Aufreinigung von selbstorganisierenden Protein-Nanopartikeln mittels Affinitätschromatographie

Nehmen wir eine Suspension von manipulierten Bakterien, die rekombinante, selbstorganisierende Protein-Nanopartikel mit Polyhistidin-Markierungen exprimieren.

Beschallt, um intrazelluläre Bestandteile freizusetzen.

Zentrifuge zur Auffangung des Überstands, der Protein-Nanopartikel enthält. Verdünnen Sie es mit einem Imidazol-freien Puffer.

Nehmen Sie eine Affinitätschromatographiesäule, die Agarosekügelchen mit immobilisierten Nickelkationen enthält.

Fügen Sie einen Puffer mit einer niedrigen Imidazolkonzentration für die Säulenäquilibrierung hinzu.

Geben Sie das bakterielle Lysat auf die Säule.

Während des Laufs bindet das Polyhistidin auf Protein-Nanopartikeln stark an Nickelkationen.

In der Zwischenzeit binden Verunreinigungen wie bakterielle Lipopolysaccharide und andere Proteine schwach an die Säule.

Mit einem Puffer waschen, der eine niedrige Imidazolkonzentration enthält, um die schwach gebundenen Proteine zu entfernen.

Führen Sie Isopropanol ein, um Lipopolysaccharide zu entfernen, und waschen Sie es dann.

Als nächstes führen Sie einen Puffer mit einer mittleren Imidazolkonzentration ein. Das Imidazol konkurriert mit Histidin um die Bindung an das Nickelkation und setzt gebundene Protein-Nanopartikel frei.

Fügen Sie als Nächstes einen Puffer mit einer hohen Imidazolkonzentration hinzu, um die Proteinnanopartikel vollständig zu eluieren.

Sammeln Sie die gereinigten Protein-Nanopartikel für die weitere Anwendung.

Für die Lyse von geernteten E. coli, die das Sechs-Helix-Bündel SAPN exprimieren, wird eine Sonde mit einer Beschallungsleistung von 150 Watt verwendet, mit vier Sekunden Beschallung und sechs Sekunden Ruhe, um resuspendierte Bakterienpellets in 40 Millilitern Imidazol-freiem Puffer auf Eis für fünf Minuten zu beschallen.

Das zelluläre Lysat wird zentrifugiert, um einen geklärten Überstand zu erzeugen, und der Überstand wird in einen sterilen 150-Milliliter-Kolben überführt. Bringen Sie die Probe dann mit frischem Imidazol-freiem Puffer auf ein Endvolumen von 100 Millilitern.

Um das gewünschte Protein zu isolieren, öffnen Sie die FPLC-Software und klicken Sie auf die Option Neue Methode. Öffnen Sie im Menü Methodeneinstellungen das Dropdown-Menü Spaltenposition, und wählen Sie C1-Port 3 aus. Wählen Sie im Dropdown-Menü "Shown By Technique" die Option "Affinität" aus. Wählen Sie im Dropdown-Menü "Spaltentyp" die Option "Andere", "HisTrap HP" und "fünf Milliliter" aus. Das Spaltenvolumen und die Druckkästen werden automatisch auf die entsprechenden Werte gesetzt.

Klicken Sie auf "Methodengliederung" und ziehen Sie die Schaltflächen "Äquilibrierung" und "Beispielanwendung", die drei Schaltflächen "Spaltenwaschung" und die Taste "Elution" aus dem Einblendmenü "Phasenbibliothek" neben den Pfeil, bevor Sie das Menü "Phasenbibliothek" schließen. Klicken Sie auf Äquilibrierung, und legen Sie die in der Tabelle aufgeführten Werte auf Anfangspuffer B, 4 %, Endpuffer B, 4 % und Spaltenvolumen, 5 fest.

Klicken Sie auf Beispielanwendung. Klicken Sie im Feld Probenbeladung auf das Optionsfeld für Probe auf Säule mit Probenpumpe injizieren und vergewissern Sie sich, dass das Kontrollkästchen neben den Einstellungen für die Durchflussrate aus Methode verwenden in der Probeninjektion aktiviert ist mit System Pump Box. Ändern Sie den Wert des Felds Volumen in 100 Milliliter und das Fraktionssammelschema in Aktivieren.

Deaktivieren Sie das Feld Bruchgröße verwenden in den Methodeneinstellungen, und ändern Sie die Bruchgröße in vier Milliliter. Klicken Sie auf die erste Schaltfläche Column Wash. Legen Sie die in der Tabelle aufgeführten Werte auf Anfangspuffer B, 4 %, Endpuffer B, 4 % und Spaltenvolumen, 10 fest. Klicken Sie auf das Kontrollkästchen Fraktionssammlungsschema aktivieren und deaktivieren Sie die Option Bruchgröße für Methodeneinstellungen verwenden. Ändern Sie die Fraktionsgröße auf vier Milliliter und klicken Sie auf die zweite Schaltfläche Column Wash.

Legen Sie die Werte in der Tabelle auf Anfangspuffer B, 0 %, Endpuffer B, 0 % und Spaltenvolumen, 5 fest. Klicken Sie auf das Kontrollkästchen Fraktionssammlungsschema aktivieren und deaktivieren Sie die Option Bruchgröße in den Methodeneinstellungen verwenden. Ändern Sie die Fraktionsgröße auf 4 Milliliter und klicken Sie auf die Schaltfläche Third Column Wash. Legen Sie die Werte in der Tabelle auf Anfangspuffer B, 0 %, Endpuffer B, 0 % und Spaltenvolumen, 10 fest. Klicken Sie auf die Schaltfläche Fraktionssammlungsschema aktivieren und deaktivieren Sie das Feld Bruchgröße für Methodeneinstellungen verwenden. Ändern Sie dann die Fraktionsgröße auf 4 Milliliter.

Klicken Sie auf die Schaltfläche Elution und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Informationen in der Tabelle. Klicken Sie im Popup-Menü auf "Schritt löschen" und ziehen Sie die Taste "Isokratischer Verlauf" zweimal in die Tabelle, sodass zwei Einträge vorhanden sind. Legen Sie den Wert für den ersten Eintrag auf Anfangspuffer B, 30 %, Endpuffer B, 30 % und Spaltenvolumen, 10 fest.

Legen Sie den Wert für den zweiten Eintrag auf Anfangspuffer B, 100 %, Endpuffer B, 100 % und Spaltenvolumen, 10 fest. Klicken Sie auf die Schaltfläche Fraktionssammlungsschema aktivieren und dann auf das Feld Bruchgröße für Methodeneinstellungen verwenden. Klicken Sie dann auf Speichern unter, und nennen Sie die Datei "Reinigung".

Platzieren Sie den Schlauch der Pumpe A des FPLC in den Imidazol-freien Waschpuffer und den Schlauch der Pumpe B in den 500-Millimolar-Imidazol-Puffer. Legen Sie den Schlauch der Probenpumpe in die 100-Milliliter-Probe und führen Sie das Aufreinigungsprogramm durch. Wenn die 60%ige Isopropanolwäsche erforderlich ist, unterbrechen Sie das Programm, bewegen Sie den Pumpenschlauch von der imidazolfreien Waschanlage in die 60%ige Isopropanolwäsche und starten Sie das Programm neu. Halten Sie das Programm am Ende des Waschvorgangs erneut an, führen Sie den Schlauch der Pumpe A wieder in den imidazolfreien Waschpuffer ein und starten Sie das Reinigungsprogramm neu.