Ein Allelotyping PCR zur Identifizierung Salmonella enterica Serovare Enteritidis, Hadar, Heidelberg, und Typhimurium

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, spezifische Salmonella-Antigenallele zu identifizieren. Dies wird erreicht, indem mittels PCR gezielt nach spezifischen Sequenzunterschieden gesucht wird, die mit diesen Allelen assoziiert sind. Die Probenvorlage wird einer PCR-Reaktionsmischung hinzugefügt, die allelespezifische Primer sowie die OH1- und H2-Alleltypisierung enthält.

Die PCR wird im Thermocycler durchgeführt. Anschließend werden die PCR-Proben nach Größe mittels Gelelektrophorese getrennt, um die Größe des Amplikons zu bestimmen, falls eines in jeder Probe oder Isolat vorhanden ist. Die Amplikongröße wird dann mit der erwarteten Größe für jeden der verwendeten Primer-Sätze verglichen, sodass Ergebnisse erhalten werden, die die Identifizierung eines spezifischen Salmonellen-Antigens zeigen.

Die Allele mittels PCR werden anschließend anhand der Ergebnisse für die OH-eins- und H-zwei-Multiplex-PCR-Assays der SEROVAR zugeordnet. Der Hauptvorteil des in diesem Video beschriebenen Protokolls gegenüber SYP liegt darin, dass es schneller, einfacher zu interpretieren und kostengünstiger ist. Diese Methode kann helfen, einige zentrale Fragen im Bereich der Epidemiologie zu beantworten, beispielsweise die Verteilung und das Überdauern von Salmonella-VARs innerhalb oder zwischen Geflügel- oder Milchviehbetrieben zu bestimmen.

Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf die schnelle Diagnose von Salmonellose, die auf Salmonella-Serovare arius oder urian zurückgeht. Die visuelle Darstellung dieser Methode ist entscheidend, um zu verstehen, wie man diese PCR-basierte Methode zur Typisierung von Salmonella auf der Ebene der Serovare anwendet. Adriana Pedroso und Yin Chang, Wissenschaftlerinnen in den Lee-Mauer-Labors an der University of Georgia, werden dieses Verfahren demonstrieren, um eine Ganzzell-DNA-Vorlage für die anschließende PCR-Reaktion vorzubereiten.

Inokulieren Sie zunächst ein Milliliter LB-Brühe mit Salmonella. Isolieren Sie aus einer einzelnen Kolonie. Inkubieren Sie die Kultur unter Schütteln bei 200 bis 250 Umdrehungen pro Minute und einer Inkubationstemperatur von 37 Grad Celsius.

Am nächsten Tag die ein Milliliter große Kultur in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen und die Suspension etwa zwei Minuten bei 4.500 × g zentrifugieren, um die Zellen zu pelletieren; anschließend den Überstand abpipettieren und das bakterielle Pellet in einem Milliliter 100 % Ethanol resuspendieren. Die in Ethanol suspendierten Zellen 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und anschließend wie zuvor zentrifugieren. Das Pellet in einem Milliliter PBS resuspendieren. Nach der Zentrifugation den Überstand abpipettieren und das Pellet in einem Milliliter steriler destillierter Wasser resuspendieren. Schließlich die Zellsuspension verdünnen.

Eins zu zwanzig mit destilliertem Wasser verdünnen und bis zur Durchführung der PCR-Vorbereitung bei minus 20 Grad Celsius bis zu einem Monat lagern. Die Vorbereitung und Abgabe der PCR-Reaktionsmischung muss in einem räumlich getrennten Bereich erfolgen und vorzugsweise in einer dedizierten PCR-Arbeitsstation mit UV-Licht durchgeführt werden. Zuerst die Arbeitsfläche mit UV-Licht desinfizieren und anschließend mit 10 %iger Bleiche abwischen. Danach eine Pipette verwenden, die ausschließlich für PCR-Arbeiten vorgesehen ist und mit einer Barrieren-Pipettenspitze ausgestattet ist.

