Name: Tracking Morphogenetic Tissue Verformungen in der frühen Hühnerembryo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Erfahren Sie Methoden zur Beschriftung und Kultivierung embryonaler Gewebe in frühen Hühnerembryonen zur Messung morphogenetischer Verformungen. Diese Techniken ermöglichen hochauflösende Bildgebung von Gewebedynamik in zwei und drei Dimensionen.

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Diese Arbeit wurde vom NIH gewährt R01 GM075200 und R01 HL083393 (LAT) unterstützt. Wir erkennen Gemeinschaft Unterstützung für BAF von NIH T90 DA022871 und die Mallinckrodt Institute of Radiology, und VDV aus gewähren 09PRE2060795 von der American Heart Association.

1. Allgemeine Experimentelle Vorbereitung <ol><li> Bereiten Gewebekulturmedium in der Laminar-Flow-Haube. <ol><li> Verdünnen Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) (1 L Flasche mit 4,5 g / L Glucose, Natriumbicarbonat und L-Glutamin). Fügen Sie 10 ml Penicillin / Streptomycin / Neomycin Antibiotika. </li><li> Nehmen Sie 100 ml DMEM mit einem sterilen Transferpipette und ersetzen mit 100 ml chick Serum. </li><li> Aliquot der DMEM/10% chick Serum / 1% Antibiotika in sterile 15 ml konischen Röhrchen und frieren. </li></ol></li><li> Bereiten Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit Kalzium und Magnesium ergänzt. Mix 100 ml 10x PBS, 900 mL deionisiertes Wasser und 1 mL einer konzentrierten Calcium-und Magnesium-Lösung (100 mg / mL CaCl 2 • 2H 2 O, 100mg/ml MgCl 2 • 6H 2 O). </li><li> Inkubieren Eier in einer Längsausrichtung auf die gewünschte Stufe durch Hamburger und Hamilton 1 (dh 23-25 ​​Stunden für HH Stufe 5 oder 42 definiert-48 Stunden für HH Stufen 11-12). </li><li> Entfernen Embryonen aus dem Ei mit dem Filterpapier Träger-Methode. <ol><li> Crack the bottom des Eies an der Seite des A150 mm Petrischale. Auseinanderziehen der Schale von unten und entleeren Sie den Inhalt des Eies in die Schüssel. </li><li> Entfernen Sie die dickere, zähflüssige Eiweiß aus dem Ei mit einer stumpfen Zange. </li><li> Cut Kreisen Whatman Nr. 2 Filterpapier 2-3 cm. im Durchmesser. Mit einem einzigen Locher, Löcher in der Mitte des Filterpapiers. Legen Sie eine der Filterpapier Ringe auf das Eigelb in einer Weise, dass der Embryo sichtbar durch das zentrale Loch in den Ring hält. </li><li> Cut um den Außendurchmesser des Filterpapier mit Mikroschere. Entfernen Sie das Papier aus dem Eigelb mit feinen Pinzetten. </li><li> Vorsichtig abspülen den Embryo in PBS, um anhaftende Dotter Partikel zu entfernen. (HH5 Embryonen müssen so lange wie 15-20 Minuten einweichen, um restliche Eigelb zu entfernen). Entfernen Sie das Filterpapier Montage aus dem Bad und legen Sie es Bauchseite in einem35 mm Kulturschale. Platzieren Sie ein zweites Filterpapier Ring auf dem ersten, sandwiching der Embryo zwischen den Ringen. Setzen Sie einen Metallring um die Außenseite des Filterpapiers Sandwich (≈ 1,5 bis 2 cm Durchmesser), um den Embryo zu sichern. </li><li> Tauchen Sie den Embryo in Kulturmedium. Überprüfen Sie richtige Morphologie und embryonalen Stadium mit einer Hellfeld-Mikroskop. </li></ol></li><li> Mit einer Pipette puller zu feinen Spitze Glasnadeln (1,5 mm Innendurchmesser) (World Precision Instruments, Sarasota FL) für nachfolgende Gewebe Dissektionen und Kennzeichnung vorzubereiten. </li></ol> 2. DiI Markierung von HH Stage 5 Embryonen mit Magnetic Eisenpartikel <ol><li> Fügen Sie einige Tropfen der gesättigten DiI in Alkohol, um eine geringe Menge an Eisenpulver (Eisen reduziert, Mallinckrodt Baker, Inc., Phillipsburg, NJ) bei Raumtemperatur und trocknen lassen. (Diese Regel bewirkt, dass die Partikel an Kuchen zusammen, sobald der Alkohol verdunstet ist.) Verwenden Sie die Spitze eines gezogen Mikropipette zum Aufbrechen der verklumpten Eisenpartikel,Übertragen auf ein Mikrozentrifugenröhrchen, und spülen Sie sie mehrmals und decken mit VE-Wasser. </li><li> Um label Ektodermzellen in einem HH Stufe 5 Embryo, legen Sie die geernteten Embryo (dh die gesamte Filterpapier Montage) Dorsalseite in einer 35 mm Kulturschale mit einer großzügigen Schicht von Kulturmedien abgedeckt und die Schüssel unter einem Binokular. Verwenden Sie ein Glas Nadel die Dotterhaut zu entfernen und setzen die Ektodermzellen. (Achten Sie darauf, nicht gewaltsam öffnen Embryo.) </li><li> Zeichnen Sie eine Spalte markiert Eisenpartikel (in VE-Wasser) in eine Pasteurpipette. Mit dem Binokular, tauchen die Pipettenspitze unter der Flüssigkeitsoberfläche und Position genau über dem Embryo. Rollende die Pipette langsam hin und her zwischen den Fingerspitzen, drängeln sich die Partikel aus dem pipiette und streuen sie über den Embryo. </li><li> Sobald der Embryo mit Partikeln bedeckt, vorsichtig legen Sie sie in einem 37 ° C Inkubator für etwa 10 Minuten. Nehmen Embryo aus dem Inkubator eind mit einem starken Magneten, um die Partikel zu entfernen. </li><li> Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop mit angeschlossener Videokamera und entsprechende Filter-Einstellungen sowohl Hellfeld-und Fluoreszenz-Bilder des Embryos zu erwerben, wie in