Laser Capture Mikrodissektion von Säugetiergewebe

Hallo, mein Name ist Rob Edwards. Ich bin der Leiter der Laser-Kapture-Mikroskopie-Einrichtung der University of California Irvine. Ich werde Ihnen die Verwendung des hier verfügbaren Laser-Kapture-Mikroskops erläutern.

Unser Instrument ist ein Leica A-S-L-M-D, den wir vor etwa drei Jahren erworben haben. Es gibt zwei verschiedene Arten von Lasermikrodissektions-Systemen. Eines kann mit einem Punktschweißgerät verglichen werden, bei dem ein Gewebestück auf einer Glasobjektträgerplatte auf einer Kunststoffmembran liegt, die über dem Gewebe angeordnet ist.

Als Nächstes wird eine Laserquelle verwendet, um die Membran zu schmelzen, wodurch das Gewebe praktisch punktgeschweißt auf der Membran befestigt wird. Anschließend wird die Membran entfernt, wobei das gewonnene Gewebe mitgenommen wird. Gut. Um das LCM-System zu starten, schalten wir nacheinander mehrere Geräte ein. Zuerst beginnen wir mit der A-S-L-M-D-Steuerbox, die hier eingeschaltet wird.

Dann schalten wir den Computer ein, was einfach genug ist. Wenn Sie eine Probe haben, die eine Fluoreszenzoptik zur Identifizierung der zu isolierenden Zellen erfordert, würden Sie die Quecksilberlampe für die Fluoreszenzbeleuchtung einschalten. Für diese Demonstration werden wir dies jedoch nicht verwenden.

Wenn Sie qualitativ hochwertige Bilder der Proben vor und nach dem Versuch aufnehmen möchten, kann man die Spot-Kamera separat hier einschalten, nachdem die Logikbox und der Computer eingeschaltet wurden. Danach schaltet man hier die Laserleistungsregelung ein, die eigentlich durch einen Schlüssel hier unten am Gerät eingeschaltet wird. Schließlich schaltet man den Computermonitor ein. Auf dem Bildschirm befinden sich eine Reihe von Bedienelementen, mit denen Sie vertraut sein müssen.

Sie werden sie recht regelmäßig verwenden. Dies ist ein klassisches auf Microsoft Windows basierendes Programm, daher gibt es eine Reihe von Menüs, über die wir sprechen werden. Doch zuerst lassen Sie mich über den Desktop hier sprechen.

Es gibt ein Live-Fenster, das Ihnen zeigt, was das Mikroskop tatsächlich sieht. Und oben in der Menüleiste sehen Sie eine Schaltfläche für Live-Bilder sowie eine Einfrieren-Schaltfläche, die Sie umschalten können, um dann über das Datei-Menü Standbilder eines Gewebeteils zu erfassen, beispielsweise vor und nach der Aufnahme, um das isolierte Gewebe zu dokumentieren. Das Mikroskop kann entweder im Hellfeld- oder im Fluoreszenzmodus betrieben werden, je nachdem, ob Sie Gewebe mit Hämatoxylin-Gegenfärbung oder fluoreszenzmarkiertes Gewebe aufnehmen.

Die nächsten beiden Schaltflächen beinhalten den Objekt-Modus, der auf die Ebene des Mikroskoptisches fokussiert, und anschließend den Sammler-Modus, der den Objektträger beiseite bewegt und es Ihnen ermöglicht, das gewonnene Gewebe an der Oberseite des Sammelgefäßes zu visualisieren. Dies ist eine Art Qualitätskontrolle. Als Nächstes folgen in der Menüleiste mehrere Zeichenwerkzeuge, mit denen Sie die Gewebe- oder Zellbereiche markieren, die Sie gewinnen möchten.

