Name: Imaging G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR)-vermittelten Signaltransduktion, die Steuerung der Chemotaxis Dictyostelium discoideum /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Lernen Sie die fortgeschrittene Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung der Chemotaxis bei Dictyostelium discoideum. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung räumlich-zeitlicher Signaldynamiken in lebenden Zellen.

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Diese Arbeit wird durch die intramuralen Fonds von NIAID, NIH unterstützt.

1. Vorbereitung der chemotaktischen kompetente Zellen von Dictyostelium discoideum <ol><li> Zur Erzeugung von D. discoideum-Zellen, die chemotaktisch auf die chemoattractant cAMP, Ernte wachsenden Zellen in D3-T Rich-Media aus einer Schüttelkultur bei 22 ° C sind </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal in non-Nährstoff-Entwicklungs-Puffer (DB-Puffer mit 5 mM Na 2 HPO 4, 5 mM KH 2 PO 4, 2 mM MgCl 2 und 0,1 mM CaCl 2). </li><li> Re-suspend-Zellen in DB-Puffer bei einer Dichte von 2x10 7 Zellen / ml. </li><li> Schütteln 10 ml Zellen in einem 250 ml-Kolben bei 100 rpm bei 22 ° C für eine Stunde. </li><li> Deliver 100 ul von 7,5 pM cAMP Lager an die 10 ml Zellen alle sechs Minuten über 6 Stunden bis zu einer Endkonzentration von 75 nM cAMP, ein Verfahren, wie cAMP pulsierende Behandlung bezeichnet erreichen. Nach 5-6 Stunden cAMP pulsierende Behandlung, D. discoideum Zellen werden chemotaktisch zuständige gegenüber cAMP-Gradienten. </li><li> Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 200 g für 5 min und dann die Zellen mit DB-Puffer mit 2,5 mM Koffein, und schütteln mit 200 UpM bei 22 ° C für 20 min zu Zelle zu einer chemotaktischen Situation basolate. </li></ol> 2. Imaging chemotaxing Zellen in eine sichtbare und manipulierbare Lockstoff-Gradienten <ol><li> Backfill einer Mikropipette mit einem frisch zubereiteten 30 ul Lösung von 1 nM cAMP und Alexa 594 bei 0.1μg/μl in DB-Puffer. </li><li> Bringen Sie die Femtotip zu einer Mikropipette Inhaber und verbinden Sie den Schlauch mit einer Druckversorgung Apparat, Eppendorf FemtoJet System. </li><li> Bringen Sie die Mikropipette Montage an einem Mikromanipulator (Eppendorf TransferMan NK2) motorisierten Mikromanipulator zu einem stetigen Druck bereitzustellen, um eine stabile Gradienten zu etablieren. </li><li> Montieren Sie einen Ein-und LabTek Kammer mit 6 ml DB-Puffer über einen 40x Öl Objektiv gefüllt auf einem konfokalen Mikroskop und verwenden Hellfeld-Optik, in der Mitte der Femtotip in das Blickfeld. </li><li> Schalten Sie die Druckluftversorgung und stellen Sie die Entschädigung Druck (Pc) für 70 hPa auf einen Gradienten des cAMP / Alexa 594-Gemisch herzustellen. </li><li> Visualisieren cAMP-Gradienten durch die Überwachung der Mischung der gewünschten Konzentration von cAMP und Alexa 594-Fluoreszenz unter Anregung mit 543 nm Laserlinie. </li><li> Verwenden Sie auto-Positionierung der Mikromanipulator zu Mikropipette in die gewünschte Position bringen und sie als Position 1, Position 2 und Position 3 auf den Verlauf, um die Zelle ausgesetzt sind, zu manipulieren. </li></ol> 3. Immobile nicht polarisierten Zelle System erleichtert die Bildgebung Signalwege in cAMP Gradienten Sensing beteiligt <ol><li> Nach Coffein-Behandlung, entfernen Sie ein Aliquot von Zellen und Zentrifuge bei 500g für 3 min. </li><li> Remove-Puffer und verdünnten Zellen auf 5x10 5 Zellen / ml mit frischem DB-Puffer mit 2,5 mM Koffein. </li><li> Es wird 1 ml der Zellsuspension auf eine Single-well Kammer oder 0,4 ml in jede Vertiefung eines Vier-well Kammer. </li><li> Lassen Zellen haften für 10 min, sorgfältig Pipette aus dem Puffer zu losen Zellen zu entfernen und ersetzen mit dem gleichen Volumen. </li><li> Suchen Sie die gewünschten Zellen unter