Name: Antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung von Mycobacterium tuberculosis-Komplexes für die First und Second Line Drugs von Bouillon Verdünnung in einem Mikrotiterplatten-Format (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-24T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 39 s
Description: Erfahren Sie die antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung von Mycobacterium tuberculosis für klinische Diagnostik mittels Mikrotiterplatten-Format. Diese Methode ermöglicht gleichzeitige Testung von 12 Antibiotika zur Bestimmung der MIC-Werte.

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Wir möchten an das Labor Technologen der Mayo Clinic Mycobacteriology Laboratory für ihre Hilfe danken während der Studie.

Jedes Labor muss eine Risikobewertung in Zusammenarbeit mit ihren Institutional Biological Safety Officer durchführen, um die entsprechende Sicherheitsstufe für die Vorbereitung des Inokulums und zum Pipettieren des Inokulums in die Platte zu bestimmen. In unserem Labor verwenden wir Sicherheitsstufe 3 Labor (BSL3) Praktiken, bis die Mikrotiterplatten geimpft sind, und mit einem Kunststoff-Kleber versiegeln. Diese Platten werden dann in einen Plastikbeutel, der Wärme-auch versiegelt. Incubation und Interpretation Lesen der Mikrotiterplatte wird in einem Labor der biologischen Sicherheitsstufe 2 (BSL2) durchgeführt. 1. Kennzeichnung von Materialien <ol><li> Beschriften Sie eine Blut-Agar-Platte, drei Middlebrook 7H10-Platten, Middlebrook 7H9-Bouillon, eine Kochsalzlösung zwischen Glasperlen Röhre und einer Mikrotiterplatte AST Platte mit den entsprechenden Kennungen (zB Name des Patienten, medizinische Datensatznummer) in der BSL2. </li><li> Beschriften Sie die Blut-Agar und 7H10 plated als "Reinheit zu überprüfen". Periodische Koloniezahlen des Inokulums werden empfohlen, um sicherzustellen, dass eine geeignete Konzentration von Organismen in den Test verwendet wird. Colony zählt, wenn durchgeführt werden müssen, um zwei der 7H10-Platten mit "1 / 1 Koloniezahl" und "1 / 50 Koloniezahl" gekennzeichnet sind. </li></ol> 2. Technologist Vorbereitungen in den BSL3 gehen <ol><li> Geeignete persönliche Schutzausrüstung ist erforderlich, um in der BSL3 Arbeit und umfasst Solid-Front Kleid, Kopfbedeckung, Handschuhe, Überschuhe und ein Beatmungsgerät. Jedes Organ sollte ihre eigene Atemschutz-Plan in Zusammenarbeit festzulegen mit ihrer Institution Industrial Hygiene Officer. In unserem Labor haben wir mehrere Atemschutzgeräte zur Verfügung, darunter Gebläsefiltergeräte (PAPRs) und ausgestattet HEPA-Filter, N95 halbe Gesicht Atemschutzmasken. </li></ol> 3. Vorbereitung der biologischen Sicherheitswerkbank <ol><li> In der BSL3, bereiten die biologische Sicherheitswerkbank (BSC) durch Desinfektion der Oberfläche und platzieren Sie ein Papiertuch mit Desinfektionsmittel ca. 6 cm von der Entlüftung Panel getränkt. </li><li> Legen Sie einen Abfallbehälter auf der linken Seite, und kleine nephlometer und Vortexer auf der rechten Seite. </li><li> Impfösen, pipetors und Tipps sind neben dem Papiertuch gelegt. </li><li> Legen Sie ein Rack mit dem Organismus (in Brühe oder auf festem Medium) und dem McFarland 0,5 Standard auf dem Papiertuch. </li></ol> 4. Die Kalibrierung des Nephelometer <ol><li> Legen Sie eine Kochsalzlösung zwischen Glasperlen Röhre im Nephelometer und stellen Sie das Gerät auf Null mit der Salzlösung zwischen leer. </li><li> Setzen Sie den McFarland 0,5 Standard im Nephelometer und kalibrieren nach den Anweisungen des Herstellers. </li></ol> 5. Vorbereitung des Inokulums <ol><li> Arbeiten in der BSC, kratzen Kolonien von festen Medium mit einer sterilen Schleife in die entsprechend gekennzeichneten Kochsalzlösung zwischen Glasperlen Röhre, bis eine ≥ 0,5 McFarland Standard erreicht wird. </li><li> Sichtprüfung der Probe, und im Vergleich zu den McFarland Standard. </li><li> Vortex Probe für 30-60 Sekunden. </li><li> Lassen Sie das Inokulum für 15 Minuten absetzen (einen