Abbildung 2a, b dargestellt </li><li> Beachten Sie das Etikett Dichte. Wenn eine dichtere Verteilung gewünscht ist, verwenden Sie zusätzliche Teilchen (wie oben beschrieben), um den Embryo wieder Etikett und verlängern die Inkubationszeit entsprechend. Wenn die Etiketten zu dicht sind, fügen Sie eine kleine Menge an unmarkiertem Eisenpartikel auf die Mikrozentrifugenröhrchen mit bereits markierten Partikeln gefüllt und Mix der Inhalt des Röhrchens. Wiederholen Sie die Kennzeichnung mit einem neuen Embryo und wieder beachten label Dichte. </li></ol> 3. Polystyrol Microsphere Labeling für Optical Coherence Tomography (OCT) Imaging von HH11-12 Embryonen <ol><li> Bereiten Sie eine Lösung aus schwarz 10 Mikrometer Durchmesser Mikrosphären (Polysciences Inc., Warrington, PA) in PBS in einer 35 mm Petrischale. (Beads sollte groß genug sein, um den Kontrast für die OCT erzeugtBildgebung, aber klein genug, so dass Korngröße in der Größenordnung von einzelnen Zellen ist. Spezifische Werte werden in Abhängigkeit von der Auflösung Ihres OCT-System variieren und das Gewebe untersucht). Ein Tropfen der Stammlösung (2,6% Feststoffe-Latex) pro ml PBS ist in der Regel ausreichend. Ziehen Sie diese Lösung in eine 10cc Spritze mit einer 22-Gauge-Nadel. Vortex die Lösung für 30 Sekunden, um eine gleichmäßige Raupe Verteilung zu gewährleisten. </li><li> Bevel die Spitzen deiner gezogen Glasnadeln mit einer Computer-Festplatte 2. Tipp Durchmesser sollte groß genug sein, dass Perlen können durch die Öffnung passen, aber zur gleichen Zeit, so klein wie möglich, um Gewebe verletzt während der Injektion zu minimieren. </li><li> Füllen Sie eine abgeschrägte Glas Nadel mit dem Bead-Lösung mit der Spritze. Leicht flick der Mikropipette, um sicherzustellen, dass die Lösung die Spitze erreicht. </li><li> Mit einem Mikromanipulator, statt das Glas Nadel im selben Sichtfeld wie der Embryo. Perlen sollten fließt aus der Pipettenspitze. <ol><li> Wenn keine beads Ausfahrt der Mikropipette kann es zu einer Verstopfung sein. In diesem Fall wiederholen Sie die Schritte 3,2-3,4 mit einem neuen Glas-Nadel. </li><li> Wenn zu viele Perlen Ihr Blickfeld Wolke, kann Ihr Pipettenspitze zu breit sein. Wiederholen Sie die Schritte 3,2-3,4 mit einer neuen Pipette und eine neue Embryo. </li></ol></li><li> Legen Sie die Pipettenspitze in das Lumen des Gehirns Röhre. Achten Sie darauf, nicht zu durchbohren der ventralen Boden des Gewebes. Sie sehen eine vorübergehende Schwellung des Gewebes, wie Perlen und Flüssigkeit geben das Lumen. Dies deutet auf eine erfolgreiche Intubation, jetzt schnell zu entfernen, das Glas Nadel. </li><li> Überprüfen Sie, ob eine ausreichende Dichte Wulst in das innere Lumen des Gehirns Rohr mit einer Hellfeld-Mikroskop. Lassen Sie die Perlen für 20 absetzen - 30 Minuten, bevor Sie fortfahren zu Sect. 4. </li></ol> 4. Data Acquisition * Die folgenden Methoden sind auch für die Fluoreszenz-Markierung oben beschriebene Technik geeignet. Doch mit der Mikrosphären-Kennzeichnung Technik können Wülste lösen bei der Übertragung von Probenzwischen Gründerzentren und Imaging-Systemen. In diesem Fall ist es am besten vorgehen, um 4,2 (das vermeidet Probe Bewegung / Agitation insgesamt) Schritt. Bei beiden Verfahren werden Embryonen gezüchtet, während in flüssigem Kulturmedium eingetaucht. Wenn der Embryo nicht vollständig unter Wasser (wie es der Fall mit einigen konventionellen Zellkultur-Techniken), Gewebe-Geometrie ist stark durch abnorm hohen Oberflächenspannung Lasten und Belastungen Distributionen verändert wird scheitern genau zu erfassen normalen 3-D Morphogenese 3, 4. Darüber hinaus Eintauchen des Gewebes verhindert, dass die hellen Kontrast an der Flüssig-Gas-Grenzfläche während OCT-Bildgebung beobachtet von Verschleierung embryonalen Morphologie und Marker-Koordinaten. <ol><li> Embryo Culture (allgemein) <ol><li> Nach dem Erwerb Ihres ersten Bilder (Hellfeld-, Fluoreszenz-oder OCT), legen bis zu sieben 35 mm Kulturschalen (mit Embryonen) in einem 150 mm Petrischale und legen Sie die gesamte Baugruppe in eine kleine Plastiktüte. Fügen Sie ein paar Tropfen deionisiertes Wasser in den Beutel für die Befeuchtungund füllen Sie den Beutel mit einem 95% O 2 / 5% CO 2-Gemisch. Legen Sie die Embryonen in den Brutschrank bei 37 ° C (Queue Stabiletherm, Asheville, NC) für die gewünschte Zeit bis zum nächsten Bildgebung Zeitpunkt. Mit dieser Methode können Experimente an mehreren Embryonen in den selben Tag durchgeführt werden. </li></ol></li><li> Zeitraffer-Kultur (automatisiert) <ol><li> Zeigen Sie mit der Bezeichnung Embryonen in ein Delta T Dish (35 mm Außendurchmesser, 23 mm zentrale Öffnung mit kegeliger Seitenwand, 0,17 mm dickes Glas; Bioptechs, Butler, PA) mit 1,2 ml Kulturmedium. </li><li> Decken Sie die Schüssel mit einem Glasdeckel bei 37 ° C mit einem Bioptechs Delta T4 Kulturschale Controller (zur Vermeidung von Kondensation). Superfuse der Embryo mit 95% O 2 / 5% CO 2-Gas-Gemisch aus einem Mini-Pump Variable-Flow-Gerät (Fisher Scientific) geliefert. Vor Erreichen des Embryos, Wärme und Befeuchten des Gases durch das Sprudeln es