dem Mikroskop und starten Bildgebung. </li><li> Für ein Experiment entworfen, um die Dynamik der Signalkomponenten in die Zellen ausgesetzt, um eine stetige Steigung Überwachung, Behandlung der Zellen mit 5,0 nM (Endkonzentration) Latrunculin B für 10 min vor den Experimenten. </li></ol> 4. Gleichzeitige Überwachung heterotrimeren G-Protein-Aktivierung und PIP 3-Produktion <ol><li> cAMP pulsierende entwickeln Zellen co-exprimierenden GαCFP und YFPGβ (G-Zellen) und Zellen, PIP 3 Indikator PH-GFP (PH-Zellen) 7. </li><li> Diese beiden Arten von Zellen, die mit 1:1-Verhältnis und die Platte sie in einem Brunnen oder 4-Well Kammern. </li><li> Erstellen und speichern Sie die Emission Fingerabdruck Referenzkurve CFP, YFP und GFP mit Lambda Stack Acquisition mode im Spektralbereich von 464 bis 624 nm mit 10 nm Breite. </li><li> Gleichzeitig Bild G-Protein-Aktivierung in G-Zellen und PIP 3-Produktion in PH-Zellen mit mit gleichem Lambda Stack Acquisition mode im Spektralbereich von 464 bis 544 nm mit einer 10 nm-Schritten. </li><li> Bewerben Linear Unmixing Funktion Zeiss 510META Software mit gespeicherten CFPand YFP-und Emissionswerte Fingerabdrücke mathematisch berechnen den Anteil der einzelnen Fluorophors in der Lambda Stack mit der GFP und YFP-Intensität in einzelnen Kanäle in G. trennen </li><li> Mit der gleichen Strategie, gelten Linear Unmixing-Funktion mit gespeichert GFP und Hintergrund-Emission Fingerabdrücke mathematisch berechnen GFP-Intensität in PH-Zellen. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: <ol><li> Ein hervorragendes Modellsystem von D. discoideum für GPCR-vermittelte Chemotaxis. Eine soziale Amöbe, D. discoideum zeigt eine markante Chemotaxis während des Lebenszyklus. Aufgrund seiner genetischen und biochemischen Vorteile bietet D. d eine starke system zu studieren Chemotaxis. </li><li> Chemotaxis von Zellen unter einem sichtbaren und manipulierbare chemoattract Felder aus. Hier zeigen wir zunächst eine einfache Methode, um eine lineare Beziehung zwischen cAMP-Konzentration und die Intensität der einen Fluoreszenzfarbstoff Alexa 594 durch eine Verdünnungsreihe von 2 pM cAMP mit 10 pg / mL gemischt erhalten Alexa 594 (Abb. 2A). Als nächstes stellen wir eine einfache Möglichkeit, den Verlauf visualisieren darüber hinaus eine quantitative Messung der cAMP-Konzentration eines Gradienten von der Intensität der Alexa 594 (Abb. Abb.. 2B) zu etablieren. </li><li> Zellbewegung ist mit Zell-Polarisation und Richtungserkennung entkoppelt. Eine Aktin Polymerisationsinhibitor eliminiert bereits bestehenden morphologischen Polarität und verhindert auch, dass Zellbewegung unter Beibehaltung der Zellen Fähigkeit Richtungserkennung (Abb. 3A). Beschäftigung von sichtbaren und manipulierbare cAMP Stimulation garantiert die Eingabe, zum Beispiel einheitlich angewandt Anregungen oder einen Farbverlauf. Diese Methode erlaubt eine quantitative Analyse der cAMP-induzierte Umverteilung der Taste signalisiert Komponenten in der Steigung sensing Maschinen. Gemessen raumzeitliche Dynamik dieser Signalkomponenten ermöglichen es uns zu verstehen, wie die Signalisierung Netzwerk Anpassung erreicht, um eine einheitliche Anregungen bei der Erzeugung polarisierten biochemische Reaktionen auf Gradienten (Abb. 3B). </li><li> Systemische Messungen der Kinetik der chemosensing Signalisierungsnetz bei Einwirkung einer stetigen Steigung. Es ist wichtig, um die Dynamik / Kinetik der Richtungs-Sensing-Signalkomponenten zu verstehen, wie jede Komponente trägt zum Aufbau der intrazellulären Polarisation, wenn die Zellen ersten Gradienten Erfahrung zu messen. Die Anwendung des Live Cell Imaging mit einem hohen Tempo-räumlichen Auflösung zeigen wir zunächst einen biphasischen PIP3 Produktion von Zellen, die zu einem stetigen cAMP-Gradienten (Abb. 4A-C) ausgesetzt ist. Anwenden von Live Cell