Timer). </li></ol> 6. Inokulation der Mikrotiterplatte <ol><li> Passen Sie das Inokulum mit Kochsalzlösung zwischen Brühe mit dem Nephelometer kalibriert, um die McFarland 0,5 in Stufen 4,1 und 4,2. Dies muss innerhalb von 30 Minuten (je Hersteller-Spezifikationen) abgeschlossen sein. </li><li> Verwenden Sie ein 200 ul Pipette und eine LONG Aerosol resistent Pipettenspitze zu 100 ul Inokulum aus dem TOP 1 / 3 rd der Saline Wulst zwischen Rohr zu entfernen. Beimpfen Middlebrook 7H9 Broth. Langsam Wirbel der beimpften 7H9-Bouillon für 20 Sekunden. </li><li> Entfernen Sie das AST Mikrotiterplatte von der Hersteller-Paket. NICHT verwenden, wenn das Trockenmittel ist blau oder wenn die Folienverpackung beschädigt ist. </li><li> Bereiten Sie eine 1:50-Verdünnung Rohr für die spätere Verwendung in der Vorbereitung der 1:50-Verdünnung durch Pipettieren 50 ul sterilem Wasser in einem sterilen Röhrchen. </li><li> Gießen Sie die Brühe 7H9 Inokulums in einen Trog. AVOID Aerosolerzeugung. </li><li> Legen Sie die AST-Mikrotiterplatte mit dem Etikett nach oben ein. </li><li> Verwenden Sie ein 12-Kanal-Pipette auf 100 ul des Inokulums zu jedem Well hinzu. </li><li> Verdünnungen für Koloniezahlen: <ol type="a"><li> Der 1 / 1 Verdünnung ist von der positiven Kontrolle und (H12) durch Ausstreichen 1 ul-Schleife auf dem 7H10 Platte mit der Aufschrift "1 / 1" vorbereitet. </li><li> Die 1 / 50 Verdünnung durch Animpfen einer 1 ul Schleife von der positiven Kontrolle und (H12) und wirbelnden es in das Rohr mit 50 ul Wasser Rohr hergestellt wie oben beschrieben vorbereitet. Streak 1 ul dieser Verdünnung auf die Platte mit der Aufschrift "1 / 50". </li></ol></li><li> Inoculate die Reinheit Platten aus dem Trog durch Pipettieren 50 ul auf eine entsprechend gekennzeichnet Blutagar und 7H10 Platten-und Streifen für die Isolierung. </li><li> OrtKlebstoff Siegel auf der AST-Mikrotiterplatte. Drücken Sie fest auf jede Vertiefung eine ausreichende Abdichtung mit dem weißen Rücken der Dichtung zu gewährleisten. Vermeiden Sie Knicke. </li><li> Desinfizieren Sie die Mikrotiterplatte durch Abwischen mit einem Papiertuch mit einem tuberkuloziden Desinfektionsmittel und Ort Mikrotiterplatte in eine Plastiktüte und schließen mit einer Wärme-Siegel oder Tape eingelegt. <ol type="a"><li> Der Plastikbeutel dient als sekundäre Behälter, um sicherzustellen, dass alle Brühe enthalten ist, sollte es ein Leck oder spill der primären Platte sein. </li></ol></li></ol> 7. Desinfektion von Materialien und biologischen Sicherheitswerkbank <ol><li> Um zu vermeiden, produzieren Aerosole, legen Sie eine weitere Rinne auf der Oberseite des Troges geimpft, bevor Sie ihn sanft in die verwerfen Container. </li><li> Desinfizieren Sie alle Materialien, einschließlich nephlometer, Vortexer, Platten, Rohre, etc. durch Abwischen mit einem tuberkuloziden Desinfektionsmittel und warten den richtigen Zeitpunkt der Desinfektion gemäß den Anweisungen des Herstellers zu versichern, bevor Sie aus dem BSC. Zum Beispiel erfordert ProSpray, tuberkuloziden Desinfektionsmittel verwenden wir, 15 Minuten, um zu töten Mykobakterien. </li><li> Legen Sie die zu verwerfen Behälter an einem biohazard Tasche und Dichtung vor dem Autoklavieren. </li></ol> 8. Incubation <ol><li> Die Platten sollten mit den Medien inkubiert unten und darauf zu achten, damit kein Spritzwasser oder eine Flüssigkeit sein. </li><li> Inkubieren Sie die AST Mikrotiterplatte Platte, 7H10 und Blut-Agar-Platten in einem 35-37 ° C Inkubator mit 5-10% CO 2 mit 5-10% CO 2 in die BSL2 Labor. <ol class="lalpha"><li> In unserem Labor ist dies akzeptabel, da die Platte ist gut verschlossen und in einem verschlossenen Plastikbeutel. </li></ol></li><li> Nicht mehr als 2 Mikrotiterplatten AST Platten sollten in den Inkubator nach den Anweisungen des Herstellers gestapelt werden. </li></ol> 9. Repräsentative Ergebnisse Die Interpretation der Ergebnisse: Sealed AST Mikrotiterplatten lesen kann manuell über einen Spiegel als Hilfsmittel oder mit einem automatisierten