Name: Auswahl der Plasmodium falciparum Parasiten für Cytoadhesion zu Human Brain Endothelial Cells (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Erfahren Sie die Selektion von Plasmodium falciparum für die Bindung an humane Gehirnendothelzellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung zerebraler Malaria-Mechanismen und potenzieller Therapieansätze.

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Wir danken Francisco Candal, CDC Technology Transfer Office, Atlanta Georgia für HBEC-5i-Zellen. Diese Arbeit wurde von den Wellcome Trust (4 Jahre Doktorandenstelle an AC-und Senior Fellowship in Basic Biomedical Science to JAR, Grant-Nummer 084226) gefördert.

Allgemeine Empfehlungen Menschliches Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen (HBEC-5i) Kultur wurde bereits in 6 beschrieben, 8. P. falciparum Parasiten wurden in 9 kultiviert. Beide HBEC-5i und P. falciparum Parasiten Kulturen sollten in sterile Bedingungen zu jeder Zeit eingehalten werden. Alle Reagenzien sollten bei 37 ° C vorgewärmt werden Wir empfehlen, regelmäßig auf Mykoplasmen-Kontaminationen 10 durch PCR (Minevera Biolabs, folgt den Anweisungen des Herstellers) zu überprüfen. Das Protokoll ist in Abbildung 1 zusammengefasst. 1. Endothelzellen Routine Kultur <ol><li> Bereiten Sie die notwendigen Reagenzien. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Medium zur Vorbereitung </td><td> Reagenzien </td><td> Menge </td></tr><tr><td> "DMEM unvollständig" </td><td> DMEM-F12 Ham </td><td> 500ml </td></tr><tr><td> &amp;nbsp; </td><td> L-Glutamin 200 mM </td><td> 5ml </td></tr><tr><td></td><td> Penicillin / Streptomycin 100X </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td></td><td> NaOH 1M </td><td> 1,3 ml (pH-Wert auf 7,4) </td></tr><tr><td> "DMEM complete" </td><td> "DMEM unvollständig" </td><td> 450ml </td></tr><tr><td></td><td> Fetale Bovine Serum hitzeinaktiviertem </td><td> 50ml </td></tr><tr><td></td><td> Endothelzellwachstum ergänzen </td><td> 5 ml </td></tr></tbody></table> <ol start="2"><li> Kultur HBEC-5i in einem belüfteten 25cm 2-Kolben mit 10ml DMEM Vollmedium in einem 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2. </li><li> Passage-Zellen, wenn sie konfluent geworden. Entfernen Sie das alte Medium abgesaugt und waschen zweimal mit DMEM unvollständige mittel-oder Gewebekulturen grade PBS (Ca 2 + und Mg 2 + frei) bis 37 vorgewärmten ° C. </li><li> Add 1 ml vorgewärmten VersuchenPSIN-EDTA (0,025% Trypsin, 0,5 mM EDTA), schwenken, um die Gesamtheit der Kolben abdecken und inkubieren ~ 2 min bei 37 ° C. </li><li> Überprüfen Sie unter inversen Mikroskop, dass mindestens 90% der Zellen wurden abgelöst. Wenn nötig, vorsichtig klopfen den Boden des Kolbens auf adhärente Zellen zu entfernen. Fügen Sie 10 ml DMEM Vollmedium, um das Trypsin und Transfer Zellen in eine 15 ml konische Röhrchen zu blockieren. Zentrifuge für 4 min bei 300 g bei Raumtemperatur (RT). </li><li> Überstand verwerfen und das Pellet mit 10 ml DMEM Vollmedium. Pipette die Lösung nach oben und unten gründlich resuspendieren. </li><li> Fügen Sie 1 oder 2 ml der Zellsuspension in eine neue Kultur einwiegen und 8ml frischem Medium, um die Kultur aufrecht zu erhalten. Bewerten Kultur Wachstum jeden Tag unter einem inversen Mikroskop und ändern Medium alle 2 oder 3 Tage, bevor es gelb wird. </li></ol> 2. Vorbereitung Endothelzellen für eine Auswahl <ol><li> Zwei Tage vor dem Tag der selectio n, fügen Fibronektin in sterile PBS (2 g / cm 2) in einem (oder mehreren) 60 mm Petrischale verdünnt. Inkubieren Sie die Schale für 5 bis 20 min bei 37 ° C, dann entfernen Sie die Fibronektin-Lösung, die bei 4 ° C für einen Monat gespeichert werden und wieder einmal verwendet. </li><li> Passage-Zellen wie in den Abschnitten 1.3 beschrieben. bis 1,5. Unter der Annahme, 100% konfluenten Zellen getrennt wurden und erneut in 10ml DMEM Vollmedium (Abschnitt 1.6., Mit einem äquivalenten Volumen Medium resuspendieren, wenn der Konfluenz niedriger ist, z. B. mit 8ml resuspendieren, wenn der Konfluenz betrug 80%), fügen Sie 1,5 ml der suspendierten Zellen, die Fibronektin beschichtete Petrischale und anderen 1,5 ml DMEM Vollmedium. </li><li> Legen Sie die Samen Petrischale in den Brutschrank. Hinweis: Im Idealfall sollte die Konfluenz werden rund 90% zum Zeitpunkt der Auswahl zwei Tage später. </li><li> Optional. So aktivieren Sie HBEC-5i, fügen Sie die TNF (Tumor Nekrose Faktor) Zytokin in einer Endkonzentration von 50μg/ml 24 Stunden vor der Wahl. </li></ol>e_title "&gt; 3. Plasmodium falciparum Routine Kultur <ol><li> Bereiten Sie die notwendigen Reagenzien (siehe Tabelle hier unter). Bereiten menschlichen roten Blutzellen (RBC) durch die Trennung von Vollblut (Gruppe O +) beim Durchgang durch ein Leukozytendepletionsfilter (siehe "Methoden in Malaria Research" Publikation 11 für allgemeine Malaria-Parasiten Kultivierung). Wash RBC zweimal durch Zentrifugieren bei 400 g für 5 min und Resuspendieren sie mit 10 ml RPMI unvollständig. Keep gewaschen RBC bei 4 ° C zu einer unvollständigen Medium bei 50% Hämatokrit. