Non-Laser Capture Microscopy Ansatz für die Mikrodissektion von Discrete-Maus Hirnregionen für Gesamt-RNA Isolierung und Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Gesamt-RNA aus diskreten Hirnkernen auf wiederholbare, konsistente, kosteneffiziente und RNA-freie Weise zu sammeln. Dies wird erreicht, indem zunächst eine RN-freie Arbeitsumgebung vorbereitet und das gesamte Gehirn einer geköpften Maus entfernt wird. Als nächstes wird ein mikrometerbetriebener Gewebehacker verwendet, um gleichmäßig große serielle Gewebeschnitte zu schneiden.

Dann werden die interessierenden Hirnregionen mit einem Gewebekern mit festgelegtem Durchmesser mikropräpariert, während das Gewebe in einer RNA-freien Mediumumgebung gehalten wird. Schließlich wird die Gesamt-RNA aus den herausgeschnittenen Hirnkernen isoliert. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine ausreichende Gesamt-RNA-Ausbeute und -Qualität für die nachgelagerte CDNA-Bibliotheksvorbereitung und Transkriptomprofilierung durch photometrische oder fluormetrische Spektren- oder fluormetrische Assays zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der grobanatomischen oder der Laser-Capture-Mikroskopie-gestützten Exzision von Hirnregionen besteht darin, dass mehrere diskrete Hirnregionen von Interesse aus einem einzelnen Mausgehirn auf wiederholbare und kosteneffiziente Weise entnommen werden können. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, z. B. ob unterschiedliche Transkriptexpressionsprofile in Gehirnregionen, die keine neuronalen Schaltkreise aufweisen, mit bestimmten Verhaltensmerkmalen, Umweltreaktionen und/oder Krankheitszuständen korreliert sein können. Zur Vorbereitung der Mikrodissektion ergänzen Sie 100 Milliliter Earl's Balanced Salt Solution oder EBSS mit 0,44 Gramm Natriumbicarbonat und 0,884 Gramm Glukose.

Behandeln Sie das EBSS mindestens 12 Stunden lang mit 0,1 Millilitern DEPC in einer autoklavierbaren Flasche oder einem Kolben mit Schraubverschluss. Bei 37 Grad Celsius. Legen Sie fünf und dreiviertel Zoll Glaspipetten in ein Ein-Liter-Glasbecherglas und legen Sie Künstlerpinsel mit Borsten nach oben in einen 100-Milliliter-Messzylinder aus Glas.

Fügen Sie ausreichend mit DEPC behandelte Wasserlösung hinzu, um die Pipetten und Bürsten zu bedecken. Decken Sie das Becherglas und den Messzylinder mit Aluminiumfolie ab und inkubieren Sie mindestens 12 Stunden bei 37 Grad Celsius, nach der 12-stündigen Inkubation mit DEPC, erhitzen Sie alle mit DEPC behandelten Materialien mindestens 15 Minuten lang auf eine Temperatur von mehr als 100 Grad Celsius. Kühl. Das EBSS bei Raumtemperatur vor der Lagerung bei vier Grad Celsius.

Gießen Sie das DD H2O aus dem Becherglas und dem Messzylinder und inkubieren Sie sie bei mehr als 100 Grad Celsius weiter, bis das Material trocken ist. Aus dem Inkubator nehmen, bei Raumtemperatur abkühlen lassen und für den späteren Gebrauch aufbewahren. Behandeln Sie am Tag des Experiments alle Arbeitsflächen, um RNAs zu entfernen, die Kontamination zu entfernen, platzieren Sie das EBSS und halten Sie es in einem Wasserbad bei 40 Grad Celsius, um es zu puffern und mit Sauerstoff zu versorgen.

Die EBSS infiltrieren es mit 5 % CO2 und 95 % Sauerstoff, indem sie einen Gasschlauch in eine RNA-freie Weidepipette einführen. Und indem Sie die Pipette in das EBSS einführen, verschließen Sie die Öffnung des EBSS-Behälters. Richten Sie einen Gewebeschneider für die serielle Schnittung des Hirngewebes ein.

