Auswahl der Plasmodium falciparum Parasiten für Cytoadhesion zu Human Brain Endothelial Cells

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Plasmodium, fpar und Parasiten für die Bindung an humane Gehirnendothelzellen auszuwählen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Kultur aus Plasmodium, fpar und Parasiten, die eine Mischung aus infizierten und nicht infizierten roten Blutkörperchen enthält, mit einer Schicht aus humanen Gehirnendothelzellen inkubiert wird. Im nächsten Schritt werden nicht infizierte und nicht gebundene rote Blutkörperchen durch mehrfaches Waschen mit Kulturmedium abgewaschen. Anschließend werden frische rote Blutkörperchen hinzugefügt, um das weitere Wachstum der Parasitenpopulation zu ermöglichen.

Der letzte Schritt einige Wochen später besteht darin, die Gesamtauswahl zu wiederholen, sobald eine ausreichende Parasitenanzahl erreicht ist. Letztendlich wird mittels Mikroskopie gezeigt, dass eine hohe Anzahl von Parasiten an HBE fünf i gebunden ist. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der zerebralen Malaria zu beantworten, beispielsweise die Identifizierung von Parasitenliganden oder Wirtszellrezeptormolekülen, die am Cyto-Endurance-Prozess beteiligt sind.

Bereiten Sie humane rote Blutkörperchen aus Vollblut der Gruppe O positiv vor, indem Sie die roten Blutkörperchen durch eine Leukozyten-Depletionsfilterung von den weißen Blutkörperchen trennen. Zentrifugieren Sie die Zellen 10 Minuten bei 1000 G und resuspendieren Sie das Pellet in vollständigem PMI-Incomplete-Medium.

Wiederholen Sie diesen Waschschritt noch einmal und resuspendieren Sie anschließend das Pellet. In unserem PMI-unvollständigen Medium bei 50 % Hämatokrit werden rote Blutkörperchen eine Woche lang bei vier Grad Celsius gelagert. Kultivieren Sie Odium Valspar-infizierte rote Blutkörperchen.

Mit RPMI-Vollmedium bei 2 % Hämatokrit und Inkubation bei 37 °C mit 3 % Kohlendioxid, 1 % Sauerstoff und 96 % Stickstoff täglich. Einen Dünndarmabstrich herstellen, um den Entwicklungsstand der Parasiten zu beurteilen. Das Medium täglich wechseln, indem die Kultur fünf Minuten lang bei 500 × g zentrifugiert wird.

Das Überstand entfernen und etwa einmal pro Woche frisches komplettes RPMI-Medium hinzufügen. Die Parasiten durch Behandlung mit wässriger 5 %iger Sorbitollösung synchronisieren. Der Selektionsassay kann am Tag nach einer Kultur im Ringstadium durchgeführt werden, wenn mindestens 5–10 % Parasitämie beobachtet wird.

Zusätzlich wird genügend Parasitenkultur benötigt, um pro 60-Millimeter-Schale mit HBE5-Zellen ein pelletiertes Zellvolumen von 30 Mikrolitern zu bilden. Bereiten Sie eine 60-Millimeter-Zellkulturschale vor, indem Sie zwei Mikrogramm pro Quadratzentimeter Fibronectin und sterile Kochsalzlösung zur Schale hinzufügen, um die humane Hirnmikrogefäßerhaltungszelllinie oder HBE5 aufzunehmen.

Inkubieren Sie die Petrischale bei 37 Grad Celsius für fünf bis 20 Minuten und aspirieren Sie anschließend die Fibronectin-Lösung. Danach gewinnen Sie die HBE fünf I-Zellen aus einer 25 Quadratzentimeter großen Gewebekulturschale durch Ionisation und Zentrifugation Reese, suspendieren das Zellpellet in 10 Milliliter DMEM, komplettem Medium. Geben Sie dann 1,5 Milliliter dieser Zellsuspension in die mit Fibronectin behandelte Gewebekulturschale und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für zwei bis drei Tage, bis die Kultur eine Konfluenz von 50 bis 100 % erreicht hat und die Parasitenkulturen am Tag des Assays bereit für Cyto aian sind.

Die HBE-five-I-Kultur sollte 50 bis 100 % konfluent sein. Die Parasitenkultur sollte sich im Stadium der pigmentierten Trophozoiten befinden, mit mindestens fünf bis 10 % Parasiten und einem Hämatokrit von 2 %. Pipettieren Sie zunächst 1,5 Milliliter der Parasitenkultur aus dem Kulturgefäß und überführen Sie sie in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Zentrifugieren Sie die Kultur bei 500 G für fünf Minuten und resuspendieren Sie sie in 10 Milliliter frisch zubereitetem, warmem DMEM unvollständigem Medium. Wiederholen Sie diesen Waschschritt ein zweites Mal, nachdem die endgültige Zentrifugation abgeschlossen ist.

Resuspendieren Sie das Pellet von 30 Mikrolitern in 1,5 Milliliter DMEM-unvollständigem Medium, das mit 1 % BSA ergänzt wurde. Danach holen Sie die 60 Millimeter-Dish von hvac.Five ab.