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Medium zur Vorbereitung </td><td> Reagenzien </td><td> Menge </td></tr><tr><td> "RPMI unvollständig" </td><td> RPMI 1640 (mit Bicarbonat) </td><td> 500ml </td></tr><tr><td></td><td> Hepes 1M </td><td> 12.5ml </td></tr><tr><td></td><td> Glucose 20% </td><td> 5ml </td></tr><tr><td></td> L-Glutamin 200 mM <td> 5ml </td></tr><tr><td></td><td> Gentamycin 50mg/ml </td><td> 250μl </td></tr><tr><td></td><td> NaOH 1M </td><td> 0,7 ml (pH-Wert auf 7,2) </td></tr><tr><td> "RPMI komplett" </td><td> "RPMI unvollständig" </td><td> 450ml </td></tr><tr><td></td><td> Pooled Menschen (nicht-immunen) Serum </td><td> 50ml </td></tr></tbody></table> <ol start="2"><li> Kultur P. falciparum infiziert RBC mit RPMI Vollmedium mit 2% Hämatokrit und bei 37 ° C mit 3% CO 2, 1% O 2, und 96% N 2. Machen Giemsa Abstrich 11 tägliche auf die Stufe der Entwicklung des Parasiten (Abbildung 2) zu beurteilen. </li><li> Regelmäßig (ca. einmal pro Woche) zu synchronisieren Kultur durch Sorbit Behandlung 12. Am Tag vor der Wahl Assay Ziel für einen Ring-Bühne Kultur bei 5% Parasitämie oder mehr (im Idealfall mindestens 10%). </li></ol> 4. Auswahl von P. falciparum für cytoadhesion an Endothelzellen <ol><li> Am Tag des Tests sollte der Parasit Kultur pigmentierte Trophozoiten Stufe (Abbildung 2) (im Idealfall 10% Parasitämie), während HBEC-5i Kultur sollte bei 50 bis 100% Konfluenz (im Idealfall 90%). 30μl Hämatokrits von Parasiten Kultur pro HBEC-5i Petrischale benötigt. </li><li> Wash Parasiten zweimal durch Zentrifugieren (500 g für 5 min) 1,5 ml der Parasit Kultur. Überstand und resuspendieren mit 10 ml frisch zubereitet, erwärmt, DMEM unvollständige Medium. Wiederholen Sie die Wäsche ein zweites Mal. Resuspendieren 30μl Hämatokrits mit 1,5 ml DMEM unvollständig mit 1% BSA. </li><li> Waschen Sie die HBEC-5i beschichtete Petrischale zweimal Absaugen Medium und das Hinzufügen von 3 ml DMEM unvollständig. </li><li> Fügen Sie die Lösung von Parasiten, die HBEC-5i Gericht und bei 37 ° C für 75min. Resuspendieren Parasiten zweimal (nach 30 und 60 min) während der Inkubationdurch vorsichtiges Schwenken der Schale in die vier Richtungen, sowie im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn. </li><li> Nach der Inkubation der Schale 5-mal durch Absaugen Medium, mit einem Kunststoff-Pasteurpipette bis 3 ml warmem DMEM unvollständige mittlere und sanfte Schaukeln hinzuzufügen. Wenn viele Gerichte benutzt werden, halten sie an einem warmen Oberfläche, wie eine große Flasche mit Wasser bei 37 ° C gefüllt </li><li> Überprüfen Sie die Teller unter einem inversen Mikroskop. Wenn viele infizierte RBC noch sichtbar sind, nicht mehr wäscht, wie oben beschrieben. Handle der Petrischale sehr sorgfältig, um das Risiko einer Kontamination zu vermeiden. </li><li> Entfernen Sie Medium aus der Schüssel und fügen 3ml warmes RPMI Vollmedium mit 40 ul Hämatokrits von frischen uRBC. </li><li> Die Schale in einer luftdichten Kammer inkubiert, Gas für 3 min und Ort der Kammer in einem Brutschrank bei 37 ° C über Nacht. </li><li> Am Tag danach Ernte der Parasiten durch Waschen mit RPMI unvollständige Medium, in ähnlicher Weise wie in Abschnitt 4.4 beschrieben. aber stärker. Keep alle verwendeten Medium (mit resuspendiert RBC) in einer 15 ml konische Röhrchen. Überprüfen Sie unter inversen Mikroskop, dass alle RBC aus der Schale entfernt worden sind. </li><li> Pellet der Parasiten, den Überstand verwerfen, in 5ml RPMI Vollmedium und legen Sie die Mischung in einer Flasche für die normale Züchtung resuspendieren. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Nicht ausgewählte Parasiten zeigen eine geringe Bindung an HBEC-5i (Abbildung 3A). So wird nach der ersten Runde der Auswahl wird nur sehr wenige Parasiten geerntet und es kann bis zu einem Monat der Kultivierung einer Parasitämie ausreichend für die zweite Auswahlrunde erreichen. Nach jeder Runde der Selektion, binden mehr und mehr Parasiten auf die Endothelzellen und die Auswahl kann in kürzeren Zeitabständen wiederholt werden. Nach 4-5 Runden der Selektion, sind High-Bindung Parasitenpopulation erhalten (Abbildung 3). In unseren Händen, wurde die Bindung von HB3-HBEC zu HBEC-5i oder TNF aktiviert HBEC-5i von simIlar Ebene (Daten nicht gezeigt). Die hier beschriebene Protokoll wurde mit 4 P. getestet falciparum-Stämme: HB3, IT/FCR3, 3D7 und Dd2 (Tabelle 1). Nur die letztere erwies sich nicht in der Lage zu HBEC-5i zu binden, auch nach 5 Runden der Selektion. HB3 Parasiten wurden auch für cytoadherence Human Dermal und pulmonale mikrovaskuläre Endothelzellen (HDMEC und HPMEC) ausgewählt. Nach 4 Runden der Selektion, mit der hier beschriebenen Methode wurde eine High-Bindung der Bevölkerung auf beiden HDMEC und HPMEC (Abbildung 4). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3122/3122fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Überblick über den Auswahlprozess. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3122/3122fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Entwicklungsstadien von P. falciparum infiziert rote Blutkörperchen. Giemsa-Abstrich unter dem Mikroskop sichtbar zu 1000x Vergrößerung. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3122/3122fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Typisches Beispiel von Parasiten Bindung an HBEC-5i. (A) Die blaue Schicht ist HBEC-5i fixiert mit Glutaraldehyd und mit Giemsa, visualisiert unter dem Mikroskop bei 1000facher Vergrößerung. Die Bilder wurden aufgenommen, nachdem uRBC und ungebundenen iRBC weggespült wurden. Die linke Tafel zeigt ein einzelnes P. falciparum HB3 (nicht ausgewählt) Parasit HBEC-5i gebunden. Im rechten Bereich der HB3-HBEC Parasiten hatten für 5 Runden ausgewählt worden. (B) Daten stellt den Mittelwert aus zwei unabhängigen Experimenten, die jeweils doppelt durchgeführt. Die Zahl der Parasiten pro Endothelzellen gebunden wurde gezählt. <img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/3122/3122table1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabelle 1"> Tabelle 1. Zusammenfassung von Plasmodium falciparum-Stämme, die erfolgreich für die Bindung an HBEC-5i. Beachten Sie, dass HB3 auch auf TNF-aktivierten HB ausgewählt wurden ausgewähltEC-5i. Nach 5 Runden der Selektion zeigten die Dd2 Belastung keine Zunahme der Bindung an HBEC-5i im Vergleich zu unselektierten-Dd2. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3122/3122fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Bindung von P. falciparum HB3 Parasiten dermal (HDMEC) und Lungenembolien (HPMEC) Endothelzellen, vor und nach 4 Runden der Selektion. Obwohl der Nährboden für HDMEC und HPMEC leicht unterscheidet (siehe Anweisungen des Herstellers), wurde das Protokoll für die Auswahl identisch mit HBEC-5i. Pictures at 400-facher Vergrößerung aufgenommen. <table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> DMEM-F12 Ham </td><td> Sigma </td><td> D6421 </td><td> Für DMEM Vollmedium </td></tr><tr><td> L-Glutamin 200 mM </td><td>GIBCO </td><td> 25030 </td><td> Für DMEM und RPMI Vollmedium </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin 100X (10000 units / ml und 10mg/ml) </td><td> ScienCell </td><td> 0503 </td><td> Für DMEM Vollmedium </td></tr><tr><td> Fetale Bovine Serum hitzeinaktiviertem </td><td> ScienCell </td><td> 0025 </td><td> Für DMEM Vollmedium </td></tr><tr><td> Trypsin-EDTA (0,025% Trypsin, 0,5 mM EDTA) </td><td> ScienCell </td><td> 0103 </td><td></td></tr><tr><td> Endothelzellwachstum ergänzen </td><td> ScienCell </td><td> 1052 </td><td> Für DMEM Vollmedium </td></tr><tr><td> Gewebekultur behandelt 60 mm X 15 mm Petrischalen </td><td> BD </td><td> 353002 </td><td></td></tr><tr><td> Humanem Fibronectin </td><td> Millipore </td><td> FC010 </td><td> Verwenden Sie bei 2 g / cm 2 </td></tr><tr><td> TNF </td><td> R &amp;D Systems </td><td> 210-TA </td><td> optional, bei 50 pg / ml Einsatz </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-167f </td><td> Für RPMI Vollmedium </td></tr><tr><td> Gentamycin 50mg/ml </td><td> Lonza </td><td> 17-518Z </td><td> Für RPMI Vollmedium </td></tr><tr><td> Hepes 1M </td><td> Lonza </td><td> BE17-737E </td><td> Für RPMI Vollmedium </td></tr><tr><td> HDMEC </td><td> ScienCell </td><td> 2000 </td><td> Primary-Zelllinie </td></tr><tr><td> HPMEC </td><td> ScienCell </td><td> 3000 </td><td> Primary-Zelllinie </td></tr><tr><td> HBEC-5i </td><td></td><td></td><td> Gewonnen aus Francisco Candal (fcandal@cdc.gov) </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Materials

