Tracking Morphogenetic Tissue Verformungen in der frühen Hühnerembryo

Das übergeordnete Ziel der hier vorgestellten Techniken besteht darin, embryonales Gewebe zu markieren und zu kultivieren, um morphogenetische Deformationen während der frühen Entwicklung zu messen. Für die Kultur des frühen Hühnerembryos beginnen wir mit der Entnahme des Embryos aus der Eizelle unter Verwendung einer Filterpapierträgermethode. Je nach experimenteller Anwendung wird der extrahierte Embryo mit fluoreszierenden lipophilen Farbstoffen markiert, die über magnetische Eisenpartikel oder mit Polystyrol-Mikrosphären abgegeben werden. Als nächstes verfolgen Sie die Markierungen während der Kultur mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie oder der optischen Kohärenztomographie.

Die daraus resultierenden bildgebenden morphogenetischen Dehnungskarten zeigen Regionen mit Gewebedehnung, -verkürzung und -scherung sowohl in zwei als auch in drei Dimensionen. Hallo, mein Name ist Ben Philis und ich bin Doktorand im Labor von Dr. Larry Tabor am Department of Biomedical Engineering an der Washington University in St. Louis. Bevor Sie mit dieser Art von Experimenten beginnen, ist es wichtig, relevante Gewebekulturtechniken in Ihrem Modellsystem, Bildgebungsmodalitäten, zu denen Sie möglicherweise Zugang haben, und auch die Art der Daten, die Sie von Ihren Experimenten erwarten, zu berücksichtigen.

Interessieren Sie sich zum Beispiel für die Analyse von Gewebeverformungen in zwei oder drei Dimensionen? Wir gehen heute auf einige dieser Fragen ein, indem wir zwei komplementäre Markierungstechniken am frühen Hühnerembryo zeigen. Hallo, mein Name ist Victor Varner und ich arbeite im Labor von Dr. Larry Tabor an der Washington University in St. Louis.

Bei beiden Techniken markieren wir schnell und gleichzeitig Hunderte von Zellen im frühen Chick-Embryo. Die Verfolgung der Bewegung dieser Markierungen ermöglicht es uns dann nicht nur, das Gewebe zu bestimmen, in dem sich diese Zellen schließlich niederlassen, sondern auch die Verformung auf Gewebeebene zu quantifizieren, die den frühen Embryo formt. Inkubieren Sie die Eier zunächst in Längsrichtung bis zum gewünschten Stadium, wie es durch Hamburger und Hamilton definiert ist.

Den Boden des Eies an der Seite einer 150 Millimeter großen Petrischale aufschlagen. Ziehen Sie die Schale von unten auseinander, leeren Sie den Inhalt des Eies in die Schüssel und entfernen Sie mit einer stumpfen Zange das dickflüssigere Albumin aus dem Eigelb. Stanzen Sie nun Löcher durch die Mitte eines kreisförmigen Filterpapiers.

Lege einen der Filterpapierringe so auf das Eigelb, dass der Embryo durch das mittlere Loch des Rings sichtbar ist. Schneiden Sie den äußeren Umfang des Filterpapierrings mit einer Mikroschere ab. Entfernen Sie dann das Papier mit dem anhaftenden Embryo mit einer feinen Pinzette aus dem Eigelb und weichen Sie den Embryo vorsichtig in einem PBS-Bad ein. Um anhaftende Dotterpartikel zu entfernen, geben Sie die Filterpapierbaugruppe in eine 35-Millimeter-Kulturschale.

Legen Sie es mit der Bauchseite nach oben und senden Sie den Embryo mit einem zweiten Filterpapierring. Befestigen Sie ihn mit einem Metallring und tauchen Sie den Embryo in Kulturmedium ein. Wenn der Embryo nicht vollständig untergetaucht ist, können die Gewebegeometrie und die anschließende Morphogenese durch ungewöhnlich hohe Oberflächenspannungsbelastungen stark verändert werden.

Überprüfen Sie während der Kultur mit einem Hellfeldmikroskop die richtige Morphologie und das Embryonalstadium. Nehmen Sie zuerst eine kleine Menge Eisenpulver und fügen Sie ein paar Tropfen gesättigten Farbstoff und Alkohol hinzu und trocknen Sie es an der Luft mit einer Spitze einer gezogenen Mikropipette. Brechen Sie die verklumpten Eisenpartikel auf und geben Sie sie in ein Mikrozentrifugenröhrchen.

Nach mehreren Spülungen, die mit dem ionisierten Wasser bedeckt sind, wird die dorsale Stelle des entnommenen Embryos in eine 35 Millimeter große Kulturschale gelegt, die mit einer großzügigen Schicht Kulturmedium bedeckt ist. Verwenden Sie unter einem Präpariermikroskop die Glasnadel, um die Vilinmembran zu entfernen und die elektrodermalen Zellen freizulegen. Zeichnen Sie nun eine Säule mit markierten Eisenpartikeln in eine Peor-Pipette.

