Auswahl der Plasmodium falciparum Parasiten für Cytoadhesion zu Human Brain Endothelial Cells

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Plasmodium, FPAR und Parasiten für die Bindung an menschliche Gehirn-Endothelzellen auszuwählen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Kultur aus Plasmodium, FPAR und Parasiten inkubiert wird, die eine Mischung aus infizierten und nicht infizierten roten Blutkörperchen mit einer Schicht menschlicher Gehirn-Endothelzellen enthält, der nächste Schritt besteht darin, nicht infizierte und ungebundene rote Blutkörperchen durch mehrmaliges Waschen mit Kultur abzuwaschen. Mittlere, frische rote Blutkörperchen werden dann hinzugefügt, um ein weiteres Wachstum der Parasitenpopulation zu ermöglichen.

Der letzte Schritt einige Wochen später besteht darin, die Gesamtauswahl zu wiederholen, sobald eine ausreichende Anzahl von Absätzen erreicht ist. Letztendlich wird die Mikroskopie verwendet, um eine hohe Anzahl von Parasiten zu zeigen, die an HBE five i gebunden sind. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der zerebralen Malaria zu beantworten, wie z. B. die Identifizierung von Parasitenliganden oder Wirtsrezeptormolekülen, die am Zyto-Ausdauerprozess beteiligt sind.

Bereiten Sie menschliche rote Blutkörperchen aus positivem Vollblut der Gruppe O vor, indem Sie die roten Blutkörperchen von den weißen Blutkörperchen durch Passage durch einen Leukozytenabbaufilter trennen. Zentrifugieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 1000 g und verbringen Sie das Pellet mit allen PMI. Unvollständig, mittel.

Wiederholen Sie diesen Waschschritt noch einmal und suspendieren Sie das Pellet erneut. In unserem unvollständigen PMI-Medium mit 50 % Hämatokrit werden rote Blutkörperchen eine Woche lang bei vier Grad Celsius gelagert. Kultur Odium Valspar infizierte rote Blutkörperchen.

Mit RPMI das Medium bei 2 % Hämatokrit vervollständigen und täglich bei 37 Grad Celsius mit 3 % Kohlendioxid, 1 % Sauerstoff und 96 % Stickstoff inkubieren. Machen Sie einen Edelsteinabstrich, um das Entwicklungsstadium der Parasiten zu beurteilen. Wechseln Sie das Medium täglich, indem Sie die Kultur fünf Minuten lang bei 500 g drehen.

Saugen Sie den Überstand ab und fügen Sie etwa einmal pro Woche frisches RPMI Complete Medium hinzu. Synchronisieren Sie die Parasiten durch Behandlung mit wässrigem 5%D Sorbit. Der Selektionsassay kann am Tag nach der Beobachtung einer Ringkultur mit einem Mindestgehalt von 5 % bis 10 % Parsit durchgeführt werden.

Außerdem. Pro 60-Millimeter-Schale von fünf Augenzellen wird genügend Parasitenkultur benötigt, um ein Volumen von 30 Mikrolitern P-Zellen zu bilden. Bereiten Sie eine 60-Millimeter-Gewebekulturschale vor, um die mikrovaskuläre Endothelzelllinie des menschlichen Gehirns oder H zurück fivei aufzunehmen, indem Sie der Schale zwei Mikrogramm pro Quadratzentimeter Fibronektin und sterile Kochsalzlösung hinzufügen.

Inkubieren Sie die Schale fünf bis 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und aspirieren Sie dann die Fibronektinlösung. Ernten Sie dann die HBE-Fünf-I-Zellen aus einem 25 Zentimeter großen quadratischen Gewebekolben durch Ionisation und Zentrifugation Reese, suspendieren Sie das Zellpellet in 10 Millilitern DMEM, vollständiges Medium. Geben Sie dann 1,5 Milliliter dieser Zellsuspension in die mit Fibronektin behandelte Gewebekulturschale und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für zwei bis drei Tage, bis die Kultur 50 bis 100 % Co-Flüssigkeit erreicht und die Parasitenkulturen am Tag des Assays für die Zytotherapie bereit sind.

Die HBE five I-Kultur sollte bei 50 bis 100 % Co-Flüssigkeit liegen. Während sich die Parasitenkultur im Stadium der pigmentierten Trophozoiten mit mindestens fünf bis 10 % Paras und 2 % Hämatokrit befinden sollte. Zuerst werden 1,5 Milliliter Parasitenkultur aus dem Kulturkolben pipetiert und in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen umgefüllt.

Die Kultur wird fünf Minuten lang bei 500 g zentrifugiert und in 10 Millilitern erneut gebogen. Ein frisch zubereitetes warmes DMEM unvollständig, mittel. Wiederholen Sie diesen Waschschritt ein zweites Mal, nachdem die letzte Zentrifugation abgeschlossen ist.

Asberry das DMEM unvollständig, mittel, und geben Sie die 30 Mikroliter Pellet in 1,5 Milliliter DMEM erneut aus. Unvollständiges Medium, ergänzt mit 1 % BSA. Holen Sie als Nächstes die 60-Millimeter-Schüssel mit HLK. Fünf.