Imaging, haben wir systematisch Dynamik der gemessenen direktionalen-Sensing-spezifische Signalisierung Netzwerk von cAMP Stimulation PIP3 Produktion (Abb. 4D, E). </li><li> Gleichzeitige Überwachung heterotrimeren G-Protein-Aktivierung und PIP 3-Produktion auf einheitlich angewandt cAMP Stimulation. Förster resonance energy transfer (FRET abgekürzt) bietet einen effizienten Ansatz zur heterotrimeren G-Protein-Aktivierung (Dissoziation) auf cAMP Stimulation zu überwachen. Hier beschrieben wir eine bequeme einfach übernehmen für eine gleichzeitige Messung von heterotrimeren G-Protein-Aktivierung und PIP 3-Produktion durch die Überwachung der FRET ändern und Membran-Translokation von PIP 3-Sonde, PH-GFP in G und PH-Zellen, bzw. (Abb. 5 ). Ein einheitlich angewandt cAMP Stimulation löst ein hartnäckiges G-Protein-Aktivierung, während die Auslöser einer transienten PIP 3-Produktion. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1: Ein hervorragendes Modellsystem von D. discoideum für GPCR-vermittelte Chemotaxis. A. Schema zeigt eine kurze Signalweg des Richtungserkennung. B. cAMP Gradienten induziert eine schnelle Chemotaxis von D. discoideum Zellen. Zellen exprimieren PIP 3-Sonde, PH-GFP (Green). Gradient (Red) wird visualisiert durch Alexa 594. Balken = 50 um. <img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2: Chemotaxis von Zellen unter einem sichtbaren und manipulierbare chemoattract Felder aus. A. Graph zeigt eine lineare Beziehung zwischen cAMP-Konzentration und die Intensität der einen Fluoreszenzfarbstoff Alexa 594 durch eine Verdünnungsreihe von 2 pM cAMP mit 10 pg / mL Alexa 594 gemischt. B. Quantitative Messung der cAMP-Konzentration eines Gradienten von der linearen Beziehung der cAMP-Konzentration und Intensität der fluoreszierenden Farbstoff Alexa 594 in A. <img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3: Cell Motilität ist mit Zell-Polarisation und Richtungserkennung entkoppelt. A. Bild zeigt, dass immobile Zellen durch die Behandlung von Aktin Polymerisationsinhibitor Latrunculin B die Fähigkeit Richtungserkennung aufrecht zu erhalten. Zellen exprimieren PIP 3-Sonde, PH-GFP (Green). Gradient (Red) wird visualisiert durch Alexa 594. B. manipulierbare cAMP Stimulation und immobile Zelle System erlaubt es, zentrale Fragen der Richtungserkennung Adresse. Balken = 10 um. <img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4: Systemische Messungen der Kinetik der chemosensing Signalisierungsnetz bei der Belichtung zu einem stetigen Gefälle. A. Montage zeigt eine biphasische PIP 3-Produktion (Grüne) der Zelle, die zu einem stetigen cAMP-Gradienten (Red) ausgesetzt ist. B. Das Bild zeigt die Regionen von Interesse (ROI) für die Messung der Kinetik der PIP 3-Produktion in C. C vorgestellt . Kinetics of PIP 3-Produktion in den Zellen, die einen stetigen Verlauf. D. Schema zeigt die Signalisierung Netzwerk von Richtungserkennung von cAMP Stimulation PIP 3-Produktion. Ihre Kinetik bei der Belichtung mit einem stetigen Gefälle ist in der gleichen Farbe durchgezogenen Linien in E vorgestellt. <img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5: Gleichzeitige Überwachung multi-Ereignisse von GPCR Signalnetzwerke. A. Schema zeigt die gleichzeitige Messung von heterotrimeren G-Protein-Aktivierung und PIP 3-Produktion durch die Überwachung der FRET ändern und Membran-Translokation von PIP3 Sonde, PH-GFP in G und PH Zellen. B. Montage der Regenbogen Bilder von G-und PH-Zellen zeigt dass eine einheitliche Anwendung der cAMP Stimulation löst ein hartnäckiges G-Protein-Aktivierung in der Zelle peripheren, während die Auslöser einer transienten PIP3 Produktion. Die Zeitpunkte sind vor (0s) und nach Stimulation für 4,9 s, 10.2s und 20.4s. C. Kinetik der G-Protein-Aktivierung und PIP3 Produktion auf eine einheitliche Anwendung der cAMP Stimulation.

