unseren Objektträgern 15 Minuten lang, um sicherzustellen, dass unsere Objektträger nicht austrocknen. Wir werden unsere Objektträger beobachten, damit wir sie nach dem Überkochen mit Natriumcitrat auffüllen, um sicherzustellen, dass die Objektträger hydratisiert bleiben.

Bevor ich also meine Objektträger in das Natriumcitrat lege, habe ich meine Lösung bereits 45 Sekunden lang vorgewärmt. Dann habe ich meine Objektträger in das Natriumcitrat gegeben, und jetzt erhitze ich mein Natriumcitrat für 15 Minuten. Wenn sich die Objektträger darin befinden, beginnt die Lösung normalerweise nach etwa zwei bis zweieinhalb Minuten des Siedevorgangs zu kochen.

An diesem Punkt werde ich aufhören und das verlorene Natriumcitrat durch frisches Natriumcitrat ersetzen. Nachdem wir das Natriumcitrat 15 Minuten lang gekocht haben, wollen wir unsere Objektträger und die Lösung entfernen und abkühlen. Der beste Weg, dies zu tun, besteht darin, Ihren Objektträgerhalter zu verschließen, die überschüssige Flüssigkeit abzugießen und ihn einfach über einen Strahl kalten Wassers laufen zu lassen, bis die Lösung im Inneren des Glases auf Raumtemperatur abgekühlt ist.

Und das dauert in der Regel etwa 10 bis 15 Minuten. Nachdem wir also unsere Objektträger aus dem Waschbecken genommen haben, müssen wir die endogene Peroxidase-Aktivität im Gewebe blockieren. Was wir also tun werden, ist, eine Lösung aus Wasserstoffperoxid unter Verwendung von 30 % Wasserstoffperoxid herzustellen und eine 1 %ige Wasserstoffperoxidlösung herzustellen.

Und von hier aus übertrage ich die Objektträger einfach direkt in die Wasserstoffperoxidlösung. Und jetzt inkubieren wir unsere Objektträger 20 Minuten lang in Wasserstoffperoxid. Jetzt, nach 20 Minuten, nachdem ich die endogene Peroxidase blockiert habe, werde ich das Wasserstoffperoxid mit PBS-Waschungen von den Objektträgern waschen.

Also werde ich meine Dias auf den Schlitten übertragen und ihn mit drei Waschgängen von jeweils fünf Minuten waschen. Daher wurden diese Objektträger Rücken an Rücken platziert, um einen Kontakt mit den anderen Objektträgern zu vermeiden, der das Gewebe beschädigen könnte. Ich schiebe also einfach die Objektträger ab und ordne die Objektträger so an, dass das Gewebe keine Möglichkeit hat, mit dem Glas in Berührung zu kommen.

Dort übertragen wir unsere Folien an PBS. Nachdem ich unsere Objektträger mit PBS gewaschen habe, werde ich nun die Objektträger für unspezifische Bindung von Proteinen mit einer Lösung aus 5 % BSA, 5 % Ziegenserum und 0,1 % Natriumazid blockieren. Sie möchten also das Ziegenserum gegen eine andere Spezies austauschen, wenn Sie mit Ziegenantikörpern arbeiten.

Im Moment lege ich die Folien in unseren Folienhalter und fülle ihn mit unserer Lösung. Normalerweise fülle ich es also nur zur Hälfte, so dass das Volumen der Objektträger gerade sicherstellt, dass das Gewebe untergetaucht ist. Wenn Sie also die Objektträger in den Behälter legen, sollten Sie vermeiden, dass dieses Gewebe die Seiten des Behälters berührt.

Drehen Sie es also für den letzten Objektträger nach innen, damit das Taschentuch den Behälter nicht berührt. Jetzt, da ich meine Objektträger über Nacht blockiert habe, wasche ich die überschüssige Blockierungslösung mit drei Wäschen zu je fünf Mal ab, bestehend aus fünf Minuten PBS. An dieser Stelle wollen wir also mit einem Flüssigblocker einen Kreis um unser Gewebe ziehen, um die Menge an verwendeten Antikörpern zu minimieren.