durch VE-Wasser an einem warmen (&lt;100 ° C) heißen Platte. Eine schematische Darstellung dieser experimentellen set-up ist in Abbildung 1 dargestellt. </li><li> Richten Sie die Software automatisch erwerben Bilder mit vom Benutzer festgelegten Zeitintervallen. Für unsere Fluoreszenzmikroskop, verwenden wir Openlab Software (PerkinElmer, Waltham, MA), und für unsere OCT-System verwenden wir gefegt Quelle Thorlabs Software (Newton, NJ). Da diese Methode wird derzeit nur in der Lage Handhabung eines Zeitraffer-Experiment am einer Zeit, ist es oft am besten, damit diese Art von Kulturen über Nacht laufen. Man könnte diese Einschränkung durch die Installation eines automatisierten übersetzbar Bühne kompatibel sowohl mit der Hard-und Software der Imaging-System 5 zu umgehen. </li></ol></li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Die Etiketten werden automatisch (mit Volocity, PerkinElmer) verfolgt oder manuell (mit Hilfe des Handbuchs Tracking-Plugin in ImageJ, NIH) in jedem Experiment. In der Fluoreszenzmarkierung Technik verwenden wir die Matlab-Routine Gridfit 2D-Flächen durch die Marker-Koordinaten, die ermöglicht fit morphogenetic Oberfläche Stämme 6, 7 berechnet werden. Standard-Gleichungen werden verwendet, um diese Werte in eine entsprechende embryonalen Koordinatensystem zu transformieren. Alternativ kann in der OCT-Technik, Oberflächen sind aus segmentierten Bild Bände (erhalten über Standard-Software wie Matlab oder Caret 8) und Stämme generiert in Richtung der maximalen oder minimalen Krümmung der Probe 9 berechnet werden. Wir nutzten unsere Eisenpartikelgehalt Technik zur Kennzeichnung und Verfolgung der Bewegung der ektodermalen Zellen während der Kopf Faltenbildung in den frühen Hühnerembryo. Wie in Abbildung 2a dargestellt wurden fluoreszenzmarkierte Zellen über den gesamten Embryo verteilt. Hellfeld-und Fluoreszenz-Bilder des Embryos wurden in unterschiedlichen Abständen während ex ovo Kultur eingefangen. Die Bewegungen der verfolgten Etiketten (Abb. 2B, C) wurden dann verwendet, um die sich entwickelnde morphogenetische Dehnungsverteilungen während Kopf Faltenbildung (Abb. 2D-F) zu berechnen. t "&gt; Ähnlich unserer Polystyrol-Mikrokügelchen-Technik verwendet wurde, um Gewebe Bewegungen in der Mitte Hinterhirn-Grenze des frühen chick Gehirn zu verfolgen. Wie in Abbildung 3 BD gezeigt, wurden bead Bewegungen für 6 Stunden und Stämme verfolgt Charakterisierung Gewebe Verformung in Längs-und Umfangsrichtung wurden von Marker-Koordinaten berechnet. Beachten Sie, dass diese Methode geeignet für eine deutlich 3-D Verformungen ist wie Perlen auf allen Seiten des inneren Lumen des Gehirns (Abb. 3A) Verkleben neigen. <img src="/files/ftp_upload/3129/3129fig1.jpg" alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Schematische Darstellung des Set-up für Zeitraffer-Gewebekultur. <img src="/files/ftp_upload/3129/3129fig2.jpg" alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Quantifizierung 2-D Gewebe Deformationen in den frühen Hühnerembryo mit verfolgt Fluoreszenzmarker. (A) Merged Hellfeld / Fluoreszenzbild von HH Stufe 5 Embryo nach Entfernung der Eisenpartikel. DiI-Labeled ektodermalen Zellen (rot) sind über den gesamten Embryo verteilt. (B, C) Die Bewegung der markierten Zellen wurde anhand ImageJ. Label Verschiebungen wurden in Embryo-Koordinaten (X, Y) berechnet. Beachten Sie, dass A und B das gleiche Bild sind. (DF) Konturdiagramme der sich entwickelnden Längsdehnung Ausschüttungen während der Kopf Faltenbildung. Longitudinal Lagrange-Stämme wurden in Bezug auf Stufe 5 HH (dh A und B) nach (D) 75 min, (E) 120 min, und (F) 165 min Inkubation berechnet. Diese Stämme zeichnen die Längenänderungen der Linienelemente ursprünglich orientiert entlang der Y-Achse (in der Stufe 5 Embryo). Weitere Einzelheiten zur Verwendung verfolgt label Koordinaten morphogenetic Stämme berechnen kann in Filas et al. (2007) 6 und Varner et al. (2010) 7 gefunden werden. Beachten Sie, dass C-und F das gleiche Bild sind. Maßstab = 500 pm. <img src="/files/ftp_upload/3129/3129fig3.jpg" alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Quantifizierung 3-D Gewebe deformations in den frühen chick Gehirn. (A) Polystyrol-Mikrokügelchen, die die dorsale (schwarzer Pfeil) haften und ventralen (weißer Pfeil) Seiten des Gehirns Röhre sind leicht erkennbar vom umgebenden Gewebe in Quer section.Ventral Ansichten der OCT-Rekonstruktionen zeigen Mikrosphäre Orten in der Nähe der Mitte des Hinterhirn-Grenze bei (B) HH12 und nach (C) 6 h Inkubation (M: Mittelhirn, H: Rautenhirn). Mehrere Gruppen von Perlen sind umrissen, um die gesamte Verformung des Gewebes zu markieren. (D) Longitudinal (E zz) und radiale (E θθ) Lagrange-Stämme wurden aus diesen Verformungen berechnet. Positive und negative Längs-Umfangs-Stämme in der Mitte Hinterhirn-Grenze spiegeln eine axiale Verlängerung und Verkürzung der umlaufenden dieser Region während der Kultur. Weitere Einzelheiten zur Berechnung der morphogenetischen Stämme für komplexe Oberflächen während der Morphogenese in Filas et al. (2008) 9 gefunden werden. Maßstab = 200 um.

