Ein Allelotyping PCR zur Identifizierung Salmonella enterica Serovare Enteritidis, Hadar, Heidelberg, und Typhimurium

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, spezifische Salmonellen-Antigen-Allele zu identifizieren. Dies wird erreicht, indem die PCR gezielt durchgeführt wird, um spezifische Sequenzunterschiede zu identifizieren, die mit diesen Allelen verbunden sind. Das Proben-Template wird zu einem PCR-Reaktionsmix hinzugefügt, der allelspezifische Primer und die OH-Eins- und H-Zwei-Alleltypisierung enthält.

PCRs werden im Thermocycler durchgeführt. Anschließend werden die PCR-Proben mittels Gelelektrophorese nach Größe getrennt, um die Größe des Amplikons, falls vorhanden, für jede Probe zu bestimmen oder zu isolieren. Die Amplikongröße wird dann mit der erwarteten Größe für jedes der in der PCR verwendeten Primer-Sets korreliert, die die Identifizierung des spezifischen Salmonellen-Antigens zeigen.

Die Bezeichnung Allele durch PCR SEROVAR wird dann auf der Grundlage der Ergebnisse für OH 1 und H zwei Multiplex-PCR-Assays vergeben. Der Hauptvorteil des in diesem Video beschriebenen Protokolls gegenüber SYP besteht darin, dass es schnell, einfacher zu interpretieren und kostengünstiger ist. Diese Methode kann dazu beitragen, einige Schlüsselfragen im Bereich der Epidemiologie zu beantworten, wie z. B. die Bestimmung der Verteilung und Persistenz von Salmonellen-VARs innerhalb oder zwischen Geflügel- oder Milchviehbetrieben.

Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auf die schnelle Diagnose von Lachsose, die auf Salmonellen, Serovare, Arius oder Urian zurückzuführen ist. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend für das Verständnis, wie diese PCR-basierte Methode zur Typisierung von Salmonellen auf Serovar-Ebene verwendet werden kann. Adriana Pedroso und Yin Chang, Forscher in den Lee Mauer Laboratories an der University of Georgia, werden dieses Verfahren demonstrieren: Um eine Ganzzell-DNA-Vorlage für die anschließende PCR-Reaktion vorzubereiten.

Beimpfen Sie zunächst einen Milliliter LB-Brühe mit Salmonellen. Isolieren Sie sich von einer einzigen Kolonie. Inkubieren Sie die Kultur unter Schütteln bei 200 bis 250 Umdrehungen pro Minute und einer Inkubationstemperatur von 37 Grad Celsius.

Übertragen Sie am nächsten Tag die Ein-Milliliter-Kultur in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie die Suspension etwa zwei Minuten lang bei der 4.500-fachen Schwerkraft, um die Zellen zu pelletieren, aspirieren Sie anschließend das Supant und resuspendieren Sie dann das Bakterienpellet in einem Milliliter 100%iges Ethanol, inkubieren Sie die Ethanol-Schwebezellen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur und zentrifugieren Sie dann wie zuvor zu den Zellen. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter PBS. Nach der Zentrifugation aspirieren Sie das Supinat und reaktivieren Sie das Pellet in einem Milliliter sterilem destilliertem Wasser. Zum Schluss die Zellsuspension verdünnen.

Einer von 20 mit destilliertem Wasser und bis zu einem Monat bei minus 20 Grad Celsius lagern, bis die PCR-Vorbereitung und -Abgabe des PCR-Reaktionsmixes in einem physisch getrennten Raum und vorzugsweise an einem speziellen PCR-Arbeitsplatz erfolgen muss, der mit UV-Licht ausgestattet ist. Dekontaminieren Sie zunächst die Arbeitsfläche mit UV-Licht und durch Abwischen mit 10 % Bleichmittel. Anschließend mit einer Pipette, die ausschließlich für PCR-Arbeiten bestimmt ist und mit einer Barrierepipettenspitze ausgestattet ist.