<ol><li>Lijima, M., Huang, Y. E., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spatial+regulation+of+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Temporal and spatial regulation of chemotaxis.</a> Dev Cell. 3, 469-469 (2002).</li>
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<li>Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+mechanism+of+a+GPCR+and+a+heterotrimeric+G+protein+during+chemoattractant+gradient+sensing+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Coupling mechanism of a GPCR and a heterotrimeric G protein during chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium.</a> Sci Signal. 3, 71-71 (2010).</li>
<li>Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Jiao, X., Nelson, L. E., Jin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+single+live+cells+reveals+spatiotemporal+dynamics+of+multistep+signaling+events+of+chemoattractant+gradient+sensing+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of single live cells reveals spatiotemporal dynamics of multistep signaling events of chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium.</a> Mol Biol Cell. 16, ra71-ra71 (2005).</li>
<li>Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Yan, J., Jin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locally+controlled+inhibitory+mechanisms+are+involved+in+eukaryotic+GPCR-mediated+chemosensing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Locally controlled inhibitory mechanisms are involved in eukaryotic GPCR-mediated chemosensing.</a> J. Cell Biol. 178, 141-141 (2007).</li>
<li>Jin, T., Zhang, N., Long, Y., Parent, C. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+G+protein+betagamma+complex+in+living+cells+during+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Localization of the G protein betagamma complex in living cells during chemotaxis.</a> Science. 287, 1034-1034 (2000).</li>
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<li>Funamoto, S., Milan, K., Meili, R., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+phosphatidylinositol+3%27+kinase+and+a+downstream+pleckstrin+homology+domain-containing+protein+in+controlling+chemotaxis+in+dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of phosphatidylinositol 3' kinase and a downstream pleckstrin homology domain-containing protein in controlling chemotaxis in dictyostelium.</a> J. Cell Biol. 153, 795-795 (2001).</li>
<li>Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+PLC-beta2+and+-beta3+and+PI3Kgamma+in+chemoattractant-mediated+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Roles of PLC-beta2 and -beta3 and PI3Kgamma in chemoattractant-mediated signal transduction.</a> Science. 287, 1046-1046 (2000).</li>
<li>Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+Ras+signaling+at+the+leading+edge+regulates+PI3K%2C+cell+polarity%2C+and+directional+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement.</a> J. Cell Biol. 167, 505-505 (2004).</li>
<li>Meili, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoattractant-mediated+transient+activation+and+membrane+localization+of+Akt%2FPKB+is+required+for+efficient+chemotaxis+to+cAMP+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Chemoattractant-mediated transient activation and membrane localization of Akt/PKB is required for efficient chemotaxis to cAMP in Dictyostelium.</a> EMBO J. 18, 2092-2092 Forthcoming.</li>
<li>Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein+signaling+events+are+activated+at+the+leading+edge+of+chemotactic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">G protein signaling events are activated at the leading edge of chemotactic cells.</a> Cell. 95, 81-81 (1998).</li>
<li>Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+regulation+of+3-phosphoinositides+by+PI+3-kinase+and+PTEN+mediates+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal regulation of 3-phosphoinositides by PI 3-kinase and PTEN mediates chemotaxis.</a> Cell. 109, 611-611 (2002).</li>
<li>Iijima, M., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+suppressor+PTEN+mediates+sensing+of+chemoattractant+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor suppressor PTEN mediates sensing of chemoattractant gradients.</a> Cell. 109, 599-599 (2002).</li>
<li>Haastert, P. J. V. an, Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis%3A+signalling+the+way+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis: signalling the way forward.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 626-626 (2004).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Prozesse der chemotaktischen kompetente Stadium von Zellen Für Wildtyp D. discoideum Zellen, dauert es etwa 5 ~ 6 Stunden pulsierende Entwicklung bei Raumtemperatur, um sie in einem gut chemotaktische kompetente Stadium, in dem Zellen zeigen eine gut polarisiert zelluläre Morphologie und schnelle Zellmigration (Abb. 1) zu induzieren. Mehrere Faktoren, wie zum Beispiel cAMP-Konzentration für die Taktung, Temperatur und verschiedenen genetischen Hintergründen, kann sich auf den Proze...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> D3-T Growth Medien </td><td> KD Medical </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Koffein </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Latrunculin B </td><td> Molecular Probes </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Alexa 594 </td><td> Molecular Probes </td><td></td><td></td></tr><tr><td> cAMP </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ChronTrol XT programmierbaren Timer </td><td> ChronTrol Corp </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Miniplus 3 Schlauchpumpe </td><td> Gilbson </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Platform Rotationsschüttler </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> FemtoJet Mikrokapillare Druckversorgung </td><td> Eppendorf </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Einzel-und vier-und Lab-Tek II Deckglas Kammern </td><td> Nalge Nunc International </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LSM 510 META oder gleichwertig Fluoreszenzmikroskop </td><td> Zeiss </td><td></td><td> einem 40X 1,3 NA oder 60X 1.4 NA Öl DIC Plan-Neofluar Objektiv </td></tr><tr><td> Olympus X81 oder gleichwertig </td><td> Olymp </td><td></td><td> Benötigt ein 100X 1,47 NA TIRF Objektiv </td></tr></tbody></table>