Rechts neben dem Bildschirm befinden sich dann weitere Zeichen- und Erfassungswerkzeuge, darunter Optionen für Zeichenformen, einige Schneidoptionen sowie die Schaltflächen zur Steuerung des Schneidens. Auf dem Bedienfeld am unteren Rand befindet sich außerdem das Sammelgerät, also der Teil des Mikroskops unterhalb der Objektbühne, in dem die Einor-Röhrchen aufbewahrt werden, in welche das Gewebe eingesammelt wird. Die vier mit A, B, C und D beschrifteten Tasten steuern, welches Röhrchen direkt unter die zu erfassende Probe geschoben wird.

Dies ist ein Beispiel für ein typisches gefrorenes Gewebeschnittpräparat, das für die Laser-Mikrodissektion aufbereitet wurde. Dabei handelt es sich um koronale Schnitte eines embryonalen Mausgehirns, die auf einer Pen-Folie aufgefangen wurden. Es wurden 8 µm dicke Gefrierschnitte angefertigt, die anschließend getrocknet und mit Hämatin kontrastgefärbt sowie bis zur Verwendung bei minus 80 °C gelagert wurden.

Um diese Objektträger am Mikroskop zu befestigen, wird ein spezieller Halter verwendet, der zum Mikroskop gehört. Beachten Sie, dass das Gewebe in einem Eppendorf-Röhrchen erfasst wird, das unterhalb der Ebene des Objekttisches liegt. Das Gewebe befindet sich also auf dieser Seite des Objektträgers. Tatsächlich wird der Objektträger mit der Gewebeseite nach unten im Objektträgerhalter befestigt, und zwar wie folgt.

Die Objektträger wird dort eingesetzt und durch Federdruck fixiert. Und dann dieses intakte, dieses Loch. Der Objektträgerhalter wird zwischen diesen beiden Führungen auf die Mikroskopbühne gestellt.

Sie werden feststellen, dass sich ein kleiner Rastpunkt befindet, der unter eine Halterung an der Rückseite des Objekttisches greift und die Probe fixiert. Beim Einfügen verspüren Sie ein deutliches Klicken. Als Nächstes müssen die Einor-Röhrchen eingerichtet werden, die das Gewebe tatsächlich aufnehmen.

Man kann entweder 0,2- oder 0,5-Milliliter-Einor-Röhrchen verwenden, die in diese kleinen Halter passen, die wiederum in dieses Tablett passen, das in einen speziellen Schlitz unter dem Objekttisch eingesetzt wird. Das Gewebe wird also tatsächlich innerhalb des Deckels des Einor-Röhrchens aufgefangen. Als Beispiel verwende ich hier ein 0,5-Milliliter-Röhrchen.

Die Kappe wird also so eingeschoben, dass sie darunter hindurchgleitet, und die Lippen der Kappe werden dann durch diese Zähne festgehalten, wodurch die Kappe darunter einrastet. Anschließend wird die gesamte Kappe in die Halterung eingesetzt. Wenn man Nukleinsäuren, insbesondere für die RNA-Isolierung, gewinnen möchte, kann man einen Tropfen Triol-Lösung im Bereich mehrerer hundert Mikroliter direkt in die Kappe geben. Es ist wichtig, darauf zu achten, dass dies natürlich nicht in das Gerät gelangt, aufgrund des Phenols und anderer ätzender Chemikalien im Triol-Reagenz.

Dies ist, wie bereits erwähnt, der Mikroskop-Controller; die Objektive sowie die Beleuchtung und der Fokus sind an diesem Gerät vollständig motorisiert. Der Fokusknopf befindet sich hier oben. Die Y-Verschiebungssteuerung für den Objekttisch ist dieser Knopf.

Die X-Translationskontrolle befindet sich hier. Unten links ist die Blendenregelung, mit der die Beleuchtungsstärke variiert wird. Das Mikroskop merkt sich, welche Beleuchtungsstärke bei jeder Vergrößerung eingestellt wurde. Wenn Sie also von einem Objektiv zum anderen wechseln, wird die Beleuchtung automatisch angepasst.