<ol><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).</li>
<li>Canfield, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dry+beveling+micropipettes+using+a+computer+hard+drive%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Dry beveling micropipettes using a computer hard drive.</a> J. Neurosci. Methods. 158, 19-21 (2006).</li>
<li>Voronov, D. A., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+looping+in+experimental+conditions%3A+the+effects+of+extraembryonic+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Cardiac looping in experimental conditions: the effects of extraembryonic forces.</a> Developmental Dynamics. 224, 413-421 (2002).</li>
<li>Filas, B. A., Bayly, P. V., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress+as+a+regulator+of+cytoskeletal+contractility+and+nuclear+shape+in+embryonic+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress as a regulator of cytoskeletal contractility and nuclear shape in embryonic epithelia.</a> Ann. Biomed. Eng. 39, 443-454 (2011).</li>
<li>Kozel, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+fiber+formation%3A+a+dynamic+view+of+extracellular+matrix+assembly+using+timer+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Elastic fiber formation: a dynamic view of extracellular matrix assembly using timer reporters.</a> J. Cell. Physiol. 207, 87-96 (2006).</li>
<li>Filas, B. A., Efimov, I. R., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography+as+a+tool+for+measuring+morphogenetic+deformation+of+the+looping+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography as a tool for measuring morphogenetic deformation of the looping heart.</a> Anat. Rec. 290, 1057-1068 (2007).</li>
<li>Varner, V. D., Voronov, D. A., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+head+fold+formation%3A+investigating+tissue-level+forces+during+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mechanics of head fold formation: investigating tissue-level forces during early development.</a> Development. 137, 3801-3811 (2010).</li>
<li>Van Essen, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+software+suite+for+surface-based+analyses+of+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Med.+Inform.+Assoc%22%5BJournal%5D)">An integrated software suite for surface-based analyses of cerebral cortex.</a> J. Am. Med. Inform. Assoc. 8, 443-459 (2001).</li>
<li>Filas, B. A., Knutsen, A. K., Bayly, P. V., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+measuring+deformation+of+folding+surfaces+during+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech.+Eng%22%5BJournal%5D)">A new method for measuring deformation of folding surfaces during morphogenesis.</a> J. Biomech. Eng. 130, 061010-061010 (2008).</li>
<li>Yuan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-registered+optical+coherence+tomography+and+fluorescence+molecular+imaging+for+simultaneous+morphological+and+molecular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Co-registered optical coherence tomography and fluorescence molecular imaging for simultaneous morphological and molecular imaging.</a> Phys. Med. Biol. 55, 191-206 (2010).</li>
<li>Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+digital+image-based+method+for+computational+tissue+fate+mapping+during+early+avian+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis.</a> Ann. Biomed. Eng. 33, 854-865 (2005).</li>
<li>Blanchard, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+tectonics%3A+morphogenetic+strain+rates%2C+cell+shape+change+and+intercalation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Tissue tectonics: morphogenetic strain rates, cell shape change and intercalation.</a> Nat. Methods. 6, 458-464 (2009).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Zwei Gewebe Kennzeichnung Techniken sind für die ex ovo Kultur der frühen Hühnerembryonen vorgestellt. Die erste nutzt fluoreszierende lipophile Farbstoffe über magnetische Eisenteilchen ausgeliefert, gleichzeitig label Hunderte von Zellen. Allerdings ist diese Methode derzeit nicht kompatibel mit optischen Kohärenztomographie, als Fluoreszenzfarbstoffe in der Regel wenig Kontrast aus den umliegenden Geweben unter Verwendung von 10 Oktober zeigen. Daher zeigen wir eine alternative Technik unter Verwe...