imaging g-protein-gekoppelten rezeptor (gpcr)-vermittelten signaltransduktion, die steuerung der chemotaxis dictyostelium discoideum</em

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Viele eukaryotischen Zellen können Steigungen von chemischen Signalen in ihrer Umgebung erkennen und wandern entsprechend 1. Diese geführte Zellmigration als Chemotaxis, die wesentlich für verschiedene Zellen zur Erfüllung ihrer Funktionen wie Handel von Immunzellen und Strukturierung von neuronalen Zellen 2, 3 bezeichnet wird. Eine große Familie von G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) erkennt variable kleine Peptide, wie Chemokine bekannt, die Zellmigration in vivo 4 Direktwahltasten. Das Endziel der Chemotaxis Forschung ist zu verstehen, wie ein GPCR Maschinen Sinne Chemokin-Gradienten und steuert Ereignisse, die zu Chemotaxis-Signalisierung. Zu diesem Zweck haben wir bildgebende Techniken verwenden, um zu überwachen, in Echtzeit, räumlich-zeitliche Konzentrationen von Lockstoffen, Zellbewegung in einem Gefälle von Lockstoff, vermittelt GPCR Aktivierung heterotrimerer G-Protein-und intrazellulären Signalwege in Chemotaxis von eukaryotischen Zellen 5-8 beteiligt . Die einfache eukaryotischen Organismus, Dictyostelium discoideum, zeigt chemotaxic Verhaltensweisen, die ähnlich denen der Leukozyten, und D. discoideum ist ein wichtiges Modellsystem für die Untersuchung eukaryotischer Chemotaxis. Wie frei lebenden Amöben, D. discoideum Zellen teilen in Vollmedium. Bei Hunger, in die Zellen eine Entwicklungsstörung Programm, in dem sie durch cAMP-vermittelte Chemotaxis Aggregat multicullular Strukturen zu bilden. Viele Komponenten in Chemotaxis auf cAMP beteiligt haben in D. identifiziert discoideum. Die Bindung von cAMP an einem GPCR (car1) induziert Dissoziation heterotrimerer G-Proteine ​​in Gγ und Gβγ-Untereinheiten 7, 9, 10. Gβγ-Untereinheiten aktivieren Ras, was wiederum aktiviert PI3K, Konvertieren PIP 2 in PIP 3 auf der Zellmembran 11-13. PIP 3 dienen als Bindungsstellen für Proteine ​​mit Pleckstrin Homologie (PH)-Domänen, wodurch Rekrutierung dieser Proteine ​​auf die Membran 14, 15. Die Aktivierung der Rezeptoren car1 steuert auch die Membran Verbände der PTEN, die PIP 3 dephosphoryliert PIP 2 16, 17. Die molekularen Mechanismen sind evolutionär in Chemokin GPCR-vermittelte Chemotaxis von humanen Zellen wie Neutrophile 18 erhalten. Wir präsentieren folgende Methoden zur Untersuchung von Chemotaxis von D. discoideum Zellen. 1. Vorbereitung der chemotaktische Komponente Zellen. 2. Imaging Chemotaxis von Zellen in einem cAMP-Gradienten. 3. Überwachung eines GPCR induzierte Aktivierung von heterotrimeren G-Protein in einzelnen lebenden Zellen. 4. Imaging chemoattractant ausgelösten dynamischen PIP 3 Antworten in einzelnen lebenden Zellen in Echtzeit. Unsere entwickelten bildgebenden Verfahren angewendet, um Chemotaxis von humanen Leukozyten zu studieren.

Hier beschreiben wir detailliert Live Cell Imaging Verfahren zur Untersuchung Chemotaxis. Wir präsentieren fluoreszenzmikroskopische Methoden zur raum-zeitlichen Dynamik der Signalwege bei der Migration von Zellen zu überwachen. Die Messung der Signal-Ereignisse ermöglicht es uns, besser zu verstehen, wie ein GPCR-Signalisierung Netzwerk Gradienten Erfassung Lockstoffe und steuert direktionale Migration von eukaryotischen Zellen erreicht.

Imaging G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR)-vermittelten Signaltransduktion, die Steuerung der Chemotaxis Dictyostelium discoideum</em