Rechts am Steuergerät befindet sich schließlich die Objektivrevolver-Steuerung, mit der zwischen den Objektiven gewechselt wird. Dieses Gerät verfügt über fünf Objektive: ein 4x-, ein 10x-, ein 20x-, ein 40x- und ein 63x-Objektiv. Der erste Schritt beim eigentlichen Erfassen von Gewebe besteht darin, das Mikroskop auszurichten, sodass das, was Sie auf dem Bildschirm sehen, genau dem entspricht, was Sie erfassen werden, um das Mikroskop zu justieren.

Wir wechseln zur Laser-Menüoption und wählen Kalibrieren aus, dann bestätigen wir mit Fortsetzen. Jetzt befinde ich mich in der 4×-Einstellung und Sie können sehen, dass hier ein relativ großer Bereich der Membran sichtbar ist. Beachten Sie, dass kein Gewebe vorhanden ist.

Wir führen die Ausrichtung an einer Ecke des Objektträgers durch. Der Laser hat im oberen rechten Bildschirmrand ein Kreuzmuster eingeschnitten, und ich werde mit der Maus das Bild zentrieren und dann in dieses Kreuzmuster klicken; der Computer schneidet daraufhin ein weiteres Kreuzmuster. Ich richte mich daran aus und klicke, woraufhin ein drittes Kreuzmuster geschnitten wird, an dem wir uns anschließend ausrichten.

Die Kalibrierung für das Vierfach-X-Objektiv ist nun abgeschlossen, das Mikroskop ist ausgerichtet und bereit, tatsächlich Gewebe aufzunehmen. Ihnen ist möglicherweise während des Ausrichtvorgangs aufgefallen, dass die angefertigten Kreuzschraffuren ziemlich dick waren. Das liegt tatsächlich daran, dass die Laserleistungssteuerung auf eine sehr hohe Stufe eingestellt war.

Wir benötigen wahrscheinlich nicht diesen Grad an Schneidkraft. Ich werde daher veranschaulichen, wie man die Laserleistung einstellt, indem man eine Linie schneidet. Wenn ich frei eine diagonale Linie auf dem Bildschirm zeichne, dann eine Abdeckung auswähle und anschließend auf „Schnitt starten“ klicke, wird der Computer entlang der von mir definierten Linie schneiden.

Und Sie können sehen, wie breit diese Linie ist. Ich muss die Laserleistung reduzieren. Tun Sie das daher.

Ich gehe zum Laser-Menü, wähle Steuerung aus und Sie werden bemerken, dass die Intensität bereits auf Maximum eingestellt war. Ich werde die Laserintensität auf etwa 30 oder so verringern und diese Einstellung bestätigen. Wenn ich nun eine neue Linie zeichne und schneide, werden Sie sehen, dass die Breite des verbrannten Gewebes oder der verbrannten Membran deutlich geringer ist.

Als allgemeines Prinzip sollte daher die Laserregelleistung so niedrig wie möglich eingestellt werden, um die Menge des verdampfenden Gewebes zu minimieren. Ich werde nun die eigentliche Gewebeentnahme mit diesem Spiegelauge demonstrieren. Ich befinde mich derzeit im Objektiv des Forex und werde versuchen, einen vergleichsweise großen Gewebeteil zu entnehmen.

Wir werden die gesamte Linse aus der Mitte dieses Auges isolieren. Dazu werde ich freihand schneiden. Unter Verwendung der Zeichensteuerung oben auf dem Bildschirm werde ich schneiden.

Ich zeichne eine Linie um das zu entnehmende Präparat herum. Ich arbeite dabei mit sehr geringer Vergrößerung. Wenn genauere Schnitte oder kleinere Gewebeareale gewünscht sind, kann man selbstverständlich mit höherer Vergrößerung arbeiten.