Stellen Sie ein Master-Primer-Material her, indem Sie zuerst die Primer mit destilliertem Wasser auf fünfmal 10 Molar minus vier Molaren verdünnen. Verdünnen Sie dann die Brühe eins zu 20 mit destilliertem Wasser, um die Arbeitskonzentration von 25 Mikromolar zu erreichen. Nehmen Sie die PCR-Reagenzien und die Ganzzellvorlage aus dem Gefrierschrank und tauen Sie sie auf Eis auf.

Lassen Sie die Tac-DNA-Polymerase bis zur Verwendung im Gefrierschrank. Kombinieren Sie die PCR-Reagenzien gemäß Tabelle eins des schriftlichen Protokolls. Pipettieren Sie anschließend neun Mikroliter der PCR-Reaktion.

In die Vertiefungen einer sterilen 96-Rund-Well-Mikrotiterplatte aus Polystyrol mischen. Beginnen Sie am oberen Rand der ersten Säule und bewegen Sie sich in der Säule nach unten und dann zum oberen Rand der nächsten Säule, geben Sie einen Mikroliter destilliertes Wasser in die erste Vertiefung, um als Negativkontrolle zu dienen. Geben Sie dann 0,5 Mikroliter der Positivkontroll-Templates in den PCR-Mix in die zweite Vertiefung und einen Mikroliter e coli K 12 DH five alpha in die dritte.

Nun, fügen Sie einen Mikroliter des dritten Proben-Templates zu den verbleibenden Vertiefungen für die H-, Eins-, I- und Gyp-PCR hinzu. Salmonella entera, CVaR, TYM und Enteritis dienen als Positivkontrollen für das Auge bzw. die GM-Allele. Salmonellen CVaR, Heidelberg und Haar sind die Positivkontrollen, die in der zweiten PCR zur Typisierung des H-Eins-Allels zum Nachweis der r- bzw. z10-Allele verwendet werden. Legen Sie als nächstes Glaskapillaren mit einem Fassungsvermögen von 10 Mikrolitern in dafür vorgesehene Halterungen für die Idaho-Technologie.

Sobald der Schnellcycler in der Halterung befestigt ist, laden Sie jede Glaskapillare mit dem PCR-Reaktionsmix, indem Sie die Kapillaren mit dem Boden der Vertiefungen berühren. Kippen Sie den Halter, damit die Flüssigkeit das Röhrchen hinunterwandern kann und Platz zwischen den Enden und der PCR-Mischung bleibt. Bevor Sie die Glasröhren mit einem Butanbrenner heißversiegeln, um beide Enden der Kapillaren abzudichten, legen Sie die Kapillarröhrchen und den Halter in den Schnellcycler der Idaho-Technologie und verwenden Sie die Thermocycler-Programme, die in der ersten Tabelle des schriftlichen Protokolls für die verschiedenen ELO-Typen in PCRs beschrieben sind.

Sobald das Thermocycler-Programm abgeschlossen ist, fahren Sie mit dem Schritt der Gel-Elektropherese für einen 15 x 10 Zentimeter großen Schritt fort. 1,5 % Molekularbiologisches Gel entstand mit einem Thiumbromid gemäß den Standardverfahren. Sobald das Gel erstarrt ist, überführen Sie das Gel in eine tauchfähige horizontale Elektrophoresekammer, die einmal TAE-Elektrophoresepuffer enthält, vorgemischt mit 200 Mikrolitern à 0,25 Milligramm pro Milliliter.

DNA-Molekulargewichtsmarker mit 40 Mikrolitern sechsfacher DNA-Ladefarbstoffladung, 4,8 Mikrolitern des vorgemischten DNA-Molekulargewichtsmarkers in die erste, mittlere und letzte Vertiefung. Entfernen Sie anschließend eine Glaskapillare mit einer PCR-Probenreaktion aus dem Halter und ätzen Sie beide Enden der Kapillare mit einem Glasschneider. Legen Sie dann Daumen und Zeigefinger beider Hände auf beide Seiten der vom Glasschneider markierten Kapillare und schnappen Sie die Kapillare ein, setzen Sie den Kapillarspender auf das gegenüberliegende Ende des PCR-Reaktionsgemischs und drehen Sie den Kolben langsam im Uhrzeigersinn, bis sich die Flüssigkeit ganz unten im Röhrchen befindet.