Platten-Lesegerät wie dem Vizion (TREK Diagnostics) werden. Die Platten können so bald wie 7 Tage nach der Impfung untersucht werden. Untersuchen Sie das Wachstum Kontrollvertiefungen in Positionen H11 und H12, um festzustellen, ob sie positiv (dh, eine Anzahlung von Zellen am Boden des Brunnens) sind. Wenn das Wachstum Kontrollvertiefungen nicht positiv sind, inkubieren der Platte und in regelmäßigen Abständen erneut zu prüfen (zB, Tag 10, Tag 14), bis das Wachstum Kontrollvertiefungen positiv sind. <ol type="a"><li> Spiegel zu lesen: <ol type="i"><li> Ort versiegelt AST Mikrotiterplatte auf die Plattform; </li><li> Lesen Wachstum Kontrollvertiefungen nach 7 Tagen Inkubation, wenn dieser negativ ist, inkubieren AST Mikrotiterplatte; </li><li> Wenn das Wachstum steuert akzeptabel sind, dann lesen Sie das Medikament enthaltenden Brunnen. Für für jedes Medikament, notieren Sie die erste Verdünnung, dass kein Wachstum wurde durch den Vergleich der Drogen-Brunnen mit dem Wachstum zu kontrollieren. </li><li> Das Wachstum wird als Trübung oder als Ablagerung von Zellen am Boden eines Brunnens. </li></ol></li><li> Instrument Lesen Sie: Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers, die folgenden Anweisungen sind ein Beispiel dafür, wie die Lesart mit dem Vizion Plattform durchgeführt werden: <ol type="i"><li> Log in. </li><li> Verwenden Sie "MYCOTB" AST Platte Software. </li><li> Ort versiegelt Platte mit dem Barcode mit Blick auf den Benutzer. Das Wachstum wird als Trübung oder als Ablagerung von Zellen am Boden eines Brunnens. </li><li> Lesen Sie das Wachstum kontrolliert, wenn dieser negativ ist, inkubieren AST Mikrotiterplatte, wenn positive lesen Sie die Platte durch Berühren des Bildschirms mit dem ersten und jedes Medikament, das nicht angezeigt wird Wachstum. </li></ol></li></ol> Lesen Reinheit Platten. Das Blut-Agar-Platte sollte kein Wachstum nach 48 Stunden zeigen und die 7H10 Reinheit Platte sollte konfluenten Wachstum eines Organismus Typ haben. Falls kontaminiert, muss das AST Mikrotiter-Test von einer Reinkultur wiederholt werden. Berechnen Koloniezahlen von der positiven Kontrolle auch in der folgenden Tabelle: Koloniezahl Key <table border="1"><tbody><tr><td> # Kolonien auf der Platte mit der Aufschrift "1 / 1" gezählt </td><td> # Kolonien auf der Platte mit der Aufschrift "1 / 50" gezählt </td><td> Inokulum Koloniezahl (KBE / ml) </td></tr><tr><td> &lt;50 </td><td> 0 </td><td> &lt;5 X 10 4 </td></tr><tr><td> 50-100 </td><td> 0-2 </td><td> 5 X 04 bis 1 Oktober X 10 5 </td></tr><tr><td> &gt; 100 </td><td> ≤ 10 </td><td> 1 X 05 bis 5 Oktober X 10 5 </td></tr><tr><td> &gt; 100 </td><td> &gt; 10 </td><td> &gt; 5 X 10 5 </td></tr></tbody></table> Es kann mit Para-Aminosalicylsäure werden nachgestellte in einigen Stämmen von Mycobacterium Tuberkulosesis. Dies können Sie an allen Brunnen, Pellets und mit dem ersten gut, dass die gleiche Größe Pellet wurde als die nächste Verdünnung als Endpunkt interpretiert werden. Widerstand ist selten mit dieser Droge. <img src="/files/ftp_upload/3094/3094fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Repräsentative Ergebnisse mit dem MYCOTB Platte. <table border="1"><tbody><tr><td> Drug Abkürzung </td><td> Medikament </td><td> MIC μ / ml </td></tr><tr><td> OFL </td><td> Ofloxacin </td><td> 16 </td></tr><tr><td> MXF </td><td> Moxifloxacin </td><td> 8 </td></tr><tr><td> RIF </td><td> Rifampicin </td><td> &gt; 16 </td></tr><tr><td> AMI </td><td> Amikacin </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> STR </td><td> Streptomycin </td><td> 16 </td></tr><tr><td> RFB </td><td> Rifabutin </td><td> 8 </td></tr><tr><td> PAS </td><td> p-Aminosalicylsäure </td><td> ≤ 0,5 </td></tr><tr><td> ETH </td><td> Ethionamid </td><td> 5 </td></tr><tr><td> CYC </td><td> Cycloserin </td><td> 4 </td></tr><tr><td> INH </td><td> Isoniazid </td><td> 2 </td></tr><tr><td> KAN </td><td> Kanamycin </td><td> 1,2 </td></tr><tr><td> EMB </td><td> Ethambutol </td><td> 4,0 </td></tr></tbody></table>