<table border="1"><table border="1"><tbody><tr><td> Material / Reagent </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> DMEM - hohe Glucose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin / Neomycin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4083 </td><td></td></tr><tr><td> Huhn Serum </td><td> Invitrogen </td><td> 16110-082 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbeccos Phosphate Buffered Saline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D1408 </td><td> 10X </td></tr><tr><td> Whatman Nr. 2 Filterpapier </td><td> Whatman </td><td> 1002 090 </td><td> 90mm Durchmesser </td></tr><tr><td> Glasmikropipetten </td><td> World PrecisionInstruments (WPI) </td><td> TW150-6 </td><td> 1,5 mm Innendurchmesser </td></tr><tr><td> DiI </td><td> Invitrogen </td><td> D-282 </td><td></td></tr><tr><td> Eisen reduziert </td><td> Mallinckrodt Baker Inc. </td><td> 5320 </td><td></td></tr><tr><td> 10 pm Durchmesser Microspheres (schwarz) </td><td> Polysciences Inc. </td><td> 24294 </td><td></td></tr><tr><td> Delta T Dish (für Zeitraffer-Kultur) </td><td> Bioptechs </td><td> 04200415B </td><td> 0,17 mm dick, schwarz </td></tr><tr><td> Delta T4 Culture Dish-Controller </td><td> Bioptechs </td><td> 0420-4-03 </td><td></td></tr><tr><td> Mini-Pump Variable-Flow-Gerät </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tracking morphogenetic tissue verformungen in der frühen hühnerembryo