Behandeln Sie die Ober- und Unterseite des Tissue-Slicers. Um RNA-Kontaminationen zu entfernen, befestigen Sie ein rechteckiges Stück Filterpapier mit Watman Nummer vier an der Plexiglasoberfläche des Gewebezerkleinerers. Befestigen Sie eine zweischneidige Rasierklinge am Häckslerarm.

Stellen Sie das Mikrometer auf Null und stellen Sie die Mindesthöhe des Zerkleinerarms so ein, dass die Rasierklinge das Filterpapier, aber nicht die Plexiglasplatte durchtrennen kann. Sammeln Sie alle zusätzlichen Materialien, die für die Mikrodissektion benötigt werden, einschließlich RNA-freier 60 x 15 Millimeter Zellkulturschalen, Gewebe cos 200 Mikroliter RNA-freie Mikropipettenspitzen, gebogene Scheren, Trockeneis und Röhrchen für die Gewebeentnahme. Legen Sie die Röhrchen auf Trockeneis, nachdem Sie eine Maus mit einer Nagetier-Guillotine geköpft und das gesamte Gehirn mit intaktem Hinterhirn und Sehnerven entfernt haben.

Platzieren Sie das Gehirn in einer 60 x 15 Millimeter großen RNA-freien Zellkulturschale. Übertragen Sie es dann auf die Arbeitsfläche der Gewebeprobenahme. Verwenden Sie eine RNAs-freie Pipette, um das am Gewebezerkleinerer befestigte Filterpapier konservativ mit EBSS zu befeuchten.

Befeuchten Sie das Hirngewebe mit EBSS. Übertragen Sie das Gehirn in den Gewebehacker und positionieren Sie ihn so, dass die Bauchfläche auf dem Filterpapier aufliegt. Die Mittellinie senkrecht zum Chopperblatt und die rostrale Kante des Gehirns, die an die Klinge angrenzt.

Verwenden Sie einen A-D-E-P-C-behandelten Künstlerpinsel, um das Gehirn stationär zu halten, indem Sie sanften Druck auf die dorsale Oberfläche des Gehirns ausüben, während Sie das Gehirn stationär halten. Heben Sie den Hebel des Klingenhalters etwa vier bis fünf Zentimeter über die Rückengewebsoberfläche und halten Sie ihn in dieser Position. Entfernen Sie die Bürste von der Gehirnoberfläche und stellen Sie 750 Mikrometer ein.

Mit dem Mikrometer. Lassen Sie den Hebel fallen, hacken Sie das Gewebe und erzeugen Sie einen 750 Mikrometer großen koronalen Schnitt, während das Choppermesser stationär bleibt. Verwende eine rollende Bewegung mit dem Pinsel des Künstlers, um den Gewebeabschnitt vorsichtig von der Klingenoberfläche wegzuwischen.

Legen Sie den Gewebeschnitt sofort in das sauerstoffhaltige EBSS in der Petrischale. Diese Scheibe ist nun bereit für die Mikrodissektion. Wiederholen Sie den Schneidevorgang, bis serielle Hirnschnitte über die gesamte Rost-Kodalebene erhalten wurden, um eine Mikrodissektion durchzuführen.

Überprüfen Sie zunächst die Beleuchtung, um sicherzustellen, dass die Probenbeleuchtung nicht behindert wird. Passen Sie die Position und den Fluss des O2-CO2-Gemischs an, um eine gepufferte, sauerstoffreiche Umgebung für das Gewebe zu erhalten. Identifizieren Sie während des Eingriffs den koronalen Gehirnabschnitt, der die interessierende Region umfasst, und richten Sie ihn mit einem Künstlerpinsel flach auf dem Boden der Petrischale aus.