Stellen Sie einen Master-Primer-Stammlösung her, indem Sie die Primer zunächst mit destilliertem Wasser auf eine Konzentration von 5 × 10⁻⁴ M verdünnen. Verdünnen Sie diesen Ansatz anschließend 1:20 mit destilliertem Wasser, um die Arbeitskonzentration von 25 µM zu erreichen. Entnehmen Sie die PCR-Reagenzien und die Ganzzellvorlage aus dem Gefrierschrank und tauen Sie sie auf Eis auf.

Lassen Sie die tac-DNA-Polymerase bis zur Verwendung im Gefrierschrank. Kombinieren Sie die PCR-Reagenzien gemäß Tabelle eins des schriftlichen Protokolls. Danach pipettieren Sie neun Mikroliter der PCR-Reaktion.

Geben Sie die Proben in die Vertiefungen einer sterilen 96-Rundboden-Mikrotiterplatte aus Polystyrol. Beginnen Sie oben in der ersten Spalte und arbeiten Sie sich entlang der Spalte nach unten, dann zur nächsten Spalte. Geben Sie ein Mikroliter destilliertes Wasser in die erste Vertiefung, um eine negative Kontrolle anzusetzen. Geben Sie anschließend 0,5 Mikroliter der positiven Kontrollvorlagen in die PCR-Mischung in die zweite Vertiefung und ein Mikroliter E. coli K-12 DH5α in die dritte Vertiefung.

Geben Sie ein Mikroliter der dritten Probenvorlage in die verbleibenden Vertiefungen für die H1I- und gyp-PCR. Salmonella enterica, CVaR, TYM und Enteritis dienen als positive Kontrollen für die I- und GM-Allele, jeweils. Salmonella CVaR, Heidelberg und Haar sind die positiven Kontrollen, die im zweiten H1-Allel-Typisierungs-PCR zur Detektion der r- und z10-Allele verwendet werden. Setzen Sie anschließend Glas-Kapillaren mit 10-Mikroliter-Kapazität in die dafür vorgesehenen Halterungen für die Idaho-Technologie ein.

Wenn der schnelle Thermocycler sicher im Halter befestigt ist, füllen Sie jedes Glas-Kapillarrohr, indem Sie die Kapillaren auf den Boden der Vertiefungen aufsetzen, mit der PCR-Reaktionsmischung. Kippen Sie den Halter, um die Flüssigkeit im Rohr nach unten laufen zu lassen und so Platz zwischen den Enden und der PCR-Mischung zu schaffen. Bevor Sie die Glasröhrchen mit einer Butanflamme verschließen, um beide Enden der Kapillaren abzudichten, stellen Sie die Kapillarröhrchen zusammen mit dem Halter in den Idaho Technology Rapidcycler und verwenden Sie die im schriftlichen Protokoll in Tabelle eins beschriebenen Thermocycler-Programme für die verschiedenen ELO-Typen in den PCR-Ansätzen.

Wenn das Programm des Thermocyclers abgeschlossen ist, fahren Sie mit dem Schritt der Gelelektrophorese für ein 15 mal 10 Zentimeter großes Gel fort, das 1,5 % molekularbiologische Qualität Agarose enthält und Bromid enthält, gemäß Standardverfahren. Sobald das Gel erstarrt ist, überführen Sie das Gel in eine tauchbare horizontale Elektrophoresekammer, die mit einemfachen TAE-Elektrophoresepuffer, vorgemischt mit 200 Mikrolitern einer 0,25 Milligramm pro Milliliter-Lösung, gefüllt ist.