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo 

Embryonale Epithelien unterziehen komplexe Verformungen (z. B. Biegen, Drehen, Falten und Dehnung) auf die primitive Organe des frühen Embryos bilden. Tracking fiducial Markierungen auf der Oberfläche dieser Hohlkammerplatten ist eine gut etablierte Methode zur Schätzung der morphogenetischen Größen wie Wachstum, Schrumpfung und Scherung. Allerdings sind nicht alle Oberflächen Kennzeichnung Techniken ohne weiteres mit herkömmlichen bildgebenden Verfahren und besitzen unterschiedliche Vor-und Nachteile. Hier beschreiben wir zwei Kennzeichnung Methoden und illustrieren den Nutzen der einzelnen Verfahren. Bei der ersten Methode werden hunderte von fluoreszierenden Markierungen gleichzeitig auf den Embryo mit magnetischen Eisenteilchen angewendet. Diese Etiketten werden dann an Menge 2-D Gewebe Deformationen während der Morphogenese verwendet. In der zweiten Methode werden Polystyrol-Mikrosphären als Kontrastmittel in der nicht-invasiven optischen Kohärenztomographie (OCT) Bildgebung verwendet werden, um 3-D Gewebe Deformationen zu verfolgen. Diese Techniken wurden erfolgreichly in unserem Labor zu physikalischen Mechanismen der frühen Kopffalte, Herz und die Entwicklung des Gehirns studythe umgesetzt und sollte anpassungsfähig sein, um eine breite Palette morphogenetischen Prozessen.