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</ol>

Ein Beispiel für eine AST Mikrotiterplatte, dass ein positives Wachstum steuert hat, ist in Abbildung 1 dargestellt, und der Endpunkt MIC (ug / ml) für jedes Medikament ist eingekreist. Eine Studie in unserem Labor durchgeführt angedeutet, dass die AST Mikrotiterplatte Methode entspricht dem Goldstandard Agar Anteil Methode für die Empfindlichkeitsprüfung von Mycobacterium tuberculosis ist. Schnellere Berichterstattung über die Ergebnisse mit Mikrotiter AST Mikrotiterplatte wurde erhalten, wenn die traditionellen Agar Anteil Methode mit der endgültigen Interpretation für AST Mikrotiterplatte und Agar Anteil Methode bei 14 und 21 Tagen hat gegenüber respectively.The AST Mikrotiterplatte den Vorteil des Testens ersten und zweiten Zeile Drogen gleichzeitig mit deren Hilfe verhindert übermäßige Verzögerungen bei resistenten Stämmen können. Die AST Mikrotiterplatte ist auch viel einfacher einzurichten und zu lesen als die APM und sowohl eine manuelle Spiegel und ein halbautomatisches System, wie die VIZION kann verwendet werden, um die Platten gelesen werden. Die Verfügbarkeit eines MIC-Wert für TB-Medikamente Resistenzen können wertvolle neue Informationen für Ärzte in Bezug auf die traditionelle kritische Konzentration Mehrwert zu bieten, vor allem für diejenigen Isolate mit &quot;borderline&quot; Anfälligkeit.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> AST Mikrotiterplatten und Klebedichtung </td><td> TREK Diagnostics, Cleveland Ohio </td><td> MYCOTB </td></tr><tr><td> McFarland 0,5 Standard- </td><td> TREK Diagnostics, Cleveland, Ohio </td><td> E1041 </td></tr><tr><td> Middlebrook 7H10-Platten </td><td> Fischer </td><td></td></tr><tr><td> Blutagarplatten </td><td> Fischer </td><td></td></tr><tr><td> Sterile Schleifen 1 ul </td><td> Fischer </td><td></td></tr><tr><td> Sterile Schleifen 10 ul </td><td> Fischer </td><td></td></tr><tr><td> Sensititre Saline-Tween Glasperlen Brühe </td><td> TREK Diagnostics, Cleveland, Ohio </td><td> 27143 </td></tr><tr><td> 7H9 OADC Broth </td><td> TREK Diagnostics, Cleveland, Ohio </td><td> T3440 </td></tr><tr><td> Lange Pipettenspitzen </td><td> Fischer </td><td></td></tr><tr><td> Sterile Tröge </td><td> TREK Diagnostics, Cleveland, Ohio </td><td></td></tr><tr><td> M. tuberculosis </td><td> ATCC </td><td> 27294 </td></tr><tr><td> Pipeters: 1000, 200, 20 &amp;mgr; l </td><td> Fischer </td><td></td></tr><tr><td> Tipps 1000, 20, 20 ul </td><td> Fischer </td><td></td></tr><tr><td> Multichannel Pipetten </td><td> Fischer </td><td></td></tr><tr><td> Incubator 5-10% CO 2 </td><td> Fischer </td><td></td></tr><tr><td> Plastiktüten, klein, CO 2 durchlässig </td><td> Poly Plastic, Delano, PA </td><td></td></tr><tr><td> TB Desinfektionsmittel (So wie ProSpray C-60) </td><td> Certol International, Commerce City, CO </td><td> PSC60/32 </td></tr><tr><td> Spiegel Box Reader </td><td> Fischer </td><td></td></tr></tbody></table>

antimikrobielle empfindlichkeitsprüfung von mycobacterium tuberculosis-komplexes für die first und second line drugs von bouillon verdünnung in einem mikrotiterplatten-format

Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format

Die schnelle Erkennung von Antibiotikaresistenzen wird in dem Bemühen, den Anstieg der resistenten Mycobacterium tuberculosis (Mtb) Kontrolle wichtig. Antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung (AST) von Mtb wird traditionell von den Agar-Methode der Anteil oder durch macrobroth Tests auf einem Instrument wie dem BACTEC (Becton Dickinson, Sparks, MD), VersaTREK (TREK Diagnostics, Cleveland, OH) oder BacT / durchgeführt ALERT (bioMérieux, Hazelwood, MO). Die Agar-Anteil Methode, obwohl als &quot;Gold&quot;-Standard von AST, ist arbeitsintensiv und erfordert die Berechnung des Widerstandes, indem Koloniezahlen auf Drogen-haltigen Agar zu drogenfreien Agar verglichen. Wenn es ≥ 1% Wachstum auf das Medikament enthaltenden Medium, um Drogen-freiem Medium verglichen wird, ist der Organismus als resistent gegen das Medikament. Die macrobroth Methoden erfordern Mess-und Prüftechnik Haltepunkt (&quot;critical&quot;) Wirkstoffkonzentrationen für die erste Zeile Medikamente (Isoniazid, Ethambutol, Rifampicin und Pyrazinamid). Die hier beschriebene Methode ist im Handel erhältlich in einer 96-well Mikrotiterplatten-Format [MYCOTB (TREK Diagnostics)] und enthält steigenden Konzentrationen von 12 Antibiotika zur Behandlung von Tuberkulose verwendet werden, einschließlich sowohl der ersten (Isoniazid, Rifampicin, Ethambutol) und zweite Zeile Medikamente (Amikacin, Cycloserin Ethionamid, Kanamycin, Moxifloxacin, Ofloxacin, para-Aminosalicylsäure, Rifabutin, und Streptomycin). Pyrazinamid ist ein erster Linie Droge, nicht in der Mikrotiterplatte durch seine Notwendigkeit sauren Prüfbedingungen enthalten. Vorteile der Mikro-System gehören sowohl einfache Einrichtung und schneller Umdrehung um Zeit (14 Tage) im Vergleich zu traditionellen Agar Anteil (21 Tage). Darüber hinaus kann die Platte aus Inokulum hergestellt unter Verwendung von entweder Brühe oder festen Medium eingestellt werden. Da die Mikrotiterplatten-Format ist neu und seit Mtb präsentiert einzigartige Herausforderungen an die Sicherheit im Labor, dieses Protokoll wird beschrieben, wie Sie sicher Setup, inkubieren und lesen Sie die Mikrotiterplatte.

Antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung von Mycobacterium tuberculosis ist anspruchsvoll, aber von entscheidender Bedeutung für die Patientenversorgung. Diese Mikrotiterplatten-Format bietet Tests von 12 antimykobakterielle Drogen und bietet minimale hemmende Konzentration (MIC)-Werte, die in eine geeignete Behandlung helfen werden.

Antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung von Mycobacterium tuberculosis-Komplexes für die First und Second Line Drugs von Bouillon Verdünnung in einem Mikrotiterplatten-Format

Die schnelle Detektion antimikrobieller Resistenzen ist wichtig für die Bemühungen zur Kontrolle der Zunahme resistenter Mycobacterium tuberculosis (Mtb). ...

