Antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung von Mycobacterium tuberculosis-Komplexes für die First und Second Line Drugs von Bouillon Verdünnung in einem Mikrotiterplatten-Format

Es gibt relativ wenige Medikamente zur Behandlung von Mycobacterium tuberculosis, so dass die Resistenz gegen jedes Medikament ein Problem darstellt. Dieser Videoartikel beschreibt ein Verfahren zum Testen der Antibiotikaresistenz von M. tuberculosis gegen 12 verschiedene mikrobielle Medikamente gleichzeitig. Daher ist die Fähigkeit, Antibiotikaresistenzen von M tuberculosis schnell nachzuweisen, sehr wichtig bei den Bemühungen, die Zunahme von Resistenzstämmen zu kontrollieren

M tuberculosis wird zuerst auf festen oder in Brühe, einer bakteriellen Suspension, gezüchtet. Das Inokulum wird vorbereitet und nach der Inkubation auf eine Mikrotiterplatte gegeben, die unterschiedliche Konzentrationen von 12 Arzneimitteln enthält, einschließlich Erstlinien- und Zweitlinienmedikamenten. Das Ausmaß des Wachstums in jeder Vertiefung wird entweder manuell mit einer Spiegelbox oder mit einem halbautomatischen Plattenleser bestimmt.

Die daraus resultierenden Daten geben Aufschluss über die minimale Hemmkonzentration für jedes getestete Medikament und zeigen, gegen welche Antibiotika der getestete TB-Stamm resistent ist. Diese Ergebnisse helfen bei der Auswahl des geeigneten Medikaments zur Behandlung von TB. Hallo, mein Name ist Nancy Ek und ich bin Direktorin des Myco Bacteriology Laboratory an der Mayo Clinic in Rochester, Minnesota.

Heute werden wir eine Methode zur Durchführung von Antibiotika-Empfindlichkeitstests für Mycobacterium tuberculosis beschreiben. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Makrobrühe-Verdünnung besteht darin, dass für jedes Medikament ein MHK bestimmt wird und 12 Antibiotika gleichzeitig getestet werden. Kurt Jude, ein Qualitätsspezialist in meinem Labor, wird das Verfahren an einem Labortisch demonstrieren.

Bereiten Sie sich auf dieses Verfahren vor, indem Sie eine Blutagarplatte, drei Middlebrooks-Platten mit sieben H 10, ein Kochsalzlösungs-Tween-Glasperlenröhrchen und eine Mikrotiterplatte mit dem Namen des Patienten und der Probenidentifikationsnummer beschriften. Beschriften Sie zusätzlich den Blutagar und sieben H 10 Platten als Reinheit. Überprüfen Sie, ob Sie eine dieser sieben H 10-Platten mit einer zu einer Koloniezahl und die andere mit einer zu 50 Koloniezahl beschriften.

Legen Sie dann das Fach in die Durchreiche. Bereiten Sie sich als Nächstes auf die Arbeit in der BSL-Drei-Einrichtung der Biosicherheitsstufe drei vor, indem Sie einen festen Vorderkittel, Kopfbedeckungshandschuhe, Schuhüberzieher und eine Atemschutzmaske anziehen. Hier kommt eine Pappa-Atemschutzmaske zum Einsatz.

Nehmen Sie dann das Fach aus der Durchreiche. Desinfizieren Sie anschließend in der Anlage der BSL drei die Oberfläche der biologischen Sicherheitswerkbank. Legen Sie dann ein mit Desinfektionsmittel getränktes Papiertuch in die Haube, etwa sechs Zentimeter von der Lüftungsblende entfernt, neben das Papiertuch.

Platzieren Sie Impfösen, Pipettieren und Spitzen, einen geeigneten Abfallbehälter, einen Nephi, TER und einen Wirbel. Sobald die Haube vorbereitet ist, legen Sie den Organismus auf das Papiertuch zusammen mit einem Gestell mit einer McFarland 0,5 Standard A Sieben-H-Neun-Brühe mit OADC und einem Kochsalzperlenröhrchen. Dieser Aufbau erfolgt aus massivem, mittlerem Material.