Legen Sie die Kapillare in die zu beladende Vertiefung und drehen Sie den Kolben langsam im Uhrzeigersinn, um die fol gewichtete Probe in die Entstehung zu dosieren. Achten Sie darauf, dass Sie die Vertiefung nicht mit der Kapillare durchstechen oder eine Luftblase in die Vertiefung einführen, indem Sie den Kolben weiter drehen, nachdem die letzte Flüssigkeit die Kapillare verlassen hat. Sobald alle Proben und Standards geladen sind, stellen Sie die konstante Spannung des Netzteils auf 90 Volt ein.

Nach Abschluss der Elektrophorese übertragen Sie das Gel auf einen UV-Trans-Illuminator, um DNA-Fragmente und Molekulargewichtsstandards zu visualisieren und Bilder auf einem XR-System des Geldocks aufzunehmen. Legen Sie zum Schluss die Kapillarhalter 15 bis 30 Minuten lang in 10%iges Bleichmittel. Spülen Sie dreimal mit destilliertem Wasser ab und stellen Sie es zum Lufttrocknen wieder in den PCR-Setup-Raum.

Dieses erste Atheriumbromid-Färbegel zeigt die Ergebnisse einer Multiplex-PCR für das O-Allel in Verbindung mit Salmonella entera var, Enteritis, hadda Heidelberg.Antifa. Die Bahnen eins und 13 enthalten ein 100er Basenpaar. DNA-Leiter.

Spur zwei enthält die Multiplex-PCR-Kontrollen für die O-Allele B, C eins, C zwei, D eins und E.Die restlichen Spuren drei bis 12 enthalten Salmonellenisolate. Eine Allelbezeichnung wird für Salmonellenisolat vergeben, basierend auf dem Amplikon, das der Größe der PCR-Kontrolle entspricht und wie für die von links nach rechts verwendeten Allel-Prima-Sets vorhergesagt. Diese Amplikonsgrößen sind wie folgt: D 1 620 Basenpaare, C zwei 400 Basenpaare, E 1 280 Basenpaare, C 1 340 Basenpaare und B 560 Basenpaare.

Dieses Iridiumbromid-Färbegel zeigt die Ergebnisse einer H-Eins-Allel-Multiplex-PCR zur Identifizierung des FLA-Gels in Allelen, Auge und GM. Das Gel wurde in der gleichen Reihenfolge wie zuvor gezeigt geladen. Auch hier wird jedem Isolat ein H-Eins-Allel zugeordnet, abhängig vom Vorhandensein eines Amplikons, das in der Größe mit der PCR-Kontrolle übereinstimmt und wie für die vier H-Ein-Allel-Primer-Sets, die von links nach rechts verwendet werden, vorhergesagt wird.

Die Amplikongrößen sind GM 310 Basenpaare und I 510 Basenpaare. Dieses spinale Atheriumbromid-Färbegel zeigt die Ergebnisse einer H-Eins-Allel-Multiplex-PCR zur Identifizierung der Gellin-Allele r und z 10. Auch hier wurde das Gel auf die gleiche Weise geladen wie zuvor gezeigt, und jedem Isolat wird ein H-Eins-Allel zugeordnet, abhängig vom Vorhandensein eines Amplikons, das in der Größe mit der PCR-Kontrolle übereinstimmt, und wie für die vier verwendeten H-Ein-Allel-Primer-Sets vorhergesagt, betragen die Amplikongrößen R 170 Basenpaare und Z zehn dreihundertsechzig Basenpaare.

Diese Technik kann in vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Denken Sie bei diesem Verfahren daran, die Template-Vorbereitung, das PCR-Setup und die Gelelektrophorese physisch voneinander zu trennen, um das Potenzial einer PCR-Verschleppungskontamination zu minimieren.