Dieser Artikel beschreibt Oberfläche Kennzeichnung und<em&gt; Ex ovo</em&gt; Gewebekultur in den frühen Hühnerembryo. Techniken zugänglich Zeitraffer-Hellfeld-, Fluoreszenz-und optischen Kohärenz-Tomographie dargestellt werden. Tracking-Oberfläche Etiketten mit hoher örtlicher und zeitlicher Auflösung ermöglicht kinematische Größen wie morphogenetic Stämme (Verformungen) in beiden zwei und drei Dimensionen berechnet werden.

Tracking Morphogenetic Tissue Verformungen in der frühen Hühnerembryo

Embryonale Epithelien unterliegen komplexen Deformationen (z. B. Biegung, Verdrehung, Faltung und Streckung), um die primitiven Organe des frühen Embryos zu bilden. ...

Das übergeordnete Ziel der hier vorgestellten Techniken besteht darin, embryonales Gewebe zu markieren und zu kultivieren, um morphogenetische Verformungen während der frühen Entwicklung zu messen. Für die Kultur des frühen Hühnerembryos beginnen Sie damit, das Embryo mithilfe einer Filterpapierschleppermethode aus dem Ei zu entfernen. Markieren Sie das gewonnene Embryo je nach experimenteller Anwendung mit fluoreszierenden lipophilen Farbstoffen, die über magnetische Eisenteilchen zugeführt werden, oder mit Polystyrol-Mikrosphären. Verfolgen Sie anschließend die Markierungen während der Kultur mittels Fluoreszenzmikroskopie oder optischer Kohärenztomographie-Bildgebung.Abbildungen der resultierenden morphogenetischen Dehnungskarten zeigen Bereiche der Gewebeverlängerung, -verkürzung und -scherung in zwei und drei Dimensionen. Hallo, mein Name ist Ben Philis und ich bin Doktorand im Labor von Dr. Larry Tabor am Department für Biomedizinische Technik der Washington University in St. Louis. Vor Beginn dieser Art von Experimenten ist es wichtig, die relevanten Gewebekulturmethoden in Ihrem Modellsystem, die Ihnen möglicherweise zur Verfügung stehenden Bildgebungsmodalitäten sowie die Art der Daten, die Sie aus Ihren Experimenten gewinnen möchten, zu berücksichtigen.Zum Beispiel: Interessieren Sie sich für die Analyse von Gewebedeformationen in zwei oder drei Dimensionen? Wir gehen heute einigen dieser Fragen nach, indem wir zwei sich ergänzende Markierungstechniken im frühen Hühnerembryo vorstellen. Hallo, mein Name ist Victor Varner, und ich arbeite im Labor von Dr. Larry Tabor an der Washington University in St. Louis.Bei beiden Techniken markieren wir schnell und gleichzeitig Hunderte von Zellen im frühen Hühnerembryo. Die Verfolgung der Bewegung dieser Markierungen ermöglicht es uns, nicht nur die Gewebe zu bestimmen, in die diese Zellen schließlich einwandern, sondern auch die gewebsweiten Deformationen zu quantifizieren, die das frühe Embryo formen. Inkubieren Sie die Eier zunächst in longitudinaler Orientierung bis zum gewünschten Stadium, wie von Hamburger und Hamilton definiert.Zerschlagen Sie die Unterseite des Eies an der Seite einer 150 Millimeter großen Petrischale. Öffnen Sie die Schale von unten, geben Sie den Inhalt des Eies in die Schale und entfernen Sie mit stumpfen Pinzetten das dickere, viskose Eiweiß vom Eigelb. Stanzen Sie nun Löcher durch die Mitte eines runden Filterpapiers.Platzieren Sie einen der Filterpapierringe auf dem Eigelb, sodass der Embryo durch das zentrale Loch des Ringes sichtbar ist. Schneiden Sie mit einer Mikroschere entlang des äußeren Randes des Filterpapierringes. Entfernen Sie dann das Papier mit dem daran haftenden Embryo vorsichtig vom Eigelb mit feinen Pinzetten und tauchen Sie den Embryo sanft in eine PBS-Lösung ein. Um anhaftende Eigelbpartikel zu entfernen, überführen Sie die Filterpapieranordnung in eine 35-Millimeter-Kulturschale.Legen Sie es mit der Bauchseite nach oben und führen Sie das Embryo mit einem zweiten Filterpapier-Ring weiter. Sichern Sie es mit einem Metallring und tauchen Sie das Embryo in Kulturmedium ein. Wenn das Embryo nicht vollständig eingetaucht ist, können Geometrie des Gewebes und die anschließende Morphogenese durch abnormal hohe Oberflächenspannungsbelastungen stark verändert werden.Während der Kultur unter Verwendung eines Hellfeldmikroskops die korrekte Morphologie und den embryonalen Entwicklungsstadium überprüfen. Zunächst eine kleine Menge Eisenpulver entnehmen, einige Tropfen gesättigte Farblösung und Alkohol hinzufügen und mit der Spitze einer gezogenen Mikropipette lufttrocknen lassen. Agglomerierte Eisenpartikel aufbrechen und in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführen.Nach mehreren Spülgängen in ionisiertem Wasser wird das geerntete Embryo mit der dorsalen Seite nach oben in eine 35-Millimeter-Kulturschale gelegt, die mit einer reichlichen Schicht Kulturmedium bedeckt ist. Unter einem Stereomikroskop verwenden Sie die Glasnadel, um die Vilinmembran zu entfernen und die ekktodermalen Zellen freizulegen. Saugen Sie nun eine Säule markierter Eisenteilchen in eine Pipette auf.Unter Verwendung des Stereomikroskops tauchen Sie die Pipette so ein, dass sie sich knapp über dem Embryo befindet. Rollen Sie die Pipette langsam zwischen den Fingerspitzen hin und her, um die Partikel über den Embryo zu verteilen. Nach einer 10-minütigen Inkubation bei 37 Grad Celsius entfernen Sie die Partikel mithilfe eines starken Magneten.Falls erforderlich, den Magneten an eine magnetische Pinzette aus feinem Material anbringen und die magnetisierte Pinzette vorsichtig verwenden, um verbliebene Eisenpartikel zu entfernen. Fahren Sie fort, sowohl Hellfeld- als auch Fluoreszenzbilder des Embryos aufzunehmen. Mit einer Nadel der Größe 22.Ziehen Sie eine Lösung schwarzer Mikrokügelchen mit einem Durchmesser von 10 Mikrometern in PBS in eine 10-cc-Spritze ein. Danach werden die Spitzen der gezogenen Glasnadeln mithilfe einer Computer-Festplatte abgeschliffen und mit der Kügelchenlösung gefüllt. Klopfen Sie leicht gegen die Mikropipette, damit die Lösung mit einem Mikromanipulator bis zur Spitze vordringt.Platzieren Sie die Glasnadel im gleichen Sichtfeld wie das Embryo. Bestätigen Sie den Fluss der Kügelchen aus der Pipettenspitze. Führen Sie nun die Pipettenspitze in das Lumen des Neuralrohrs ein.Dabei darauf achten, den ventralen Boden des Gewebes nicht zu durchbohren. Überwachen Sie die vorübergehende Schwellung des Gewebes, während Perlen und Flüssigkeit in das Lumen eindringen. Entfernen Sie dann schnell die Glasnadel.Überprüfen Sie abschließend eine ausreichende Perlen-Dichte im inneren Lumen des Gehirnschlauchs. Lassen Sie die Perlen unter dem Hellfeldmikroskop 20 bis 30 Minuten lang sedimentieren, bevor Sie Hellfeldaufnahmen oder einen optischen Kohärenztomographie-Datensatz aufnehmen. Nach der Aufnahme der ersten Bilder bringen Sie bis zu 7 Kulturschalen mit 35 Millimeter Durchmesser in eine Petrischale mit 150 Millimeter Durchmesser ein und stellen die gesamte Anordnung in einen kleinen Plastikbeutel.Geben Sie Tropfen deionisiertes Wasser in die Tasche, um sie zu befeuchten, und füllen Sie die Tasche anschließend mit einer Mischung aus 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid. Stellen Sie die Embryonen bis zum nächsten Bildgebungszeitpunkt in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Platzieren Sie die markierten Embryonen in eine Delta-T-Schale, die 1,2 Milliliter Kulturmedium enthält, und decken Sie die Schale mit einem Glasdeckel ab, der bei 37 Grad Celsius gehalten wird. Spülen Sie den Embryo mit einer Gasmischung aus 95 % O₂ und 5 % CO₂, die von einer Mini-Pumpe mit variabler Durchflussregelung bereitgestellt wird. Richten Sie die Software nun so ein, dass automatisch Bilder in gewünschten Zeitabständen aufgenommen werden.Im Verlauf des Experiments können Markierungen automatisch oder manuell verfolgt und morphogenetische Dehnungskarten für die Koordinaten der Marker berechnet werden. Hier wurde die Eisenteilchen-Technik verwendet, um die Bewegung der elektrodermalen Zellen während der Kopffaltung zu markieren und zu verfolgen. Im frühen Hühnerembryo waren fluoreszenzmarkierte Zellen über das gesamte Embryo verteilt.Helligkeits- und Fluoreszenzbilder des Embryos wurden in unterschiedlichen Intervallen während der Ex-ovo-Kultur aufgenommen. Um die Bewegungen der Traktmarkierungen zu überwachen. Kummulierte Daten ermöglichen die Berechnung der sich entwickelnden morphogenetischen Dehnungsverteilungen während der Bildung der Kopffalte.Auf ähnliche Weise wurde die Polystyrol-Mikrokugel-Technik verwendet, um Gewebebewegungen an der Grenze zwischen Mittel- und Nachhirn im frühen Hühnergehirn zu verfolgen. Beachten Sie, dass diese Methode in der Lage ist, deutlich dreidimensionale Verformungen zu erfassen, da die Kugeln dazu neigen, an allen Seiten des inneren Lumens des Gehirns haften zu bleiben. Nach der Verfolgung der Kugelbewegungen über einen Zeitraum von sechs Stunden ermöglichen die Markerkoordinaten die Berechnung der Dehnungen und damit die Charakterisierung der Gewebeverformung in longitudinaler und umfassender Richtung.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung von einigen der experimentellen Schritte haben, die erforderlich sind, um Ihre eigene Gewebekultur und Markierung durchzuführen. Die hier vorgestellten Protokolltechniken bieten den besonderen Vorteil, dass sie für das native Gewebe minimal invasiv sind und zudem kostengünstige sowie leicht verfügbare Materialien verwenden. Diese Experimente eignen sich besonders gut für Untersuchungen zur Mechanik der embryonalen Entwicklung.Da die aus der verfolgten Bewegung markierter Zellen berechneten Deformationsfelder sowohl zur Überprüfung als auch zur Konstruktion physikalischer Modelle der Morphogenese verwendet werden können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieser Artikel beschreibt ein Gewebetransplantation Technik, die entwickelt, um die Signal-und Strukturierungs-Eigenschaften der Oberfläche cephalica Ektoderm während kraniofazialen Entwicklung Test war.