Wenn Sie sich keine Sorgen um die Konservierung von Antikörpern machen, können Sie die Objektträger immer in denselben Hüllen inkubieren, in denen wir den Blockierungsschritt durchgeführt haben. Ab diesem Punkt zeige ich dir, wie wir mit Flüssigblockern um unser Gewebe herum zeichnen. Zuerst entfernen wir also Blut von der überschüssigen Flüssigkeit und achten darauf, das Gewebe nicht zu berühren.

Wischen Sie also einfach an den Ecken herum, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Auch hier gilt: Seien Sie sehr, sehr vorsichtig, um das Gewebe nicht zu berühren. Nehmen Sie den Flüssigkeitsblockierstift, drücken Sie ihn sanft nach unten, um den Fluss in Gang zu bringen, und umschließen Sie von dort aus das Gewebe mit Ihrem Stift.

Lassen Sie den Flüssigblocker ca. 15 Sekunden trocknen. An dieser Stelle wollen wir den primären Antikörper hinzufügen. Stellen Sie daher sicher, dass Sie das Gewebe mit einer Pipette mit Ihrem primären Antikörper bedecken und in Ihre feuchtigkeitskontrollierte Box übertragen.

Also verwenden wir ein Kim-Tuch. Verheiratet mit etwas Wasser in dieser Box, um zu verhindern, dass der Objektträger austrocknet, während er mit dem primären Antikörper inkubiert wird. Jetzt, da unser primärer Antikörper eine Stunde lang inkubiert hat, werden wir unsere Objektträger entfernen und den überschüssigen Antikörper mit PBS abwaschen.

Lassen Sie also die Flüssigkeit einfach ablaufen und geben Sie sie in Ihre PBS-Wäsche. Und auch hier dreimal fünf Minuten lang waschen. Nach unseren drei fünfminütigen Wäschen werden wir also unseren Sekundärantikörper auf die gleiche Weise zu unserem Gewebe hinzufügen, wie wir unseren Primärantikörper hinzugefügt haben.

Verwenden Sie also nur genug Volumen, um Ihr Gewebe zu bedecken, fügen Sie Ihren sekundären Antikörper hinzu, den wir als Ziegen-Anti-Kaninchen verwenden, und bewegen Sie Ihren Objektträger zurück in die feuchtigkeitskontrollierte Kammer. Und so verwenden wir einen sekundären Antikörper, nämlich biotinyliertes Ziegen-Anti-Kaninchen, das bei der Anwendung der A-BC-Methode unerlässlich ist. Also überführen wir unseren Objektträger in die feuchtigkeitskontrollierte Kammer und lassen ihn für einen ausbrüten.

Während der Sekundärantikörper inkubiert wird, müssen wir also das A-BC-Reagenz vorbereiten. Wir verwenden also die Vektorlaboratorien, A, B, C Reagenz aus dem Vektorfärbekit. Entfernen Sie also das Reagenz, grundieren Sie es und lassen Sie es dreimal in 15 Milliliter PBS tropfen, wobei Sie darauf achten sollten, das Röhrchen nicht zusammenzudrücken, da die Tropfen spezifisch dosiert und von einer bestimmten Größe sein müssen.

Nachdem Ihr Sekundärantikörper etwa eine Stunde lang inkubiert wurde, nehmen Sie Ihre Objektträger und legen ihn erneut in PBS, genau wie Sie es mit Ihrem Primärantikörper getan haben. Nach drei Waschgängen à fünf Minuten überträgst du deine Objektträger in diesen Behälter, wo du dein A, B, C-Reagenz hinzufügst, das du 30 bis 45 Minuten im Voraus vorbereitet hast. Und so fügen Sie einfach Ihr A-, B-, C-Reagenz hier hinzu, füllen Ihre Objektträger ein und lassen sie weitere 30 bis 45 Minuten inkubieren.

Nachdem Ihre Objektträger also etwa 34 bis fünf Minuten in a, b, c gelegen haben, möchten wir die überschüssige A, B, C-Lösung abwaschen. Sie entfernen also einfach Ihre Folien und fügen sie in Ihre PBS-Lösung ein. Und so wollen wir den gleichen Waschvorgang in PBS dreimal für jeweils fünf Minuten wiederholen.