<ol><li>Scherf, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+variation+in+malaria%3A+in+situ+switching%2C+relaxed+and+mutually+exclusive+transcription+of+var+genes+during+intra-erythrocytic+development+in+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Antigenic variation in malaria: in situ switching, relaxed and mutually exclusive transcription of var genes during intra-erythrocytic development in Plasmodium falciparum.</a> Embo. J. 17, 5418-5426 (1998).</li>
<li>MacPherson, G. G., Warrell, M. J., White, N. J., Looareesuwan, S., Warrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cerebral+malaria.+A+quantitative+ultrastructural+analysis+of+parasitized+erythrocyte+sequestration%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Human cerebral malaria. A quantitative ultrastructural analysis of parasitized erythrocyte sequestration.</a> Am. J. Pathol. 119, 385-401 (1985).</li>
<li>Seydel, K. B., Milner, D. A., Kamiza, S. B., Molyneux, M. E., Taylor, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+and+intensity+of+parasite+sequestration+in+comatose+Malawian+children%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">The distribution and intensity of parasite sequestration in comatose Malawian children.</a> J. Infect. Dis. 194, 208-208 (2006).</li>
<li>Taylor, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiating+the+pathologies+of+cerebral+malaria+by+postmortem+parasite+counts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Differentiating the pathologies of cerebral malaria by postmortem parasite counts.</a> Nat. Med. 10, 143-145 (2004).</li>
<li>van der Heyde, H. C., Nolan, J., Combes, V., Gramaglia, I., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unified+hypothesis+for+the+genesis+of+cerebral+malaria%3A+sequestration%2C+inflammation+and+hemostasis+leading+to+microcirculatory+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">A unified hypothesis for the genesis of cerebral malaria: sequestration, inflammation and hemostasis leading to microcirculatory dysfunction.</a> Trends. Parasitol. 22, 503-508 (2006).</li>
<li>Dorovini-Zis, K., Prameya, R., Bowman, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+characterization+of+microvascular+endothelial+cells+derived+from+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Culture and characterization of microvascular endothelial cells derived from human brain.</a> Lab. Invest. 64, 425-436 (1991).</li>
<li>Rowe, J. A., Claessens, A., Corrigan, R. A., Arman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+to+human+cells%3A+molecular+mechanisms+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+reviews+in+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Adhesion of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes to human cells: molecular mechanisms and therapeutic implications.</a> Expert reviews in molecular medicine. 11, e16-e16 (2009).</li>
<li>Xiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum%3A+involvement+of+additional+receptors+in+the+cytoadherence+of+infected+erythrocytes+to+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum: involvement of additional receptors in the cytoadherence of infected erythrocytes to microvascular endothelial cells.</a> Exp. Parasitol. 84, 42-55 (1996).</li>
<li>Corrigan, R. A., Rowe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+variation+in+early+innate+cytokine+induction+by+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Strain variation in early innate cytokine induction by Plasmodium falciparum.</a> Parasite. Immunol. 32, 512-527 (2010).</li>
<li>Rowe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+mycoplasma+contamination+in+Plasmodium+falciparum+cultures+and+methods+for+its+detection+and+eradication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Implications of mycoplasma contamination in Plasmodium falciparum cultures and methods for its detection and eradication.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 92, 177-180 (1998).</li>
<li>Moll, K., Ljungström, I., Perlmann, H., Scherf, A., Wahlgren, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoll%2C+K+%22Methods+in+Malaria+Research%22">Methods in Malaria Research</a>. , MR4/ATCC. (2009).</li>
<li>Lambros, C., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> J. Parasitol. 65, 418-420 (1979).</li>
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<li>Nakamura, K., Hasler, T., Morehead, K., Howard, R. J., Aikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum-infected+erythrocyte+receptor%28s%29+for+CD36+and+thrombospondin+are+restricted+to+knobs+on+the+erythrocyte+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum-infected erythrocyte receptor(s) for CD36 and thrombospondin are restricted to knobs on the erythrocyte surface.</a> J. Histochem. Cytochem. 40, 1419-1422 (1992).</li>
<li>Wassmer, S. C., Cianciolo, G. J., Combes, V., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LMP-420%2C+a+new+therapeutic+approach+for+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Sci.+%28Paris%29%22%5BJournal%5D)">LMP-420, a new therapeutic approach for cerebral malaria.</a> Med. Sci. (Paris). 22, 343-345 (2006).</li>
<li>Wassmer, S. C., Combes, V., Candal, F. J., Juhan-Vague, I., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+potentiate+brain+endothelial+alterations+induced+by+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Platelets potentiate brain endothelial alterations induced by Plasmodium falciparum.</a> Infect. Immun. 74, 645-653 (2006).</li>
</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Das Markenzeichen von zerebraler Malaria ist die Beschlagnahme von P. falciparum iRBC innerhalb des Gehirns Mikrovaskulatur 2, 3. Doch in vitro-Kulturen von P. falciparum nur schlecht cytoadhere zu HBEC-5i, ein Modell für menschliche Gehirn mikrovaskulären Endothel. Hier entwickelten wir eine einfache Assay einer Bevölkerung für die Bindung an HBEC-5i, eine &quot;in-vivo wie&quot; Phänotyp zu bereichern. Drei von 4 P. falciparum-Stämme wurden erfolgreich gewählt mit dieser Methode. Darüber hinaus wurde HB3 auch auf HDMEC und HPMEC ausgewählt, was darauf hinweist, dass dieses Protokoll für verschiedene Parasiten und endothelialen Zelltypen verwendet werden kann. Verschiedene Hypothesen können erklären die mangelnde Bindung mit dem Dd2 Belastung. Die wahrscheinlichste ist die Tatsache, dass dieser Parasit line knobless ist, die tief behindert die cytoadherence 13, 14. Wir empfehlen Kultivierung unselected Parasiten neben der Auswahl proZugang zu einem Steuerelement zum Vergleich bieten. Dies ermöglicht zum Beispiel den Vergleich der Transkriptom von verbindlichen und unverbindlichen Parasiten, mit der Hoffnung, Parasiten Ligand Kandidaten. TNF ist ein Zytokin, auf hohem Niveau in der zerebralen Malaria-Patienten gefunden und wurde zu zeigen, die Expression vieler Oberflächenproteine ​​HBEC-5i (Claessens et al, in Vorbereitung und 8, 15, 16) zu induzieren. In diesem Fall war die Menge an gebundenem iRBC ähnlich im normalen HBEC-5i im Vergleich zu aktivierten HBEC-5i. Diese &quot;Sequestrierung Modell&quot; kann auch verwendet werden, um die molekulare Wechselwirkung zwischen den iRBC und Endothelzellen, sowie die Wirkung der vermeintlichen Anti-cytoadherence Drogen zu untersuchen. In diesem Fall empfehlen wir plating HBEC-5i in kleineren Brunnen, wie &quot;8-Well-Kammer-Objektträgern&quot; (BD 354628) oder &quot;CultureWell&quot; (Sigma C7735-20EA).