Tauchen Sie die Pipette mit dem Präpariermikroskop so ein, dass sie sich knapp über dem Embryo befindet. Rollen Sie die Pipette langsam zwischen den Fingerspitzen hin und her, um Partikel über den Embryo zu streuen. Nach einer 10-minütigen Inkubation bei 37 Grad Celsius entfernen Sie die Partikel mit einem starken Magneten.

Befestigen Sie den Magneten bei Bedarf an einem magnetischen Paar feiner Pinzetten und entfernen Sie mit der magnetisierten Pinzette vorsichtig alle verbleibenden Eisenpartikel. Fahren Sie fort, um sowohl Hellfeld- als auch Fluoreszenzbilder des Embryos aufzunehmen. Mit einer 22-Gauge-Nadel.

Ziehen Sie eine Lösung aus schwarzen Mikrokügelchen mit einem Durchmesser von 10 Mikrometern in PBS in eine 10-cm³-Spritze. Dann die Spitzen der gezogenen Glasnadeln mit einer Computerfestplatte abschrägen und mit Bead-Lösung füllen. Schnippen Sie mit der Mikropipette leicht, damit die Lösung mit einem Mikromanipulator die Spitze erreicht.

Platzieren Sie die Glasnadel im gleichen Sichtfeld wie der Embryo. Bestätigen Sie, dass die Kügelchen aus der Pipettenspitze fließen. Führen Sie nun die Pipettenspitze in das Lumen des Gehirnschlauchs ein.

Achten Sie darauf, den ventralen Boden des Gewebes nicht zu durchbohren. Überwachen Sie die vorübergehende Schwellung des Gewebes, wenn Kügelchen und Flüssigkeit in das Lumen gelangen. Entfernen Sie dann schnell die Glasnadel.

Überprüfen Sie abschließend eine ausreichende Bead-Dichte im inneren Lumen des Gehirnrohrs. Lassen Sie die Kügelchen mit einem Hellfeldmikroskop 20 bis 30 Minuten lang ruhen, bevor Sie Hellfeldbilder oder einen optischen Kohärenztomographie-Datensatz aufnehmen. Nachdem Sie die ersten Bilder aufgenommen haben, legen Sie bis zu 7 35-Millimeter-Kulturschalen mit Proben in eine 150-Millimeter-Petrischale und legen Sie die gesamte Anordnung in einen kleinen Plastikbeutel.

Geben Sie zur Befeuchtung Tropfen entionisiertes Wasser in den Beutel und füllen Sie den Beutel dann mit einer Mischung aus 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid. Legen Sie die Embryonen bis zum nächsten Bildgebungszeitpunkt in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Legen Sie die markierten Embryonen in eine Delta-T-Schale mit 1,2 Millilitern Nährmedium und decken Sie die Schale mit einem Glasdeckel ab, der bei 37 Grad Celsius gehalten wird. Superfusionieren Sie den Embryo mit einem 95%O2 5%CO2-Gasgemisch, das von einer Minipumpe mit variablem Durchfluss zugeführt wird. Richten Sie nun die Software so ein, dass sie automatisch Bilder erfasst, die Zeitintervalle wünschen.

Im Verlauf des Experiments können Markierungen automatisch oder manuell verfolgt und morphogenetische Stammkarten für Markerkoordinaten berechnet werden. Hier wurde die Eisenpartikeltechnik verwendet, um die Bewegung der elektrodermalen Zellen während der Kopffaltenbildung zu markieren und zu verfolgen. Im frühen Hühnerembryo waren fluoreszenzmarkierte Zellen über den gesamten Embryo verteilt.

Hellfeld- und Fluoreszenzbilder des Embryos wurden in unterschiedlichen Abständen während der Ex-Ovo-Kultur aufgenommen. So überwachen Sie die Bewegungen der Traktbeschriftungen. Kumulative Daten ermöglichen die Berechnung der sich entwickelnden morphogenetischen Dehnungsverteilungen während der Kopffaltenbildung.

In ähnlicher Weise wurde die Polystyrol-Mikrosphären-Technik verwendet, um Gewebebewegungen an der mittleren Hinterhirngrenze des frühen Hühnergehirns zu verfolgen. Beachten Sie, dass diese Methode in der Lage ist, deutliche 3D-Verformungen zu verarbeiten, da die Kügelchen dazu neigen, an allen Seiten des inneren Lumens des Gehirns zu haften. Nach der sechsstündigen Verfolgung der Perlenbewegungen ermöglichen Markerkoordinaten die Berechnung von Dehnungen, die die Gewebeverformung in Längs- und Umfangsrichtung charakterisieren.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung von einigen der experimentellen Schritte haben, die erforderlich sind, um Ihre eigene Gewebekultur und -markierung zu implementieren. Die hier vorgestellten Protokolltechniken sind insofern besonders vorteilhaft, als sie minimalinvasiv für das native Gewebe sind und zudem kostengünstige und leicht verfügbare Materialien erfordern. Diese Experimente sind besonders nützlich für Studien über die Mechanismen der Embryonalentwicklung.

Da die Deformationsfelder, die mit der verfolgten Bewegung markierter Zellen berechnet werden, sowohl zum Testen als auch zum Erstellen physikalischer Modelle der Morphogenese verwendet werden können.