Ich habe also den Bereich ausgewählt, der geschnitten werden soll, und befinde mich nun im Zeichenformen-Menü. Normalerweise lasse ich die Option „Geschlossene Linien“ aktiviert. Die Funktion „Geschlossene Linien“ bewirkt, dass, wenn man eine unregelmäßige Form um ein Objekt zeichnet und dieses nicht vollständig umschließt, eine gerade Linie über die offenen Enden der Form gezogen wird. Sobald der zu schneidende Bereich festgelegt ist, beginnen wir den Schneidvorgang, und Sie werden sehen, dass die Steuerbox den Laser durch die entsprechenden Bereiche fokussiert und das Material nahezu vollständig durchtrennt.

Beim Erfassen großer Gewebestücke tritt häufig ein hängender Rand auf. Eine vollständige Trennung des Gewebes erfolgt nicht. Daher besteht der erste Schritt darin, erneut zu schneiden, wobei der Laser dem Gewebe folgt.

Manchmal können Sie alternativ einfach dort, wo es hängt, einen kleinen Zwischenraum einzeichnen und diesen durchtrennen, wodurch das Gewebe herunterfällt. Auf diese Weise haben wir nun diesen Gewebeteil erfasst. Wie bereits erwähnt, können wir in den Sammelmodus wechseln und überprüfen, ob sich dieses Gewebestück tatsächlich im Sampler oder in der Eppendorf-Röhrchenkappe befindet.

Ich gehe nun zu unserem Sammelsteuerknopf, drücke ihn, und Sie werden sehen, dass das Mikroskop die Ansicht wechselt. Wir betrachten jetzt die Innenfläche des Eileiters, und im unteren rechten Bildschirmbereich befindet sich das gewonnene Gewebestück. Durch Fokussieren können wir die einzelnen Zellen erkennen. Somit haben wir bestätigt, dass wir tatsächlich das ausgewählte Gewebe gewonnen haben.

Nun erfolgt der Erfassungsprozess nicht mit hundertprozentiger Effizienz, da die erfassten Gewebe im Wesentlichen wie fallende Blätter sind. Ein bestimmter kleiner Prozentsatz der erfassten Gewebefragmente fällt nicht innerhalb der Einor-Röhrchenkappe, aber die Verlustrate ist sehr gering, sobald die gewünschte Gewebeentnahme abgeschlossen ist. Der nächste Schritt besteht natürlich darin, das Einor-Röhrchen mit dem erfassten Gewebe vom Instrument zu entfernen und es sicher zu verschließen.

Und um dies zu tun, ziehen wir den Halter sehr vorsichtig gerade heraus, und zwar wie folgt. Dabei beachten, dass die Röhrchenkappe weiterhin nach oben zeigen soll, entfernen Sie den Halter aus der Ablage und ziehen dann das Röhrchen sehr vorsichtig heraus. Verschieben Sie es wie gezeigt, nehmen Sie es aus dem Halter heraus und bewegen Sie anschließend den Einor, nicht den Deckel, und zwar wie folgt.

Wenn man bereits einen Tropfen Triol in den Deckel gegeben hat, beginnt Ihr Gewebe bereits mit dem Solubilisierungsprozess, und Sie können in Ihr Labor zurückkehren und die RNA-Isolierung abschließen. Es gibt eine Reihe von Herstellern, die mikroskalige RNA-Isolierungs-Kits anbieten, wie beispielsweise Amon, der Hersteller, den wir bevorzugen. Das ist alles, was dazu zu sagen ist.

Heute habe ich Ihnen die Einrichtung für Laser-Kapture-Mikroskopie hier an der UC Irvine vorgestellt. Wir haben gezeigt, wie man Gefrierschnittgewebe von Objektträgern mit Pen-Folie-Beschichtung gewinnt, um anschließend RNA aus diesem Gewebe zu isolieren. Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit und viel Erfolg bei Ihrer eigenen Laser-Kapture-Mikrodissektion.