Die Augenzellen saugen das Nährmedium ab und waschen sich zweimal mit drei Millilitern DMEM. Unvollständiges Medium. Geben Sie die Parasitenlösung, die Schale der HPE fünf Augenzellen hinzu und inkubieren Sie insgesamt 75 Minuten lang im Gewebekultur-Inkubator.

Suspendieren Sie die Parasiten zweimal während der Inkubationsreanimation, indem Sie die Schale nach der Inkubation sanft schaukeln und schwenken. Waschen Sie das Geschirr fünfmal, indem Sie das Medium mit einer Plastikpastapipette aspirieren, um drei Milliliter warmes DMEM-unvollständiges Medium hinzuzufügen, und dann den Teller nach dem letzten Spülen vorsichtig schaukeln und das Gericht unter einem inversen Mikroskop untersuchen. Wenn noch viele nicht infizierte rote Blutkörperchen sichtbar sind, wiederholen Sie den Waschvorgang wie oben beschrieben, um sie zu entfernen.

Nach dem Aspirieren des Mediums aus der Schale Resus suspendieren Sie 40 Mikroliter des gepackten Zellvolumens frischer roter Blutkörperchen in erwärmtem RPMI vollständiges Medium und geben Sie die Zellsuspension in die Schale. Stellen Sie die Schale in eine Inkubationskammer mit Luftsicht. Begasen Sie die Schale dann drei Minuten lang mit 3 % Kohlendioxid, 1 % Sauerstoff und 96 % Stickstoff.

Und stellen Sie die Kammer über Nacht in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Während dieser Inkubation platzen Schiz-on-Stage-Parasiten und Mädels reiten die roten Blutkörperchen. Ernten Sie am nächsten Tag die Parasiten im Ringstadium durch Waschen.

Mit RPMI unvollständigem Medium auf ähnliche Weise wie zuvor, aber mit energischerem Pipettieren des Mediums und Schaukeln der Platte. Bewahren Sie alle verwendeten Medien, die resuspendierte rote Blutkörperchen enthalten, in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen auf. Überprüfen Sie die Platte unter einem inversen Mikroskop, um sicherzustellen, dass alle roten Blutkörperchen aus der Schalenzentrifuge entfernt wurden.

Das Röhrchen, das das Medium enthält, von der gewaschenen Platte, um die Parasiten zu pelletieren, verwirft den Überstand Resus, der fünf Milliliter suspendiert. RPMI füllen und die Mischung zum Kultivieren in einen 25 Zentimeter großen Quadratkolben geben. Die Parasiten werden zwei bis vier Wochen lang kultiviert, bis genügend Material gewonnen wird und eine neue Selektionsrunde durchgeführt werden kann.

Nicht selektierte HB 3-Parasiten zeigen ein geringes Maß an Bindung an die fünf Augenzellen. Dieses Bild zeigt fünf Augenzellen, die mit 2 % Glutaraldehyd fixiert und mit Giemsa gefärbt wurden, die unter dem Mikroskop bei 1000-facher Vergrößerung sichtbar gemacht wurden. Pfirsiche wurden entnommen, nachdem nicht infizierte rote Blutkörperchen und ungebundene infizierte rote Blutkörperchen weggespült worden waren. Nach jeder Selektionsrunde binden sich immer mehr Parasiten in die Endothelzellen und die Selektionen können nach fünf Selektionsrunden in kürzeren Zeitabständen wiederholt werden.

Es werden hochbindende Parasitenpopulationen erhalten, wie hier mit HB drei HBE-Parasiten gezeigt. Diese Tabelle zeigt eine Zusammenfassung der Plasmodium alspar-Stämme, die erfolgreich für die Bindung an HE five ausgewählt wurden. Ich stelle fest, dass HB drei nach fünf Auswahlrunden auch auf TNF-aktiviertem HE fünf I ausgewählt wurde.

Der DD zwei Stamm zeigte keine Zunahme der Bindung an HBE fünf I im Vergleich zu nicht selektierten DD zwei. Dieses Bild mit 400-facher Vergrößerung zeigt die Bindung von Plasmodium alspar HB, drei Parasiten, an HD MEK, dermale Endothelzellen, vor der Selektion. Hier zeigt sich die Bindung von drei Parasiten von Plasmodium alspar HB an die gleiche dermale Endothelzelllinie nach vier Selektionsrunden.

Diese Abbildung zeigt die Bindung von Plasmodium spat HB drei Parasiten an HP ME Lungenendothelzellen vor der Selektion. Nun ist die Bindung von Plasmodium spat HB drei Parasiten an die H HP ME Zellen nach vier Selektionsrunden erhöht. Obwohl sich das Kulturmedium für HD e, C und H HP EC leicht unterscheidet, war das für die Selektion verwendete Protokoll identisch mit dem von hbe five I. Nach diesem Verfahren können Methoden wie R-T-P-C-R oder Mikroanalyse durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Charakterisierung der Transkription von varianten Oberflächenantigenen in nicht selektierten und selektierten Parasiten zu beantworten.