auswahl der plasmodium falciparum parasiten für cytoadhesion zu human brain endothelial cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Die meisten menschlichen Malaria-Todesfälle werden durch Blut-Bühne Plasmodium falciparum Parasiten verursacht werden. Zerebrale Malaria, die meisten lebensbedrohliche Komplikation der Erkrankung ist durch eine Anhäufung von Plasmodium falciparum infiziert rote Blutkörperchen (iRBC) bei pigmentierten Trophozoiten Stufe in der Mikrovaskulatur des Gehirns 2-4 aus. Diese microvessel Obstruktion (Sequestrierung) führt zu Azidose, Hypoxie und schädliche inflammatorischen Zytokinen (reviewed in 5). Sequestration ist auch in den meisten mikrovaskulären Gewebe des menschlichen Körpers 2, 3 gefunden. Der Mechanismus, durch den iRBC die Wände der Blutgefäße anzubringen ist noch weitgehend unverstanden. Die immortalisierten Human Brain mikrovaskulären Endothel-Zelllinie (HBEC-5i) wurde als ein in vitro Modell der Blut-Hirn-Barriere 6 verwendet worden. Allerdings Plasmodium falciparum iRBC nur schlecht anbringen, um HBEC-5i in vitro, im Gegensatz zu den dichten sequestratIon, das in der zerebralen Malaria-Fälle auftritt. Wir haben deshalb eine Panning-Assay (bereichern) verschiedene P. wählen falciparum-Stämme für die Haftung auf HBEC-5i, um Populationen von High-bindenden Parasiten, repräsentativer, was in vivo zu erhalten. Eine Probe von einem Parasiten Kultur (Mischung aus iRBC und nicht infizierten Erythrozyten) an der pigmentierten Trophozoiten Bühne wird gewaschen und auf einer Schicht aus HBEC-5i auf einer Petrischale gezüchtet inkubiert. Nach der Inkubation wird die Schale vorsichtig gewaschen frei von uRBC und ungebundenen iRBC. Frische uRBC sind die wenigen iRBC an HBEC-5i und über Nacht inkubiert aufgenommen. Als Schizonten Parasiten platzen, Merozoiten reinvade RBC und diese Ring-Parasiten geerntet werden am folgenden Tag. Parasiten sind kultiviert, bis genug Material erhalten (in der Regel 2 bis 4 Wochen) und eine neue Runde der Selektion durchgeführt werden kann. Abhängig von der P. falciparum, 4 bis 7 Runden der Selektion sind erforderlich, um eine Bevölkerung zu bekommenwo die meisten Parasiten binden HBEC-5i. Die Bindung Phänotyp ist progressiv nach ein paar Wochen verloren, was auf einen Schalter in der Variante Oberflächenantigen Genexpression, also regelmäßige Auswahl an HBEC-5i erforderlich ist, um den Phänotyp zu erhalten. Zusammenfassend haben wir eine Auswahl Assay Rendering P. falciparum Parasiten eine &quot;zerebrale Malaria Klebstoff&quot; Phänotyp. Wir konnten 3 Wählen Sie aus 4 P. falciparum-Stämme auf HBEC-5i. Dieser Test hat sich auch erfolgreich verwendet worden, um Parasiten für die Bindung an menschliche Haut-und Lungenerkrankungen Endothelzellen zu wählen. Wichtig ist, dass diese Methode verwendet, um Gewebe-spezifischen Parasiten Populationen zu wählen, um Kandidaten Parasiten Liganden für die Bindung an Gehirn Endothel zu identifizieren. Darüber hinaus kann dieser Test zum Screening auf putative anti-Sequestrierung Drogen 7 verwendet werden.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell für zerebrale Malaria-Sequestrierung wird beschrieben<sup&gt; 1</sup&gt;.<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Infizierten roten Blutkörperchen sind für die Bindung an verewigt menschliche Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen aktiviert. Die ausgewählten Parasiten zeigen eine deutliche Phänotyp. Die Auswahl kann mit verschiedenen werden<em&gt; P. falciparum</em&gt; Stämme und endothelialen Zell-Linien.