Bereiten Sie das Inokulum aus einer festen Medienkultur aus einer Patientenprobe vor. Kratzen Sie die Kolonien mit einer sterilen Schlaufe ab und geben Sie sie in das Kochsalz-Tween-Glasperlenröhrchen. Wirbeln Sie die Suspension 30 bis 60 Sekunden lang ein.

Führen Sie eine Sichtprüfung der Probe durch und vergleichen Sie sie mit dem McFarland-Standard. Der überwiesene Betrag sollte gleich oder größer als der Standard sein. Wenn nicht, fügen Sie mehr von der Bakterienprobe hinzu und wirbeln Sie sie ein. Wieder.

Sobald der McFarland-Standard erreicht ist, lassen Sie das Inokulum 15 Minuten lang ruhen, damit sich größere Bakterienklumpen ansiedeln können. Verwenden Sie als Nächstes einen nefi TER, um die Dichte der suspendierten Bakterien auf Null zu messen. Der Nephi ter.

Setzen Sie zuerst ein leeres Kochsalzperlen-Tween-Röhrchen in den Nephi ter ein. Drücken Sie die Kalibriertaste, um das Gerät auf Null zu stellen, setzen Sie dann den McFarland 0,5 Standard in den Nephi ter ein und drücken Sie die Kalibrierungstaste erneut. Sobald das Gerät kalibriert ist, entfernen Sie den McFarland-Standard und setzen Sie das Inokulum ein.

Der Inokulumwert sollte dem McFarland-Standardwert entsprechen. Wenn der Messwert zu niedrig ist, entfernen Sie das Röhrchen und übertragen Sie mehr Bakterien von der Platte. Dann vortexen und die Probe erneut ablesen.

Wenn der Messwert zu hoch ist, fügen Sie dem Röhrchenwirbel Kochsalzlösung hinzu. Lesen Sie dann das Beispiel noch einmal. Fahren Sie mit der Anpassung des Inokulums nach Bedarf fort, bis die Konzentration der Bakterien dem McFarland-Standard entspricht.

Verwenden Sie anschließend eine 200-Mikroliter-Pipette und eine lange, aerosolbeständige Pipettenspitze, um 100 Mikroliter Inokulum aus dem oberen Drittel des Röhrchens zu entfernen. Um Klumpen zu vermeiden, die sich am Boden absetzen, impfen Sie, die Middlebrook Seven H Nine Bouillon die inokulierte Brühe langsam 20 Sekunden lang durchwirbeln, um das Inokulum zu plattieren. Beginnen Sie damit, die Mikrotiterplatte aus der Verpackung des Herstellers zu entfernen. Wenn das Trockenmittel blau ist oder die Folienverpackung beschädigt ist, verwenden Sie es nicht.

Die Platte enthält bereits die 12 antimikrobiellen Mittel, die in jeder Vertiefung getestet werden sollen, einschließlich der wirksamsten oder Erstlinienmedikamente und der Zweitlinienmedikamente. Gießen Sie das Sieben-H-Neun-Brühe-Inokulum vorsichtig in eine Brühe, wobei Sie darauf achten, dass keine Aerosole entstehen. Platzieren Sie dann die Mikrotiterplatte mit dem Etikett nach außen, wie hier gezeigt, und geben Sie mit einer 12-Kanal-Pipette 100 Mikroliter des Inokulums in jede Vertiefung.

Bereiten Sie als Nächstes Platten für die Durchführung von Koloniezählungen vor. Bereiten Sie zunächst eine unverdünnte Platte vor, indem Sie eine Ein-Mikroliter-Probenschlaufe aus der Positivkontrollvertiefung auf die eins-zu-eins-beschriftete Sieben-H10-Platte übertragen. Verwende dann die Schlaufe, um die Platte wie hier gezeigt zu streifen.