Während die Objektträger gewaschen werden, bereite ich das DAB-Peroxidase-Substrat von vector laboratories vor. Ich nehme den pH 7,5 Puffer und füge zwei Tropfen hinzu. Nach dem pH-Puffer von 7,5 nehme ich das DAB-Substratreaktionsreagenz und füge zwei Tropfen davon hinzu.

Auch hier ist die Tropfengröße entscheidend, also drücken Sie die Flasche nicht zusammen und lassen Sie die Tropfen einfach fallen. Zwei Tropfen für Puffer pH 7,5. Sie sollten also vier Tropfen des DAB-Substratreagenzes hinzufügen, damit es ebenfalls tropfen kann.

Sie möchten auch am Ende zwei Tropfen des Wasserstoffperoxid-Substratreagenzes hinzufügen. So sollte also die DAB-Substrat-Reagenzienmischung aussehen. Jetzt ist es bereit, die Folien zu ergänzen, Ihre Folien zu entfernen und dem PBS zu erlauben, Ihre Folien einfach abzulassen.

Mit der Zeit wird das DAB-Reagenz also brauner. Deshalb wollen wir es an dieser Stelle zu unseren Folien hinzufügen. Nehmen Sie also genug Volumen, um das Gewebe zu bedecken, und geben Sie es einfach direkt auf die Gewebeproben.

Nehmen Sie also einfach das entsprechende Volumen und geben Sie es direkt auf Ihre Gewebeproben und lassen Sie die Lösung entwickeln, da Ihre Gewebeproben mit der Zeit brauner werden sollten. Nachdem Sie Ihre DAB-Lösung hinzugefügt haben, können Sie in diesem Gehirnabschnitt sehen, wo das Gewebe hier und hier braun wird. Der braune DAB-Stand zeigt die Region, in der sich dopaminerge Neuronen des Mittelhirns befinden.

Nachdem Sie Ihre Folien zwischen zwei und 10 Minuten entwickelt haben, möchten Sie Ihre Folien in das eiskalte Wasser geben, um die Reaktion zu stoppen. Lassen Sie die Lösung also einfach abtropfen und geben Sie Ihre Objektträger direkt in das eiskalte Wasser. Nachdem Sie Ihre Objektträger in das eiskalte Wasser getaucht haben, bringen Sie Ihr Bad zum Waschbecken und lassen Sie etwa fünf Minuten lang kaltes Wasser hineinlaufen, um sicherzustellen, dass die gesamte DAB-Lösung aus diesem Bad abgelassen wird.

Wenn Sie also das Waschbecken hinzufügen, achten Sie darauf, dass der Strahl nicht auf das Gewebe trifft, sondern dass er auf eine der Ecken trifft und es einfach überlaufen lässt, damit Ihr Gewebe nicht durch den fließenden Wasserfluss gestört wird. Nachdem Sie also Ihre Objektträger aus der Wäsche genommen haben, möchten Sie einen Gegenfleck machen. Warum sollten Sie also eine Gegenbeize wollen?

Nun, ein Grund ist, dass Sie vielleicht die Struktur Ihres Gewebes sehen möchten. Eine andere besteht darin, alle Zellen zu visualisieren. Für unsere Zwecke werden wir also der Färbung mit Hämat-Toin entgegenwirken, was für Kerne steht.

Wir wollen also einfach unsere Objektträger nehmen, überschüssige Flüssigkeit entfernen und sie einfach einmal in die Hämatin-Lösung tauchen. Erstens, nehmen Sie es heraus und geben Sie es direkt ins Wasser. Nachdem Sie Ihre Objektträger in das Leitungswasser gegeben haben, möchten Sie Ihre Objektträger nehmen und unter Wasser laufen lassen, so wie Sie es zuvor mit dem eiskalten Wasserbad getan haben.

Lassen Sie die Hemat Toin Wäsche also einfach unter fließendem Wasser laufen, bis das Wasser im Glas klar wird. Nachdem wir also unsere gegengefärbten Dias aus dem Wasser genommen haben, wollen wir unsere Dias erneut dehydrieren. Und so wollen wir es wieder durch unseren Ethanol-Gradienten bringen, aber in umgekehrter Reihenfolge.