Es stehen relativ wenige Arzneimittel zur Behandlung von Mycobacterium tuberculosis zur Verfügung, weshalb Resistenz gegen jedes Medikament besorgniserregend ist. Dieser Videoartikel beschreibt ein Verfahren zum gleichzeitigen Testen der Antibiotikaresistenz von M. tuberculosis gegenüber 12 verschiedenen antimikrobiellen Wirkstoffen. Daher ist die Fähigkeit, die antimikrobielle Resistenz von M. tuberculosis schnell nachzuweisen, von großer Bedeutung, um die Ausbreitung resistenter Stämme einzudämmen. Hierzu dient der Test der Antibiotikasuszeptibilität.M. tuberculosis wird zunächst auf festem Medium oder in Brühe kultiviert, um eine bakterielle Suspension herzustellen. Der Inokulum wird präpariert und in eine Mikrotiterplatte gegeben, die unterschiedliche Konzentrationen von 12 Arzneimitteln enthält, darunter First-Line- und Second-Line-Medikamente. Nach der Inkubation wird das Ausmaß des Wachstums in jedem Brunnen entweder manuell mit einer Spiegelbox oder mithilfe eines halbautomatischen Plattenlesegeräts bestimmt.Die erhaltenen Daten zeigen die minimale Hemmkonzentration für jedes getestete Medikament und geben an, gegenüber welchen Antibiotika der untersuchte TB-Stamm resistent ist. Diese Ergebnisse unterstützen bei der Auswahl des geeigneten Medikaments zur Behandlung von TB. Hallo, mein Name ist Nancy Ek und ich bin Leiterin des Labors für Mykobakteriologie an der Mayo Clinic in Rochester, Minnesota.Heute werden wir eine Methode zur Durchführung von Antibiotikasuszeptibilitätstests für Mycobacterium tuberculosis beschreiben. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Makro-Brühenverdünnung besteht darin, dass für jedes Medikament eine MHK bestimmt wird und 12 Antibiotika gleichzeitig getestet werden. Kurt Jude, ein Qualitätsbeauftragter in meinem Labor, wird das Verfahren am Laborarbeitsplatz demonstrieren.Bereiten Sie dieses Verfahren vor, indem Sie eine Blutagarplatte, drei Middlebrook-7H10-Platten, ein Saline-Tween-Glaskügelchenröhrchen und eine Mikrotiterplatte mit dem Namen des Patienten und der Probenidentifikationsnummer beschriften. Zusätzlich kennzeichnen Sie die Blutagar- und die 7H10-Platten als Reinheit. Kennzeichnen Sie eine dieser 7H10-Platten als 1:1-Kolonienzählung und die andere als 1:50-Kolonienzählung.Stellen Sie dann das Tablett in den Durchreichebehälter. Bereiten Sie anschließend die Arbeit in der Biosicherheitsstufe drei (BSL-3) einrichtung vor, indem Sie eine geschlossene Vorderseite-Schutzkluft, Kopfbedeckung, Handschuhe, Schuhüberzieher und einen Atemschutz tragen. Hier wird ein PAPR-Atemschutz verwendet.Nehmen Sie dann das Fach aus der Übergabekammer heraus. Desinfizieren Sie anschließend im BSL-3-Labor die Oberfläche des biologischen Sicherheitswerks. Anschließend platzieren Sie ein mit Desinfektionsmittel getränktes Papierhandtuch etwa 15 cm von der Luftaustrittsplatte entfernt innerhalb des Sicherheitswerks neben dem Papierhandtuch.Stellen Sie Inokulationsh&ouml;lzer, Pipetten und Spitzen, einen geeigneten Abfallbeh&auml;lter, einen Nephi, TER und einen Vortex bereit. Sobald der Haube vorbereitet ist, stellen Sie den Organismus zusammen mit einem Rack, das einen McFarland 0,5-Standard A seven H nine Br&uuml;he mit OADC, sowie einen Salinperlenrohr auf das Papiertuch. Dieser Aufbau erfolgt aus festem Medium.Bereiten Sie das Inokulum aus einer Kultur auf festem Medium aus einer Patientenprobe vor. Verwenden Sie eine sterile Öse, um die Kolonien abzukratzen und in das Salin-Tween-Glasperlkügelchenröhrchen zu überführen. Vortexen Sie die Suspension 30 bis 60 Sekunden lang.Visuell die Probe überprüfen und mit dem McFarland-Standard vergleichen. Die übertragene Menge sollte gleich oder größer als der Standard sein. Falls nicht, weitere Bakterienprobe hinzufügen und erneut vortexen.Wenn der McFarland-Standard erreicht ist, lässt man den Inokulum 15 Minuten lang ruhen, damit sich größere Bakterienklumpen absetzen können. Danach verwendet man ein Nefi TER, um die Dichte der suspendierten Bakterien auf Null zu messen. Das Nephi TER.Platzieren Sie zunächst ein leeres Salinperlen-Tween-Röhrchen im Nephi ter. Drücken Sie die Kalibrierungstaste, um das Gerät zu nullen, und stellen Sie dann den McFarland-0,5-Standard in den Nephi ter. Drücken Sie erneut die Kalibrierungstaste. Sobald das Gerät kalibriert ist, entfernen Sie den McFarland-Standard und fügen die Inokulationsflüssigkeit ein.Die Inokulumablesung sollte der Ablesung des McFarland-Standards entsprechen. Falls die Ablesung zu niedrig ist, entfernen Sie das