Auswahl der Plasmodium falciparum Parasiten für Cytoadhesion zu Human Brain Endothelial Cells

Die meisten Todesfälle durch Malaria beim Menschen werden durch Plasmodium falciparum-Parasiten im Blutstadium verursacht. Die zerebrale Malaria, die lebensbedrohlichste Komplikation der ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Plasmodium, fpar und Parasiten für die Bindung an humane Gehirnendothelzellen auszuwählen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Kultur aus Plasmodium, fpar und Parasiten, die eine Mischung aus infizierten und nicht infizierten roten Blutkörperchen enthält, mit einer Schicht aus humanen Gehirnendothelzellen inkubiert wird. Im nächsten Schritt werden nicht infizierte und nicht gebundene rote Blutkörperchen durch mehrfaches Waschen mit Kulturmedium abgewaschen. Anschließend werden frische rote Blutkörperchen hinzugefügt, um das weitere Wachstum der Parasitenpopulation zu ermöglichen.Der letzte Schritt einige Wochen später besteht darin, die Gesamtauswahl zu wiederholen, sobald eine ausreichende Parasitenanzahl erreicht ist. Letztendlich wird mittels Mikroskopie gezeigt, dass eine hohe Anzahl von Parasiten an HBE fünf i gebunden ist. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der zerebralen Malaria zu beantworten, beispielsweise die Identifizierung von Parasitenliganden oder Wirtszellrezeptormolekülen, die am Cyto-Endurance-Prozess beteiligt sind.Bereiten Sie humane rote Blutkörperchen aus Vollblut der Gruppe O positiv vor, indem Sie die roten Blutkörperchen durch eine Leukozyten-Depletionsfilterung von den weißen Blutkörperchen trennen. Zentrifugieren Sie die Zellen 10 Minuten bei 1000 G und resuspendieren Sie das Pellet in vollständigem PMI-Incomplete-Medium.Wiederholen Sie diesen Waschschritt noch einmal und resuspendieren Sie anschließend das Pellet. In unserem PMI-unvollständigen Medium bei 50 % Hämatokrit werden rote Blutkörperchen eine Woche lang bei vier Grad Celsius gelagert. Kultivieren Sie Odium Valspar-infizierte rote Blutkörperchen.Mit RPMI-Vollmedium bei 2 % Hämatokrit und Inkubation bei 37 °C mit 3 % Kohlendioxid, 1 % Sauerstoff und 96 % Stickstoff täglich. Einen Dünndarmabstrich herstellen, um den Entwicklungsstand der Parasiten zu beurteilen. Das Medium täglich wechseln, indem die Kultur fünf Minuten lang bei 500 × g zentrifugiert wird.Das Überstand entfernen und etwa einmal pro Woche frisches komplettes RPMI-Medium hinzufügen. Die Parasiten durch Behandlung mit wässriger 5 %iger Sorbitollösung synchronisieren. Der Selektionsassay kann am Tag nach einer Kultur im Ringstadium durchgeführt werden, wenn mindestens 5–10 % Parasitämie beobachtet wird.Zusätzlich wird genügend Parasitenkultur benötigt, um pro 60-Millimeter-Schale mit HBE5-Zellen ein pelletiertes Zellvolumen von 30 Mikrolitern zu bilden. Bereiten Sie eine 60-Millimeter-Zellkulturschale vor, indem Sie zwei Mikrogramm pro Quadratzentimeter Fibronectin und sterile Kochsalzlösung zur Schale hinzufügen, um die humane Hirnmikrogefäßerhaltungszelllinie oder HBE5 aufzunehmen.Inkubieren Sie die Petrischale bei 37 Grad Celsius für fünf bis 20 Minuten und aspirieren Sie anschließend die Fibronectin-Lösung. Danach gewinnen Sie die HBE fünf I-Zellen aus einer 25 Quadratzentimeter großen Gewebekulturschale durch Ionisation und Zentrifugation Reese, suspendieren das Zellpellet in 10 Milliliter DMEM, komplettem Medium. Geben Sie dann 1,5 Milliliter dieser Zellsuspension in die mit Fibronectin behandelte Gewebekulturschale und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für zwei bis drei Tage, bis die Kultur eine Konfluenz von 50 bis 100 % erreicht hat und die Parasitenkulturen am Tag des Assays bereit für Cyto aian sind.Die HBE-five-I-Kultur sollte 50 bis 100 % konfluent sein. Die Parasitenkultur sollte sich im Stadium der pigmentierten Trophozoiten befinden, mit mindestens fünf bis 10 % Parasiten und einem Hämatokrit von 2 %. Pipettieren Sie zunächst 1,5 Milliliter der Parasitenkultur aus dem Kulturgefäß und überführen Sie sie in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Zentrifugieren Sie die Kultur bei 500 G für fünf Minuten und resuspendieren Sie sie in 10 Milliliter frisch zubereitetem, warmem DMEM unvollständigem Medium. Wiederholen Sie diesen Waschschritt ein zweites Mal, nachdem die endgültige Zentrifugation abgeschlossen ist.Resuspendieren Sie das Pellet von 30&nbsp;Mikrolitern in 1,5&nbsp;Milliliter DMEM-unvollständigem Medium, das mit 1&nbsp;% BSA ergänzt wurde. Danach holen Sie die 60&nbsp;Millimeter-Dish von hvac.Five ab.Die Augenzellen saugen das