Viele eukaryotische Zellen können Gradienten chemischer Signale in ihrer Umgebung detektieren und entsprechend migrieren 1. Diese gesteuerte Zellmigration wird als ... bezeichnet.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe der fortschrittlichen fluoreszenzkonfokalen Mikroskopie die räumlich-zeitlichen Dynamiken von Signalereignissen während der Chemowahrnehmung in Dictyostelium discoideum-Zellen zu verfolgen. Zunächst werden chemotaktisch kompetente Dictyostelium discoideum-Zellen hergestellt. Anschließend wird ein kontrollierter Chemoattraktantengradient abgebildet, um einen linearen Zusammenhang zwischen der Chemoattraktantenkonzentration und der fluoreszierenden Intensität des Chemoattraktanten nachzuweisen. Im dritten Schritt wird ein immobilisiertes Zellsystem zur Abbildung der an der zyklischen AMP-Gradientenwahrnehmung beteiligten Signalereignisse gewonnen.Der letzte Schritt besteht darin, zwei durch GPCRs kontrollierte Signalevents in lebenden Zellen gleichzeitig zu überwachen: die Aktivierung heterotrimerer G-Proteine und die Produktion von PIP3. Schließlich können räumliche und zeitliche Änderungen der Fluoreszenzintensitäten in einzelnen Zellen, die mit einem Chemoattractans stimuliert werden, beobachtet werden. Cyclisches AMP kann mittels Live-Cell-Imaging und fortschrittlicher konfokaler Mikroskopie sichtbar gemacht werden.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, räumlich-zeitliche Informationen über Signalereignisse in lebenden Zellen zu erhalten. Solche Lebensstil-Messungen ermöglichen ein besseres Verständnis dafür, wie das A-G-P-C-R-Signalnetzwerk einen chemotaktischen Wirkstoff erkennen und angemessene Reaktionen auslösen kann. Die Durchführung der Prozedur übernimmt Dr. Shu, ein Experte für Lebensstil-Bildgebungsmethoden. Um Dsco-Dium-Zellen zu erzeugen, die chemotaktisch auf den Chemoattraktor zyklisches A MP reagieren, ernten Sie Zellen, die in D-drei-Trich-Medium in einer schüttelnden Kultur bei 22 Grad Celsius wachsen.Die Zellen zweimal durch Zentrifugation bei 400 Gs für fünf Minuten in einem nährstofffreien Entwicklungs-Puffer waschen. Die Zellen bei Raumtemperatur in DB-Puffer mit einer Dichte von zwei mal 10 hoch sieben Zellen pro Milliliter resuspendieren. 20 Millionen Zellen in 10 Milliliter Entwicklungs-Puffer in einen 250-Milliliter-Kolben überführen und eine Stunde lang bei 100 U/min bei 22 Grad Celsius schütteln.Geben Sie dann über die nächsten sechs Stunden alle sechs Minuten je 100 Mikroliter einer 7,5-Mikromolar-cAMP-Stammlösung zu den 10 Millilitern Zellen, um eine Endkonzentration von 75 Nanomolar cAMP zu erreichen. Sammeln Sie nun die cAMP-Chemoattraktans-fähigen Zellen durch Zentrifugation bei 200 × g und resuspendieren Sie die Zellen in DB-Puffer, der 2,5 Millimolar Koffein enthält. Schütteln Sie die Zellen erneut 20 Minuten lang bei 22 Grad Celsius mit 200 U/min, um die Zellen für die Chemotaxis vorzubereiten.Füllen Sie zunächst eine Mikropipette mit einer frisch hergestellten 30-Milliliter-Lösung aus ein Mikromolar zyklischem A MP und Alexa 5 94 bei 0,1 Mikrogramm pro Mikroliter in DB-Puffer nach. Befestigen Sie dann eine Femto-Spitze an einem Mikropipettenhalter und verbinden Sie den Schlauch mit einer Druckversorgungsvorrichtung. Um einen stabilen Gradienten zu erzeugen, befestigen Sie die Mikropipettenanordnung an einem motorisierten Mikromanipulator.Füllen Sie eine Einzelkammer einer Labortechnik mit sechs Millilitern DB-Puffer und montieren Sie die Kammer anschließend über einer 40x-Öl-Immersionsoptik auf einem konfokalen Mikroskop, wobei Sie Brightfield-Optik verwenden, um den Femto-Tipp im Sichtfeld zu zentrieren. Schalten Sie danach die Druckversorgung ein und stellen Sie den Kompensationsdruck auf 70 Hektopascal ein, um einen Gradienten aus der cAMP-Alexa-594-Mischung zu erzeugen. Visualisieren Sie den cAMP-Gradienten, indem Sie die Mischung der gewünschten cAMP-Konzentration und der Alexa-594-Fluoreszenz mithilfe einer Anregung mit einer 543-Nanometer-Laserlinie überwachen.Verwenden Sie abschließend die automatische Positionierungsfunktion des Mikromanipulators, um die Mikropipette in die gewünschten Positionen zu bringen, und legen Sie nacheinander Position eins, Position zwei und Position drei fest, um den Gradienten zu steuern, dem die Zellen ausgesetzt sind. Nach der Behandlung mit Koffein entnehmen Sie eine Aliquotprobe der Zellen und pelletieren die Zellen bei 500 Gs für drei Minuten. Entfernen Sie bei Raumtemperatur den Puffer und verdünnen Sie die Zellen auf fünf mal 10 hoch fünf Zellen pro Milliliter.Mit frischem DB-Puffer, der 2,5 Millimolar Koffein enthält. Anschließend ein Milliliter der Zellsuspension in eine Einzelkammer hinzufügen. Nachdem die Zellen 10 Minuten zur Adhäsion Zeit hatten, den Puffer vorsichtig abpipettieren, um nicht angeheftete Zellen zu entfernen, und dann durch das gleiche Volumen frischen DB-Puffers mit Koffein ersetzen, um die