Reagenzglas und übertragen mehr Bakterien von der Platte. Anschließend vortexen und die Probe erneut ablesen.Wenn der Wert zu hoch ist, geben Sie Salin-Tween in das Röhrchen und wirbeln Sie es. Lesen Sie die Probe anschließend erneut ab. Passen Sie den Inokulum nach Bedarf weiter an, bis die Konzentration der Bakterien dem McFarland-Standard entspricht.Als Nächstes verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipette und eine lange aerosolresistente Pipettenspitze, um 100 Mikroliter Inokulum aus dem oberen Drittel des Röhrchens zu entnehmen. Um Klumpen, die sich am Boden absetzen, zu vermeiden, vorsichtig die mit dem Inokulum versetzte Middlebrook-7H9-Brühe langsam 20 Sekunden lang verwirbeln, um das Inokulum zu plattieren. Beginnen Sie damit, die Mikrotiterplatte aus der Verpackung des Herstellers zu entnehmen. Wenn das Trockenmittel blau ist oder die Folienverpackung beschädigt ist, verwenden Sie diese nicht.Die Platte enthält bereits die 12 zu testenden antimikrobiellen Substanzen in jedem Brunnen, einschließlich der wirksamsten oder ersten Wahl-Medikamente sowie Medikamente der zweiten Wahl. Gießen Sie vorsichtig das sieben H neun Brühe-Inokulum in ein Trth, wobei darauf geachtet werden muss, keine Aerosole zu erzeugen. Danach platzieren Sie die Mikrotiterplatte mit dem Etikett nach außen, wie hier gezeigt, und verwenden einen 12-Kanal-Pipettierer, um 100 Mikroliter des Inokulums in jeden Brunnen zuzugeben.Bereiten Sie anschließend Platten zur Durchführung von Koloniezählungen vor. Erstellen Sie zunächst eine undiluierte Platte, indem Sie eine Ein-Mikroliter-Schleife der Probe aus dem positiven Kontrollbrunnen auf die mit 1:1 beschriftete H 10-Platte übertragen. Verwenden Sie dann die Schleife, um die Platte wie hier gezeigt zu bestreichen.Danach übertragen Sie mit einer Ein-Mikroliter-Schleife eine Probe aus dem Positivkontrollbrunnen und wirbeln sie in das Reagenzglas mit 50 Mikrolitern Wasser an. Tragen Sie ein Mikroliter dieser Verdünnung auf die mit „1:50“ beschriftete Platte auf. Inokulieren Sie die Reinheitsplatten, indem Sie 50 Mikroliter des Inokulums aus dem TRTH mittels Pipette auf entsprechend beschriftete Blutagar- und 7H10-Platten übertragen und ausstrichen.Dann stapeln Sie ein weiteres trth auf das beimpfte trth und legen Sie es vorsichtig in den Entsorgungsbehälter. Bringen Sie eine Klebeversiegelung auf der Mikrotiterplatte an. Drücken Sie dann mithilfe der weißen Unterlage fest auf jedes Loch, um eine ausreichende Versiegelung sicherzustellen, und achten Sie darauf, dass keine Falten entstehen.Desinfizieren Sie die Mikrotiterplatte, indem Sie sie mit einem mit einem tuberkuloziden Desinfektionsmittel getränkten Papierhandtuch abwischen. Anschließend stellen Sie die Mikrotiterplatte in eine Plastiktüte und verschließen diese mit einer Heißsiegelung. Desinfizieren Sie abschließend sämtliche Materialien, einschließlich der Nephi, des Vortexfilters, der Platten und Röhrchen, indem Sie sie mit einem tuberkuloziden Desinfektionsmittel abwischen.Hier wird Pro-Spray verwendet, nachdem genügend Zeit zur Sicherstellung der Desinfektion verstrichen ist. 15 Minuten für Pro-Spray. Die Platten werden mit Tesafilm abgeklebt, in Plastiktüten verpackt, und die versiegelten Materialien werden aus dem Sicherheitswerkbank entnommen und in den Durchreichebereich gebracht.Der rote Entsorgungsbeutel wird an dieser Stelle geschlossen und mit einer Kabelbinder verschlossen; anschließend werden Kittel, Schuhüberzieher und Handschuhe ausgezogen. Nachdem man in den Vorraum gegangen und die Hände gewaschen hat, wird der Atemschutz entfernt, nach erneutem Händewaschen desinfiziert und aufbewahrt; danach wird ein neuer Kittel angelegt und die BSL-3-Einheit verlassen. Danach wird der Entsorgungsbehälter autoklaviert.Im Anschluss inkubieren Sie die Mikrotiterplatte und die sieben H 10- und Blutaugerplatten in aufrechter Position im Brutschrank bei 35 bis 37 °C mit 5 bis 10 % CO2 im BSL-2-Labor. Dies ist akzeptabel, da die Platte gut verschlossen und in einer Plastiktüte verpackt ist. Die Generationszeit von Mycobacterium tuberculosis beträgt etwa 12 bis 24 Stunden, sodass es mindestens eine Woche dauern wird, bis Wachstum sichtbar ist, das sich als Zellpellet am Boden des Kontrollbrunnens zeigt. Am Tag 10 führen Sie eine manuelle Spiegelablesung durch, indem Sie die verschlossene a ST Mikrotiterplatte auf die Plattform der Spiegelbox legen.Verwenden Sie eine Tischlampe, um das Wachstum besser sichtbar zu machen, und passen Sie gegebenenfalls an, um den