Um eine Verdünnung von eins bis 50 vorzubereiten, übertragen Sie als Nächstes eine Ein-Mikroliter-Schleife aus der Positivkontrollvertiefung und schwenken Sie sie in das Röhrchen mit 50 Mikrolitern Wasserstreifen. Ein Mikroliter dieser Verdünnung auf der Platte mit der Aufschrift eins bis 50. Impfen Sie die Reinheitsplatten, indem Sie 50 Mikroliter des Inokulums aus dem Inokulum auf entsprechend markierten Blutagar und sieben H 10-Platten pipettieren und zur Isolierung streifen.

Stapeln Sie dann ein weiteres Trth auf die geimpften Trth und legen Sie sie vorsichtig in den Entwurfbehälter. Legen Sie ein Klebesiegel auf die Mikrotiterplatte. Drücken Sie dann mit der weißen Unterlage fest auf jede Vertiefung, um eine ausreichende Decke zu gewährleisten und sicherzustellen, dass keine Falten entstehen.

Desinfizieren Sie die Mikrotiterplatte, indem Sie sie mit einem Papiertuch abwischen, das mit einem tuberkulösen Desinfektionsmittel getränkt ist. Legen Sie dann die Mikrotiterplatte in eine Plastiktüte und verschließen Sie diese mit einem Heißsiegel. Desinfizieren Sie abschließend alle Materialien, einschließlich des Nephi, des Lter-Wirbels, der Platten und Röhren, indem Sie sie mit einem tuberkulösen ziden Desinfektionsmittel abwischen.

Hier wird Pro Spray verwendet, nachdem genügend Zeit vergangen ist, um die Desinfektion zu gewährleisten. 15 Minuten für Pro Spray. Die Platten werden mit Klebeband in Plastiktüten verklebt und versiegelte Vorräte aus der Biosicherheitswerkbank entnommen und in den Durchgang gelegt.

Der weggeworfene rote Beutel wird an dieser Stelle verschlossen und mit einem Kabelbinder versiegelt, wobei das Kleid, die Stiefeletten und die Handschuhe entfernt wurden. Nachdem Sie in den Vorraum gegangen sind und sich die Hände gewaschen haben, entfernen Sie die Atemschutzmaske und desinfizieren und bewahren Sie sie nach dem erneuten Händewaschen auf, ziehen Sie einen frischen Kittel an und verlassen Sie die BSL three suite. Als nächstes wird der Verwerfungsbehälter autoklaviert.

Anschließend inkubieren Sie die Mikrotiterplatte und die sieben H 10- und Blutschneckenplatten mit der rechten Seite nach oben in den 35 bis 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit fünf bis 10 % CO2 im Labor von BSL two. Dies ist akzeptabel, da die Platte gut verschlossen ist und sich in einer Plastiktüte befindet, Mycobacterium tuberculosis Entstehungszeit beträgt etwa 12 bis 24 Stunden, so dass es mindestens eine Woche dauern wird, bis das Wachstum als Bildung eines Zellpellets am Boden der Kontrolle gesehen werden kann. Nun, an Tag 10 führen Sie eine manuelle Spiegellesung durch, indem Sie die versiegelte ST-Mikrotiterklinge auf die Plattform des Spiegelkastens legen.

Verwenden Sie eine Schreibtischlampe, um das Wachstum zu visualisieren, und passen Sie es nach Bedarf an, um den besten Kontrast zu erzielen. Überprüfen Sie in diesem Fall die Vertiefungen zur Wachstumskontrolle, H 11 und H 12, indem Sie in den Spiegel schauen. Wenn es Wachstum gibt, erscheint das Bohrloch trüb oder scheint Sedimente zu haben, wie hier gezeigt.

Wenn es kein Wachstum gibt, wie in diesem Beispiel gezeigt, scheint das Bohrloch klar zu sein. Legen Sie in diesem Fall die Platte wieder in den Inkubator und inkubieren Sie bis zu 21 Tage lang. Vergleichen Sie für jede Bedingung das Wachstum mit dem Steuerelement.