Das wäre also eine Wäsche mit deionisiertem Wasser, eine Wäsche mit 30 % Ethanol, eine Wäsche mit 50 % Ethanol, eine Wäsche mit 70 % Ethanol, zwei Wäschen und 95 % Ethanol und zwei Wäschen und 100 % Ethanol, die jeweils zwei Minuten dauern. Entfernen Sie also Ihre Objektträger, wischen Sie die überschüssige Flüssigkeit ab und fügen Sie sie direkt zu Ihrem 30%igen Ethanol hinzu und lassen Sie sie zwei Minuten lang einwirken. Nach der letzten hundertprozentigen Ethanolwäsche wollen wir die Dias also wieder in das Xylol legen.

Nehmen Sie also Ihre Objektträger erneut, kratzen Sie die überschüssige Flüssigkeit ab, nehmen Sie die Objektträger und geben Sie sie fünf Minuten lang in das erste Xylol. Das sind also drei aufeinanderfolgende Xylol-Waschungen für jeweils fünf Minuten. Und jetzt sind wir bereit, unsere Folien zu montieren.

Normalerweise mache ich also eine Minute, bevor die Objektträger fertig sind, nehme ich meine Weidepipette und ziehe die Dauerwellenhalterungslösung, und ich lasse sie etwa eine Minute gehen, bevor meine Objektträger bereit sind, herauszukommen. Nach dem letzten Waschen von Xylol, achten Sie darauf, Ihre Handschuhe nicht zu untertauchen oder Ihre Handschuhe mit Xylol nass zu machen. Entferne sie mit einer Pinzette und achte darauf, auf welcher Seite sich das Taschentuch befindet. Wischen Sie den Überschuss an XLE vorsichtig mit einem Kim-Tuch ab, achten Sie darauf, das Taschentuch nicht zu berühren, wischen Sie einfach vorsichtig an den Ecken und Rändern ab, damit der größte Teil des Xylols verdunsten kann. Sie können wahrscheinlich an zwei Folien arbeiten, bevor eine austrocknet.

Wenn Sie also mit dem Trocknen einer Folie fertig sind, sollte die andere Folie bereit sein, damit zu arbeiten. Jetzt musst du mit ihnen arbeiten, bevor sie komplett austrocknen. Sie sollten also Ihren Perimount nehmen und eine dünne Linie neben Ihrem Gewebe ziehen, wobei Sie darauf achten sollten, Ihr Gewebe nicht zu berühren.

Entfernen Sie das Perimount und nehmen Sie Ihren Abdeckschirm mit. Tragen Sie es in einem 45-Grad-Winkel auf und lassen Sie es nach unten biegen. Schieben Sie dann Ihren Deckschirm und stellen Sie sicher, dass der Perimount alle Taschentücher abdeckt.

Legen Sie dann auf, legen Sie es ab und drücken Sie vorsichtig in die Mitte, um alle überschüssigen Luftblasen zu entfernen. Lassen Sie es trocknen, während Sie an Ihrem zweiten Taschentuch arbeiten, ist der Zeitpunkt, um sich unsere Objektträger anzusehen, nicht wirklich. Wir müssen also die Perma-Halterung über Nacht trocknen lassen, bevor wir uns unsere Rutschen ansehen.

Andernfalls sprudelt die Perma-Montierung unter dem Licht des Mikroskops, und dann ruinieren Sie Ihre Probe. Hier ist ein Blick auf unsere Gehirnschnitte nach der Färbung mit Chemikalien, einem polyklonalen Kaninchen-Antikörper, der gegen Tyrosinhydroxylase gerichtet ist. Auch hier zeigt die braune DAB-Färbung die Lage der dopaminergen Neuronen im Mittelhirn.

Die Hämatin-Gegenfärbung färbt alle Zellkerne in diesem Gewebe blau. Deshalb habe ich Ihnen gerade gezeigt, wie Sie in Paraffin eingebettete Abschnitte mit dem A BC-Kit von Vector Laboratories färben können. Jetzt möchten Sie die Bedingungen entsprechend den Gewebetypen, die Sie färben, und den Antikörpern, die Sie verwenden werden, anpassen.

Also viel Glück bei Ihren Experimenten.