Bildaufnahme zu beginnen, und die gewünschten Zellen unter dem Mikroskop lokalisieren.Dann, um die Dynamik der Signalbestandteile in Zellen zu überwachen, die einem konstanten Gradienten ausgesetzt sind. Behandeln Sie die Zellen vor jedem Experiment 10 Minuten lang mit fünf Mikromolar LA truculent B. Dieses Schema zeigt einen kurzen Signalweg der Richtungswahrnehmung in diesem Film.Es ist ersichtlich, wie ein zyklischer cAMP-Gradient eine schnelle Chemotaxis von D. discost-Zellen, Zellen, die den PIP₃-Sonde exprimieren, induziert. P-H-G-F-P erscheint grün. Der durch Alexa 594 sichtbar gemachte Gradient erscheint rot. Hier.Eine einfache Methode, um eine lineare Beziehung zwischen der Konzentration von cyclischem AMP und der Intensität eines fluoreszierenden Farbstoffs herzustellen. Gezeigt ist eine Verdünnungsreihe von zwei Mikromolar cyclischem AMP, gemischt mit 10 Mikrogramm pro Milliliter Alexa 594.Danach wird grafisch eine einfache Methode zur quantitativen Bestimmung der zyklischen AMP-Konzentration eines Gradienten anhand der Intensität von Alexa 594 veranschaulicht. Diese Abbildung zeigt, wie Zellen, deren Motilität durch Latrunculin B, einen Aktinpolymerisationsinhibitor, unterdrückt wurde, dennoch ihre Richtungssinnesfähigkeit beibehalten. Die Zellen exprimieren die PIP₃-Sonde P-H-G-F-P und erscheinen grün, während der Gradient in Rot durch Alexa 594 sichtbar gemacht wird.In diesem Film ist zu sehen, wie mithilfe eines unpolarisierten vereinfachten Zellsystems und einer gezielten zyklischen AMP-Stimulation grundlegende Fragen der Richtungswahrnehmung untersucht werden können. Um die Anwendung der Live-Cell-Imaging-Technik mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung zu demonstrieren, wird hier eine grün dargestellte Zelle gezeigt, die eine biphasische Expression von PIP3 als Reaktion auf einen konstanten zyklischen AMP-Gradienten in Rot aufweist.Dieses Bild zeigt die interessierenden Bereiche zur Messung der Kinetik der PIP-drei-Produktion. Die Kinetik der PIP-drei-Produktion an der Vorder- und Rückseite der Zellen nach Exposition gegenüber einem stabilen Gradienten wird hier dargestellt, wobei die PIP-drei-Produktion an der Vorder- und Rückseite jeweils in Schwarz bzw. Grau dargestellt ist. Mithilfe der Live-Cell-Bildgebung haben wir systematisch die Dynamik eines richtungssensitiven Signalnetzwerks von der zyklischen-AMP-Stimulation bis hin zur PIP-drei-Produktion gemessen.Dieses Schema zeigt das Signalnetzwerk der Richtungswahrnehmung von der zyklischen AMP-Stimulation bis hin zur PIP3-Produktion. Die Kinetik jedes Bestandteils wird mit einer Linie in derselben Farbe dargestellt. In dieser ersten Abbildung wird in diesem Film gezeigt, wie eine gleichmäßig angelegte zyklische AMP-Stimulation eine anhaltende Aktivierung der G-Proteine auslöst, die wiederum eine vorübergehende PIP3-Produktion auslöst.Eine Vielzahl von Bildern von G- und pH-Zellen zeigt, dass eine gleichmäßig angelegte zyklische AMP-Stimulation eine anhaltende Aktivierung der G-Proteine an der Zellperipherie auslöst, die gleichzeitig eine vorübergehende Produktion von PIP drei auslöst. Hier sind die Kinetik der G-Protein-Aktivierung und die Produktion von PIP drei nach einer gleichmäßig angelegten zyklischen AMP-Stimulation dargestellt. Bei der Durchführung dieser Experimente ist es wichtig, im Hinterkopf zu behalten, dass der Schlüssel darin besteht, reaktive Zellen zu erhalten, die je nach genetischem Hintergrund der Zellen und Umweltbedingungen variieren können.Die Bedingungen der Bildaufnahme verändern sämtliche zellulären physiologischen Prozesse und können die Zelle weniger reaktionsfähig machen. Mithilfe dieses Verfahrens kann die computergestützte Modellierung angewendet werden, um weitere Fragen zu beantworten, beispielsweise wie dynamische Wechselwirkungen innerhalb eines Signalnetzwerks zu einem bestimmten Zellverhalten führen. Diese Methoden ebnen den Weg für Forschende auf dem Gebiet der eukaryotischen Chemotaxis.Wir können ein rechnergestütztes Modell der Chemoattraktant-Wahrnehmung entwickeln. Dieses Modell kann verwendet werden, um die Dynamik eines Signalereignisses zu simulieren. Das Zusammenspiel zwischen Modellverbesserung und der Lebensstil-Messung kann zu einem tieferen Verständnis der Chemotaxis führen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, hoffen wir, dass Sie nun ein besseres Verständnis dafür haben, wie man die fortschrittliche fluoreszenzkonfokale Mikroskopie anwendet, um Signalevents in lebenden Zellen zu beobachten. Wir hoffen, dass Sie diese Methode in Ihrer Forschung anwenden können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die ECIS / Taxis-System ist ein automatisiertes Echtzeit-Assay misst die zelluläre Chemotaxis. In diesem Assay verschieben Zellen unter einer Schicht aus Agarose auf ein Ziel Elektrode ankommt. Zelluläre Bewegung wird durch das Einsetzen des Widerstands in Wechselstrom 0 gemessen.