Die Beurteilung Signaling Eigenschaften von ektodermale Epithel Während Craniofacial Entwicklung

Den Hühnerembryo während der Entwicklung zu betrachten und darauf zuzugreifen, kann eine Herausforderung sein. Wir haben eine Ex-Ovo-Methode entwickelt, die einfach und kostengünstig ist und problemlos in einem Klassenzimmer oder in der Forschung eingesetzt werden kann. Diese Methode ermöglicht den Zugang zum Embryo bis in die späten Stadien der Embryonalentwicklung (HH 40).

Optimierte Ex-ovo Züchtung von Hühnerembryonen zu fortgeschrittenen Entwicklungsstadium

Durch das Pfropfen von Kügelchen, die mit Wachstumsfaktoren oder spezifischen Inhibitoren von Signalwegen getränkt sind, in sich entwickelnde Embryonen ist es möglich, ihre Wirkung direkt in vivo zu testen. Bei diesem Protokoll werden Kügelchen in die Knospe der Gliedmaßen transplantiert, um die Auswirkungen dieser Moleküle auf die Genexpression und Signaltransduktion zu bestimmen.

Pfropfen von Beads in die Entwicklung von Hühnerembryo-Glieder zu identifizieren Signaltransduktionswegen Beeinflussung der Genexpression

Protokolle, die undurchlässige Barrieren verwenden, um Induktionsereignisse zwischen Geweben der Hauptkörperachse und der Flanke im Hühnerembryo zu blockieren, die für die Gliedmaßenbildung erforderlich sind, werden beschrieben. Kügelchen, die mit induktiven Signalkandidaten getränkt sind, werden verwendet, um den Effekt der Barriereplatzierung zu überwinden, und die Analyse der Genexpression bestätigt dies.

Die Anwendung der undurchlässige Barrieren In Kombination mit Candidate Factor Soaked Beads zu studieren Induktive Signale im Küken

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll eine Reihe von neuen Ex-Ovo -Experimente und physical-Modeling-Ansätze für das Studium der Mechanik der Morphogenese während frühen Küken embryonalen Gehirn Torsion.

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Dieses Protokoll ist für die Bildgebung und Analyse der Dynamik der Zellorientierung und des Gewebewachstums in der Drosophila-Bauchepithelie konzipiert, während die Fruchtfliege einer Metamorphose unterzogen wird. Die hier beschriebene Methodik kann auf die Untersuchung verschiedener Entwicklungsstadien, Gewebe und subzellulärer Strukturen in Drosophila oder anderen Modellorganismen angewendet werden.

Bildgebung und Analyse der Gewebeorientierung und Wachstumsdynamik in der Entwicklung drosophila Epithelia während der Pupal-Stadien

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Rekombinante Gliedmaßen sind ein leistungsfähiges experimentelles Modell, das es ermöglicht, den Prozess der Zelldifferenzierung und die Erzeugung von Mustern unter dem Einfluss embryonaler Signale zu untersuchen. Dieses Protokoll stellt eine detaillierte Methode zur Erzeugung rekombinanter Gliedmaßen mit Mesodermalzellen von Hühnergliedmaßen vor, die an andere Zelltypen angepasst werden können, die aus verschiedenen Organismen gewonnen werden.

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Der durchnässte Perlenassay beinhaltet die gezielte Abgabe von Testreagenzien zu jedem Entwicklungszeitpunkt, um die Regulation der Zelldifferenzierung und Morphogenese zu untersuchen. Es wird ein detailliertes Protokoll vorgestellt, das auf jedes Versuchstiermodell anwendbar ist, um drei verschiedene Arten von getränkten Perlen herzustellen und diese in die Zwischenziffer eines Hühnerembryos zu implantieren.

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Hier beschreiben wir Protokolle für drei Arten von embryonalen Hautexplantatkulturen von Vögeln, die zur Untersuchung von Gewebeinteraktionen, 4D-Bildgebungs-Zeitrafferfilmen (3D plus Zeit), globalen oder lokalen Störungen der molekularen Funktion und systembiologischer Charakterisierung verwendet werden können.

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Überwachung der mechanischen Entwicklung von Gewebe während des Neuralrohrverschlusses des Kükenembryos

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Tracking Morphogenetic Tissue Verformungen in der frühen Hühnerembryo

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