Die Augenzellen saugen das Kulturmedium auf und waschen zweimal mit je drei Milliliter DMEM. Unvollständiges Medium. Geben Sie die Parasitenlösung hinzu, die Schale mit fünf HPE-Augenzellen, und inkubieren Sie insgesamt 75 Minuten im Zellkulturschrank.

Zweimal während der Inkubation resuspendieren Sie die Parasiten, indem Sie die Schale vorsichtig schwenken und schwenken lassen. Spülen Sie die Schale fünfmal aus, indem Sie das Medium mit einer Kunststoff-Pastapipette abpipettieren, drei Milliliter warmes DMEM-Inkomplettmedium hinzufügen und nach dem letzten Spülvorgang die Schale vorsichtig schwenken. Untersuchen Sie die Schale danach unter einem invertierten Mikroskop. Sind noch viele nicht infizierte rote Blutkörperchen sichtbar, wiederholen Sie den Spülvorgang wie oben beschrieben, um diese zu entfernen.

Nachdem das Medium von der Schale abgesaugt wurde, resuspendieren Sie ein Volumen von 40 Mikroliter gepackten Zellen frischer roter Blutkörperchen in erwärmtem vollständigem RPMI-Medium und geben die Zellsuspension zur Schale hinzu. Stellen Sie die Schale in eine inkubierende Kammer mit Luftzugang. Anschließend wird die Schale drei Minuten lang mit einer Gasatmosphäre aus 3 % Kohlendioxid, 1 % Sauerstoff und 96 % Stickstoff versetzt.

Und stellen Sie die Kammer über Nacht in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Während dieser Inkubation platzen die Schizontenstadium-Parasiten und infizieren erneut die roten Blutkörperchen. Am nächsten Tag gewinnen Sie die Ringstadium-Parasiten durch Waschen.

Mit unvollständigem RPMI-Medium auf ähnliche Weise wie zuvor, jedoch unter stärkerem Pipettieren des Mediums und Schwenken der Platte. Sammeln Sie das gesamte verwendete Medium, das resuspendierte rote Blutkörperchen enthält, in einem 15-Milliliter-Konischgefäß. Überprüfen Sie die Platte unter einem umgekehrten Mikroskop, um sicherzustellen, dass alle roten Blutkörperchen aus der Schale entfernt wurden, bevor diese zentrifugiert wird.

Das Rohr mit dem Medium der gewaschenen Platte zur Pellettierung der Parasiten; verwerfen Sie das Überstand und resuspendieren Sie in fünf Milliliter vollständigem RPMI-Medium. Geben Sie die Suspension in einen 25 cm²-Flasche zur Kultivierung. Die Parasiten werden zwei bis vier Wochen lang kultiviert, bis genügend Material gewonnen ist und eine neue Selektionsrunde durchgeführt werden kann.

Nicht ausgewählte HB-Dreiparasiten weisen eine geringe Bindung an hbe-fünf-Augenzellen auf. Diese Aufnahme zeigt hbe-fünf-Augenzellen, die mit 2 % Glutaraldehyd fixiert und mit Giemsa gefärbt wurden und unter dem Mikroskop bei 1000facher Vergrößerung sichtbar gemacht wurden. Die Bilder wurden aufgenommen, nachdem nicht infizierte rote Blutkörperchen sowie nicht gebundene infizierte rote Blutkörperchen abgewaschen worden waren. Nach jeder Selektionsrunde binden immer mehr Parasiten an die endothelialen Zellen, wodurch die Selektionen in kürzeren Zeitabständen wiederholt werden können, nach insgesamt fünf Selektionsrunden.

Populationen mit hoher Bindungsfähigkeit werden wie hier mit HB drei HBE-Parasiten gezeigt erhalten. Diese Tabelle zeigt eine Zusammenfassung der Plasmodium-alspar-Stämme, die erfolgreich für die Bindung an HE fünf ausgewählt wurden. Ich weise darauf hin, dass HB drei ebenfalls nach fünf Selektionsrunden auf TNF-aktivierten HE-fünf-I-Zellen ausgewählt wurde.

Der DD2-Stamm zeigte im Vergleich zum unselektierten DD2 keine erhöhte Bindung an HBE5-I. Dieses Bild mit 400facher Vergrößerung zeigt die Bindung von Plasmodium alspar HB3-Parasiten an HDMEK-Dermisendothelzellen vor der Selektion. Hier wird die Bindung von Plasmodium alspar HB3-Parasiten an dieselbe Dermisendothelzelllinie nach vier Selektionsrunden dargestellt.

Diese Abbildung zeigt die Bindung von Plasmodium spar HB drei Parasiten an HP ME pulmonale endotheliale Zellen vor der Selektion. Nun ist die Bindung von Plasmodium spar HB drei Parasiten an die H HP ME Zellen nach vier Runden der Selektion erhöht. Obwohl das Kulturmedium für hd e, C und H HP EC leicht abweicht, war das zur Selektion verwendete Protokoll identisch mit dem von hbe fünf I. Nach diesem Verfahren können Methoden wie R-T-P-C-R oder Mikroanalyse durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise die Charakterisierung der Transkription variabler Oberflächenantigene in nicht-selektierten und selektierten Parasiten.