besten Kontrast zu erzielen. Überprüfen Sie die Wachstumskontrollbrunnen, in diesem Fall H 11 und H 12, indem Sie in den Spiegel schauen. Bei Wachstum erscheint die Brunne trüb oder es liegt ein Sediment vor, wie hier gezeigt.Wenn kein Wachstum vorhanden ist, wie in diesem Beispiel gezeigt, erscheint die Vertiefung klar. In diesem Fall stellen Sie die Platte zurück in den Inkubator und inkubieren Sie weiterhin bis zu 21 Tage lang. Vergleichen Sie für jede Bedingung das Wachstum mit der Kontrolle.Nun, für jeden Wirkstoffeintrag die erste Verdünnung, bei der kein Wachstum zu beobachten ist. Dies ist die minimale Hemmkonzentration oder MIC für den Wirkstoff. Um die Ergebnisse mithilfe eines automatisierten Plattenlesegeräts wie dem Vision zu untersuchen, öffnen Sie zunächst die Myco TB a ST Plate-Software und melden Sie sich an. Platzieren Sie die versiegelte Platte mit dem Barcode nach außen, wie hier gezeigt. Auf dem Computerbildschirm erscheint Wachstum als Trübung oder als Zellablagerung am Boden eines Wells.Zunächst die Wachstumskontrollen untersuchen. Wie zuvor. Wenn kein Wachstum festzustellen ist, die Platte erneut für bis zu 21 Tage in den Inkubator stellen.Falls dies positiv ist, notieren Sie die Ergebnisse, indem Sie das erste Loch berühren, das auf dem Bildschirm für jede Droge kein Wachstum zeigt. In einigen Fällen setzen sich Bakterien, Sediment oder Medikamente am Boden des Lochs ab. Dieses Phänomen, das als Schleppwirkung bekannt ist, zeigt sich durch mehrere Löcher mit Pellets gleicher Größe und wird nicht als tatsächliches Wachstum angesehen.Anschließend werden die sieben H 10- und Blutagarplatten untersucht, um die bakteriellen Konzentrationen zu bestimmen und die Reinheit zu beurteilen. Auf der Blutagarplatte sollte nach 48 Stunden kein Wachstum sichtbar sein. Ein Wachstum auf der Blutagarplatte weist auf Kontaminationen mit schnell wachsenden Bakterien hin.Wenn ein Wachstum vorliegt, muss der Mikrotiter-Test wiederholt werden. Auf der H 10-Reinheitsplatte sollte Wachstum eines einzigen Organismus zu beobachten sein. Mycobacterium tuberculosis sollte blassbraun, gefärbt, faltig und rau erscheinen. Bei Kontamination muss der Mikrotiter-Test aus einer Reinkultur wiederholt werden.Um die bakterielle Konzentration zu bestimmen, zählen Sie die Kolonien auf der H 10-Platte. Anschließend berechnen Sie anhand der Tabelle im beigefügten schriftlichen Dokument die Koloniezahlen. Mycobacterium tuberculosis wurde aus einer Patientenprobe kultiviert, und die Antibiotikaresistenz wurde wie in diesem Video beschrieben anhand der hier gezeigten Platte beurteilt, auf der 12 verschiedene Wirkstoffe in ansteigenden Konzentrationen vorhanden sind, wobei die höchsten Konzentrationen oben und die niedrigsten Konzentrationen unten liegen.Die minimale Hemmkonzentration oder MIC des Wirkstoffs wurde durch die niedrigste Konzentration des Wirkstoffs angegeben, die kein Wachstum zeigte, und ist im hier gezeigten Bild mithilfe standardisierter Breakpoints, die vom Clinical and Laboratory Standards Institute festgelegt wurden, umkreist. Die hier gezeigten Daten deuten darauf hin, dass dieser TB-Stamm resistent gegenüber Isid und Rifampicin sein wird. In vitro deuten die hohen MIC-Werte, die bei mehreren anderen Wirkstoffen beobachtet wurden, einschließlich Oin, Moxifloxacin, Streptomycin und Rifabutin, auf eine Resistenz des EM-Tuberkulose-Stamms gegenüber diesen Substanzen hin.Die MIC-Ergebnisse sollten von einem auf die Behandlung von Tuberkulose erfahrenen Spezialisten für Infektionskrankheiten genutzt werden, um einen individuellen Behandlungsplan zu erstellen. Sobald die Methode beherrscht ist, dauert die Einrichtung eines Isolats etwa 40 Minuten. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass es sich hierbei um einen respiratorischen Erreger handelt und nach dem Auftragen Aerosole entstehen können. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung von Mycobacterium tuberculosis mithilfe der Mikrobrühenverdünnungsmethode durchgeführt wird. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Mycobacterium tuberculosis äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie Atemschutz stets getroffen werden sollten, wo dies erforderlich ist.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Die mikroskopische Beobachtung-Drug-Anfälligkeit (MODS) Test ist ein low-cost, low-tech Werkzeug für High-Performance-Nachweis von Tuberkulose (TB) und multiresistenter Tuberkulose (MDRTB). Dieses Video beschreibt die MODS flüssigen Medien Kultur-Methode.