Kulturmedium auf und waschen zweimal mit je drei Milliliter DMEM. Unvollständiges Medium. Geben Sie die Parasitenlösung hinzu, die Schale mit fünf HPE-Augenzellen, und inkubieren Sie insgesamt 75 Minuten im Zellkulturschrank.Zweimal während der Inkubation resuspendieren Sie die Parasiten, indem Sie die Schale vorsichtig schwenken und schwenken lassen. Spülen Sie die Schale fünfmal aus, indem Sie das Medium mit einer Kunststoff-Pastapipette abpipettieren, drei Milliliter warmes DMEM-Inkomplettmedium hinzufügen und nach dem letzten Spülvorgang die Schale vorsichtig schwenken. Untersuchen Sie die Schale danach unter einem invertierten Mikroskop. Sind noch viele nicht infizierte rote Blutkörperchen sichtbar, wiederholen Sie den Spülvorgang wie oben beschrieben, um diese zu entfernen.Nachdem das Medium von der Schale abgesaugt wurde, resuspendieren Sie ein Volumen von 40&nbsp;Mikroliter gepackten Zellen frischer roter Blutkörperchen in erwärmtem vollständigem RPMI-Medium und geben die Zellsuspension zur Schale hinzu. Stellen Sie die Schale in eine inkubierende Kammer mit Luftzugang. Anschließend wird die Schale drei Minuten lang mit einer Gasatmosphäre aus 3&nbsp;% Kohlendioxid, 1&nbsp;% Sauerstoff und 96&nbsp;% Stickstoff versetzt.Und stellen Sie die Kammer über Nacht in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Während dieser Inkubation platzen die Schizontenstadium-Parasiten und infizieren erneut die roten Blutkörperchen. Am nächsten Tag gewinnen Sie die Ringstadium-Parasiten durch Waschen.Mit unvollständigem RPMI-Medium auf ähnliche Weise wie zuvor, jedoch unter stärkerem Pipettieren des Mediums und Schwenken der Platte. Sammeln Sie das gesamte verwendete Medium, das resuspendierte rote Blutkörperchen enthält, in einem 15-Milliliter-Konischgefäß. Überprüfen Sie die Platte unter einem umgekehrten Mikroskop, um sicherzustellen, dass alle roten Blutkörperchen aus der Schale entfernt wurden, bevor diese zentrifugiert wird.Das Rohr mit dem Medium der gewaschenen Platte zur Pellettierung der Parasiten; verwerfen Sie das Überstand und resuspendieren Sie in fünf Milliliter vollständigem RPMI-Medium. Geben Sie die Suspension in einen 25 cm²-Flasche zur Kultivierung. Die Parasiten werden zwei bis vier Wochen lang kultiviert, bis genügend Material gewonnen ist und eine neue Selektionsrunde durchgeführt werden kann.Nicht ausgewählte HB-Dreiparasiten weisen eine geringe Bindung an hbe-fünf-Augenzellen auf. Diese Aufnahme zeigt hbe-fünf-Augenzellen, die mit 2 % Glutaraldehyd fixiert und mit Giemsa gefärbt wurden und unter dem Mikroskop bei 1000facher Vergrößerung sichtbar gemacht wurden. Die Bilder wurden aufgenommen, nachdem nicht infizierte rote Blutkörperchen sowie nicht gebundene infizierte rote Blutkörperchen abgewaschen worden waren. Nach jeder Selektionsrunde binden immer mehr Parasiten an die endothelialen Zellen, wodurch die Selektionen in kürzeren Zeitabständen wiederholt werden können, nach insgesamt fünf Selektionsrunden. Populationen mit hoher Bindungsfähigkeit werden wie hier mit HB drei HBE-Parasiten gezeigt erhalten. Diese Tabelle zeigt eine Zusammenfassung der Plasmodium-alspar-Stämme, die erfolgreich für die Bindung an HE fünf ausgewählt wurden. Ich weise darauf hin, dass HB drei ebenfalls nach fünf Selektionsrunden auf TNF-aktivierten HE-fünf-I-Zellen ausgewählt wurde.Der DD2-Stamm zeigte im Vergleich zum unselektierten DD2 keine erhöhte Bindung an HBE5-I. Dieses Bild mit 400facher Vergrößerung zeigt die Bindung von Plasmodium alspar HB3-Parasiten an HDMEK-Dermisendothelzellen vor der Selektion. Hier wird die Bindung von Plasmodium alspar HB3-Parasiten an dieselbe Dermisendothelzelllinie nach vier Selektionsrunden dargestellt.Diese Abbildung zeigt die Bindung von Plasmodium spar HB drei Parasiten an HP ME pulmonale endotheliale Zellen vor der Selektion. Nun ist die Bindung von Plasmodium spar HB drei Parasiten an die H HP ME Zellen nach vier Runden der Selektion erhöht. Obwohl das Kulturmedium für hd e, C und H HP EC leicht abweicht, war das zur Selektion verwendete Protokoll identisch mit dem von hbe fünf I. Nach diesem Verfahren können Methoden wie R-T-P-C-R oder Mikroanalyse durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise die Charakterisierung der Transkription variabler Oberflächenantigene in nicht-selektierten und selektierten Parasiten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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Basierend HeLa Zellfreie Expressionssysteme zur Expression von<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteine

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Plasmodium falciparum Gametozytenkultur und Mückeninfektion durch künstliche Membranfütterung

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, Anweisungen zu geben, wie die Kapazität von Antikörpern gemessen werden kann, die in Seren oder Plasma von Individuen vorhanden sind, die natürlich einer Plasmodium falciparum-Infektion ausgesetzt sind, um die Phagozytose der parasiteninfizierten Erythrozyten (IEs) zu opsonisieren und zu induzieren.

Messung natürlich erworbener Phagozytose-induzierender Antikörper gegen Plasmodium falciparum Parasiten durch einen Flow Cytometry-based Assay

Fokussiertes Ionenstrahlfräsen zur Herstellung von glasartigen On-Grid-Lamellen aus tiefgefrorenen biologischen Proben für die Kryo-Elektronentomographie.

Präparation von Lamellen aus glasartigen biologischen Proben mit einem Zweistrahl-Rasterelektronenmikroskop für die Kryo-Elektronentomographie

Der Standard Membrane Feeding Assay (SMFA) gilt als Goldstandard für die Bewertung und Identifizierung potenzieller Malariamittel. Dieses künstliche Fütterungssystem wird verwendet, um Moskitos zu infizieren, um die Auswirkungen solcher Verbindungen auf die Intensität und Prävalenz des Parasiten Plasmodium falciparum weiter zu bewerten.

Standard-Membran-Fütterungstest zum Nachweis von Plasmodium falciparum-Infektionen in Anopheles-Mückenvektoren

Die chemische Genetik beinhaltet die Substitution eines Gatekeeper-Rests durch eine Aminosäure, die eine andere Seitenkette am Zielort enthält. In dieser Arbeit haben wir einen mutierten Parasiten generiert, der ein hypomorphes Allel von cdpk1 enthält, und kompensatorische Signalwege identifiziert, die der Parasit im mutierten Hintergrund einnimmt.

Verständnis der Entwicklung von Kompensationswegen in einem mutierten Malariaparasiten mit hypomorphem Allel pflanzenähnlicher Kinasen

Erfahren Sie die Selektion von Plasmodium falciparum für die Bindung an humane Gehirnendothelzellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung zerebraler Malaria-Mechanismen und potenzieller Therapieansätze.

Auswahl der Plasmodium falciparum Parasiten für Cytoadhesion zu Human Brain Endothelial Cells

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