Wählen Sie den Gewebekern mit dem passenden Durchmesser aus. Halten Sie den koronalen Gewebeschnitt mit dem Künstlerpinsel fest und bringen Sie die Schneidspitze des Gewebekerns über die Oberfläche des Gewebeschnitts nach unten. Drücken Sie unter Druck die Gewebekernspitze durch den Gewebeschnitt und fest auf den Boden der Petrischale.

Verwenden Sie eine rollende kreisende Bewegung, um sicherzustellen, dass die interessierende Region vom umgebenden Gewebe getrennt wurde. Heben Sie den Gewebekern vorsichtig vom Gewebeschnitt weg und lösen Sie den Mikrostanzer, so dass er mit einem Künstlerpinsel im EBSS schweben kann. Legen Sie den Mikrostempel des Gewebes sofort in ein bei minus 80 Grad Celsius stabiles Aufbewahrungsröhrchen, das auf Trockeneis aufbewahrt wird.

Das Gewebe sollte leicht an der Seite des Schlauchs haften. Geben Sie die Mikroprobe mit dem Röhrchen wieder in das Trockeneis. Wiederholen Sie diese Mikrodissektion für jede interessierende Hirnregion.

Sobald die Mikrodissektion abgeschlossen ist, notieren Sie das entsprechende Etikett oder die Barcodes für jede Probe, die das Röhrchen enthält. Legen Sie die Gewebeproben in einen minus 80 Grad Celsius heißen Gefrierschrank, bis die RNA extrahiert wird, um RNA aus den Gewebeproben zu extrahieren. Bereiten Sie zunächst einen RNA-freien Arbeitsbereich vor.

Stellen Sie eine ausreichende Menge der magnetischen Bead-Mischung und der Lysebindungslösung her, wie in der Anleitung des gesamten RNA-Isolationskits beschrieben. Entnehmen Sie die Gewebeproben aus dem minus 80 Grad Celsius warmen Gefrierschrank und legen Sie die Röhrchen direkt auf Trockeneis. Geben Sie 100 Mikroliter der Lysebindungslösung in ein Probenröhrchen.

Befestigen Sie einen nukleasefreien Stößel mit einer Röhrchengröße von 0,5 Millilitern an den Pelletmischer und homogenisieren Sie das Gewebe mit einer nukleasefreien Pipettenspitze mit geringer Retention. Übertragen Sie die homogenisierte Probe sofort mit der gleichen Art von Spitze in eine Vertiefung auf einer 96-Well-Gewebekulturplatte mit rundem Boden. Geben Sie 60 Mikroliter 100%iges Isopropanol in die Probe.

Geben Sie 20 Mikroliter der Bead-Mischung in die Probe und mischen Sie, indem Sie drei- bis viermal auf und ab pipettieren. Befolgen Sie die Schritte des Protokolls des Gesamt-RNA-Isolationskits, um die Gesamt-RNA-Extraktion abzuschließen. Messen Sie schließlich die Reinheit und Konzentration der resultierenden Gesamt-RNA Gesamt-RNA-Daten aus Mikrostanzen verschiedener Gehirnregionen sind in dieser Tabelle aufgeführt.

RNA-Proben, die mit 30 Mikrolitern Evolutionspuffer angedeutet wurden, lieferten ausreichend Gesamt-RNA für die Verwendung mit kommerziell erhältlichen CD NA-Präparationsprodukten für RNA-Sequenzierungsanwendungen. Darüber hinaus handelt es sich bei der RNA-Ausbeute und zwei Verhältnissen von 60 zu zwei 80 um Einzelwerte, die aus den jeweiligen Mikrodissektionsproben gewonnen wurden, um Messwerte aus jeder Gehirnregion zu demonstrieren und die hohe Probenreinheit zu bestätigen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in acht bis 10 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, das Risiko einer RNA-Kontamination von Arbeitsflächen oder Gewebeproben zu minimieren, indem nur RNA-freie oder dsy-behandelte Materialien verwendet werden.