Na dann, für jeden Wirkstoffeintrag die erste Verdünnung, die kein Wachstum hat. Dies ist die minimale Hemmkonzentration oder MHK für das Medikament, um die Ergebnisse mit einem automatisierten Plattenleser wie dem Vision zu untersuchen: Öffnen Sie zunächst die Myco TB, eine ST-Plattensoftware, und protokollieren Sie die versiegelte Platte mit dem Barcode nach außen. Wie hier gezeigt, erscheint das Wachstum als Trübungen oder als Ablagerung von Zellen am Boden einer Vertiefung auf dem Computerbildschirm.

Untersuchen Sie zunächst die Wachstumskontrollen. Wie bisher. Wenn dies negativ für das Wachstum ist, stellen Sie die Platte für bis zu 21 Tage wieder in den Inkubator.

Wenn dies positiv ist, notieren Sie die Ergebnisse, indem Sie die erste Vertiefung berühren, die nicht für jedes Medikament Wachstum auf dem Bildschirm anzeigt. In einigen Fällen fallen Bakterien, Sedimente oder Medikamente auf den Boden des Bohrlochs. Dieses Phänomen, das als Trailing bekannt ist, wird durch mehrere Bohrlöcher mit gleich großen Pellets angezeigt und wird eigentlich nicht als positives Wachstum angesehen.

Anschließend werden die sieben H 10- und Blutagarplatten untersucht, um die Bakterienkonzentrationen zu bestimmen und die Reinheit zu beurteilen. Die Blut-Agar-Platte sollte nach 48 Stunden kein Wachstum zeigen. Das Wachstum auf der Blutagarplatte deutet auf eine Kontamination mit schnell wachsenden Bakterien hin.

Kommt es zu einem Wachstum, muss der Mikrotitertest wiederholt werden. Die sieben H 10 Reinheitsplatte sollte das Wachstum eines Organismus aufweisen. Tuberkulose vom Typ EM sollte gelb, gefärbt, faltig und rau aussehen Wenn sie kontaminiert ist, muss der Mikrotitertest aus einer Reinkultur wiederholt werden.

Um die Bakterienkonzentration zu beurteilen, zählen Sie die Kolonien auf der Sieben-H-10-Platte. Berechnen Sie dann anhand der Tabelle im schriftlichen Begleitdokument die Anzahl der Kolonien. Mycobacterium tuberculosis wurde aus einer Patientenprobe gezüchtet und die Antibiotikaresistenz wurde bewertet, wie in diesem Video beschrieben, in der hier gezeigten Tafel sind 12 verschiedene Medikamente in steigenden Konzentrationen vorhanden, wobei die höchsten Konzentrationen oben und die niedrigsten Konzentrationen unten sind.

Die minimale Hemmkonzentration oder MHK des Arzneimittels wurde durch die niedrigste Konzentration des Arzneimittels angezeigt, die kein Wachstum zeigte und in der hier gezeigten Abbildung unter Verwendung standardisierter Grenzwerte eingekreist ist, die vom Clinical and Laboratory Standards Institute festgelegt wurden. Die hier gezeigten Daten deuten darauf hin, dass dieser TB-Stamm resistent gegen Isid und Rifampicin ist. In vitro deuten die hohen Mikrofonwerte, die in mehreren anderen Arzneimitteln beobachtet werden, darunter Oin, Moxifloxacin, Streptomycin und Rifabutin, auf die Resistenz des EM-Tuberkulosestamms gegen diese Wirkstoffe hin.

Die MHK-Ergebnisse sollten von einem Spezialisten für Infektionskrankheiten, der Erfahrung in der Behandlung von Tuberkulose hat, verwendet werden, um einen individuellen Behandlungsplan zu entwickeln. Sobald diese Technik beherrscht ist, dauert es etwa 40 Minuten, um ein Isolat einzurichten. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass es sich um einen Erreger der Atemwege handelt, und sobald Sie Aerosole erzeugen, sollten Sie nach dem Anschauen dieses Videos ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Mycobacterium tuberculosis einrichten, antimikrobielle Empfindlichkeitstests mit der Mikrobrühe-Verdünnungsmethode. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Mycobacterium tuberculosis äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie Atemschutz sollten immer dort getroffen werden, wo wir benötigt werden.