Der MODS Verfahren zur Diagnose von Tuberkulose und multiresistente Tuberkulose

Mycobacterium tuberculosis bildet Wirkstoff toleranten Biofilme, wenn unter bestimmten Bedingungen kultiviert. Hier beschreiben wir Verfahren zur Kultivierung von M. Tuberkulose Biofilmen und die Bestimmung der Häufigkeit des Drogenkonsums tolerant persisters. Diese Protokolle werden für weitere Studien sinnvoll in die Mechanismen der Verträglichkeit der Medikamente in M. Tuberkulose.

Wachstum von Mycobacterium tuberculosis Biofilme

Quelle: Koeth, L. M., et. al., Eine Referenzbouillon-Mikrodilutionsmethode für Dalbavancin  In-vitro-Empfindlichkeitstests von Bakterien, die aerob wachsen. J. Vis. Exp. (2015).Dieses Video zeigt die Bouillon-Mikrodilutionsmethode zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MIC) eines Lipoglykopeptid-Antibiotikums gegen grampositive Bakterien. Es umfasst die Isolierung von Bakterienkolonien, die Verdünnung, die Inokulation von Mikrotiterplatten-Wells mit unterschiedlichen...

Eine Bouillon-Mikrodilutionsmethode zur Antibiotika-Empfindlichkeitsprüfung von grampositiven Bakterien

Dieses Video zeigt einen Assay zur Bewertung der Wirksamkeit von Medikamenten gegen Mycobacterium tuberculosis (Mtb)-Infektionen. Es wird ein in vitro Infektionsmodell mit Mtb/Makrophagen-Aggregaten erstellt, das eine in vivo Infektion nachahmt. Bei der Einführung geeigneter Antibiotika wird deren Wirksamkeit mittels Resuzarin-Assay getestet, um das Überleben von Bakterien mit steigenden Wirkstoffkonzentrationen zu überwachen.

Ein Assay zur Bewertung der Wirksamkeit von Medikamenten gegen ein Mycobacterium tuberculosis-Infektionsmodell

Dieses Video zeigt einen In-Bouillon-Assay zur Bestimmung der Wirksamkeit von Antibiotika gegen Mycobacterium tuberculosis. Die Bakterienkultur wird mit unterschiedlichen Konzentrationen eines bakteriziden Antibiotikums inkubiert. Die bakterizide Wirksamkeit wird gemessen, indem das Vorhandensein lebensfähiger Bakterien mit einem Resazurin-Assay beurteilt wird.

Bewertung der Wirksamkeit eines Testpräparats gegen Mykobakterien in Brühe

Das charcoal agar resazurin assay (CARA) ist eine semiquantitative Methode mit mittlerem Durchsatz zur Beurteilung der Aktivität von Testmitteln gegen Mykobakterien, die replizieren, nicht replizieren oder beides.  Der CARA ermöglicht eine schnelle Bewertung der zeit- und konzentrationsabhängigen Aktivität und identifiziert Parameter, die mit Assays für koloniebildende Einheiten (KBE) verfolgt werden sollen.

Visualisierung des Charcoal Agar Resazurin-Assay für Semi-quantitative, Mitteldurch Auszählung von Mykobakterien

Wir haben für die Entdeckung neuer Verbindungen gegen Mycobacterium tuberculosis ein modulares Hochdurchsatz - Screening - System entwickelt, und die intrazelluläre Targeting-Brühe in Bakterien sowie Zytotoxizität gegen die Säuger - Wirtszelle wächst.

System zur Wirksamkeit und Zytotoxizität Screening von Inhibitoren Targeting intrazellulärer<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Neue Modelle und Assays, die den frühen Prozess der Arzneimittelentwicklung für Anti-Tuberkulose-Medikamente der nächsten Generation verbessern würden, sind sehr wünschenswert. Hier beschreiben wir einen schnellen, kostengünstigen und BSL-2-kompatiblen Assay zur Bewertung der Wirksamkeit von Medikamenten gegen Mycobacterium tuberculosis, der leicht für das Hochdurchsatz-Screening angepasst werden kann.

Ein Hochdurchsatz-Assay unterstützte Wirksamkeit von Medikamenten gegen Makrophagen agierten zur Bewertung<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Eine schnelle und effiziente Quantifizierung des intrazellulären M . tuberculosis-Wachstums ist entscheidend für verbesserte Therapien gegen Tuberkulose (TB). Dieses Protokoll beschreibt einen brühebasierten kolorimetrischen Detektionsassay unter Verwendung eines automatisierten Flüssigkultursystems zur Quantifizierung des Mtb-Wachstums in Makrophagen, die mit Wirtstherapiekandidaten behandelt werden.

Ein automatisiertes Kultursystem zur präklinischen Erprobung wirtsgerichteter Therapien für Tuberkulose

Hier stellen wir ein Protokoll zur Identifizierung potenzieller Anti-Tuberkulose-Medikamentenkandidaten durch phänotypisches Screening vor, das die chemische Synthese einer 4-Aminochinolin-Verbindung, die Bestimmung der minimalen inhibitorischen Konzentration gegen Mycobacterium tuberculosis und die Bewertung ihrer Zytotoxizität in Säugetierzelllinien umfasst.

Identifikation potenzieller Anti-TB-Kandidaten: Ein Schritt-für-Schritt-Leitfaden zur Synthese, MIC-Bestimmung und Zytotoxizitätsbewertung in Säugetierzellen

Erfahren Sie die antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung von Mycobacterium tuberculosis für klinische Diagnostik mittels Mikrotiterplatten-Format. Diese Methode ermöglicht gleichzeitige Testung von 12 Antibiotika zur Bestimmung der MIC-Werte.

Antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung von Mycobacterium tuberculosis-Komplexes für die First und Second Line Drugs von Bouillon Verdünnung in einem Mikrotiterplatten-Format (Video) | JoVE Journal

Antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung von Mycobacterium tuberculosis-Komplexes für die First und Second Line Drugs von Bouillon Verdünnung in einem Mikrotiterplatten-Format

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