Messung zellulärer Chemotaxis mit ECIS / Taxis

Verfahren zur quantitativen Bewertung der chemotaktischen Reaktion...

C. elegans Chemotaxis-Assay

Die hier beschriebene Fluoreszenz-basierten Calciummobilisierungsassay ist ein Medium-Durchsatz Rückwärts pharmakologischen Screening-System für die Identifizierung von funktionell aktivierenden Liganden (n) der Orphan-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs).

Charakterisierung von G-Protein gekoppelten Rezeptoren durch eine Fluoreszenz-basierte Calciummobilisierungsassay

Visual-Chemotaxis-Assays sind für ein besseres Verständnis, wie eukaryotische Zellen steuern chemoattractant vermittelten Richtungszellmigration. Hier beschreiben wir detaillierte Methoden für: 1) in Echtzeit, hochauflösende Überwachung mehrerer Chemotaxis-Assays und 2) gleichzeitig die chemische Lockstoffe Gradienten zu visualisieren und die räumlich-zeitliche Dynamik der Ereignisse in Neutrophilen wie HL60-Zellen signalisiert.

Imaging G Protein-gekoppelten Rezeptor-vermittelte Chemotaxis und seine Signalereignisse in Neutrophilen-like HL60-Zellen

Die Verwendung eines angepassten "olfaktorischen Chips" für die effiziente Kalzium Imaging von C. Elegans Männchen ist hier beschrieben. Studien über männliche Einwirkung von Glycerin und ein Pheromon werden ebenfalls angezeigt.

Verwenden einen angepasste mikrofluidischen olfaktorische Chip für die Bildgebung neuronaler Aktivität als Reaktion auf Pheromone in männlichen C. Elegans Kopf Neuronen

Hier beschreiben wir Methoden zur Bewertung der zelluläre Reaktion auf akute mechanische Stimulation. In der Mikroskopie-basierten Test untersuchen wir Lokalisierung von Eindringmittel beschriftet Biosensoren nach kurzer Stimulation mit Schubfluss. Wir testen auch biochemisch Aktivierung verschiedener Proteine des Interesses in Reaktion auf akute mechanische Stimulation.

Bewertung von Dictyostelium Discoideum Reaktion auf akute mechanische Stimulation

Beschriebenen zelluläre Assay dient zur Identifizierung der CXC-Chemokin-Rezeptor 4 (CXCR4)-interaktiver Agenten, die hemmen oder fördern, kompetitiv oder allosterically, die intrazelluläre Ca2 + Release von CXCR4 Aktivierung initiiert.

Eine kinetische Fluoreszenz basierenden Ca2 + Mobilisierung Assay, G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Agonisten und Antagonisten allosterische Modulatoren zu identifizieren

S1P entfaltet seine vielfältigen physiologischen Wirkungen über die Unterfamilie der S1P-Rezeptoren (S1PRs). Hier wird eine Pipeline beschrieben, um die Strukturen und Funktionen von S1PRs zu erläutern.

Eine Pipeline zur Untersuchung der Strukturen und Signalwege von Sphingosin-1-phosphat-Rezeptoren

In dieser Arbeit wird ein intrazellulärer Hochdurchsatz-Calciumfluoreszenz-Assay für 384-Well-Platten beschrieben, um kleine Molekülbibliotheken auf rekombinanten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) zu screenen. Das Ziel, der Kinin-Rezeptor aus der Rinderpestzecke Rhipicephalus microplus, wird in CHO-K1-Zellen exprimiert. Dieser Assay identifiziert Agonisten und Antagonisten unter Verwendung der gleichen Zellen in einem "Dual-Addition"-Assay.

Ein "Dual-Addition"-Calciumfluoreszenz-Assay für das Hochdurchsatz-Screening von rekombinanten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren

Durch den Einsatz einer spektral aufgelöste Zwei-Photonen-Mikroskopie-System sind auf Pixel-Ebene Karten von Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Wirkungsgrade für Zellen, die Membran-Rezeptoren angenommen, dass sie homo-oligomeren Komplexen Form erhalten. Von der Effizienz Karten FRET, sind wir in der Lage, stöchiometrische Informationen über die Oligomer-Komplex unter-Studie zu schätzen.

In vivo Quantifizierung der G Protein-gekoppelten Rezeptor-Wechselwirkungen mit spektral aufgelöste Zwei-Photonen-Mikroskopie

Lernen Sie die fortgeschrittene Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung der Chemotaxis bei Dictyostelium discoideum. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung räumlich-zeitlicher Signaldynamiken in lebenden Zellen.

Imaging G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR)-vermittelten Signaltransduktion, die Steuerung der Chemotaxis Dictyostelium discoideum /em (Video) | JoVE Journal

Imaging G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR)-vermittelten Signaltransduktion, die Steuerung der Chemotaxis Dictyostelium discoideum

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