DNA-Molekulargewichtsmarker mit 40 Mikrolitern sechsfacher DNA-Ladefarbe beladen, 4,8 Mikroliter des vorgemischten DNA-Molekulargewichtsmarkers in die erste, mittlere und letzte Vertiefung geben. Danach eine Glaskapillare, die eine PCR-Probenreaktion enthält, aus dem Halter nehmen und beide Enden der Kapillare mit einem Glasstecher ritzen. Anschließend Daumen und Zeigefinger beider Hände an beiden Seiten der mit dem Glasstecher markierten Kapillare ansetzen und die Kapillare abbrechen. Den Kapillar-Dispenser an das dem PCR-Reaktionsgemisch gegenüberliegende Ende setzen und den Kolben langsam im Uhrzeigersinn drehen, bis die Flüssigkeit am untersten Ende des Röhrchens angekommen ist.

Platzieren Sie die Kapillare in das zu beladende Loch und drehen Sie langsam den Kolben im Uhrzeigersinn, um die gewogene Probe in das Gel zu geben. Achten Sie darauf, das Loch nicht mit der Kapillare zu durchstechen oder eine Luftblase einzubringen, indem Sie weiterdrehen, nachdem die letzte Flüssigkeitsmenge die Kapillare verlassen hat. Sobald alle Proben und Standards beladen sind, stellen Sie die konstante Spannung des Netzteils auf 90 Volt ein.

Nach Beendigung der Elektrophorese das Gel auf einen UV-Durchlichttisch übertragen, um DNA-Fragmente und Molekulargewichtsstandards sichtbar zu machen, und Bilder mit einem Gel-Dock-XR-System aufnehmen. Abschließend die Kapillarhalter in 10 %iger Bleiche 15 bis 30 Minuten lang einlegen, dreimal mit destilliertem Wasser spülen und anschließend zurück in den PCR-Aufbaubereich stellen, um sie trocknen zu lassen.

Dieses erste Gel mit Atheriumbromid-Färbung zeigt die Ergebnisse einer Multiplex-PCR für das mit Salmonella enterica var. enteritidis, Serovar Heidelberg assoziierte O-Allel. In den Gelen 1 und 13 befindet sich eine 100-Basenpaar-DNA-Leiter.

Lane zwei enthält die Multiplex-PCR-Kontrollen für die O-Allele B, C eins, C zwei, D eins und E. Die verbleibenden Lanes drei bis 12 enthalten Salmonella-Isolate. Jedem Salmonella-Isolat wird ein Allel zugeordnet, basierend auf der Übereinstimmung der Amplikonlänge mit der Größe der PCR-Kontrolle und entsprechend der für die verwendeten Allel-Primer-Sets vorhergesagten Größe von links nach rechts. Diese Amplikongrößen betragen wie folgt: D 1 620 Basenpaare, C zwei 400 Basenpaare, E 1 280 Basenpaare, C 1 340 Basenpaare und B 560 Basenpaare.

Dieses Iridium-Bromid-Färbegel zeigt die Ergebnisse einer H-eins-Allel-Multiplex-PCR zur Identifizierung des FLA-Gels in den Allelen Augen und gm. Das Gel wurde in der gleichen Reihenfolge beladen wie zuvor gezeigt. Wiederum wird jedem Isolat ein H-eins-Allel zugewiesen, abhängig vom Vorhandensein eines Amplifikons, das in der Größe mit der PCR-Kontrolle übereinstimmt und wie für die vier von links nach rechts verwendeten H-eins-Allel-Primer-Sets vorhergesagt wurde.

Die Amplifikonsgrößen betragen GM 310 Basenpaare und I 510 Basenpaare. Dieses Agarosegel mit Spinalatheriumbromid-Färbung zeigt die Ergebnisse einer H-eins-Allel-Multiplex-PCR zur Identifizierung der Gellin-Allele r und z 10. Auch hier wurde das Gel wie zuvor gezeigt beladen, und jedem Isolat wurde ein H-eins-Allel zugewiesen, abhängig vom Vorhandensein eines Amplifikons, das in der Größe mit der PCR-Kontrolle übereinstimmt. Wie für die vier verwendeten H-eins-Allel-Primer-Sets vorhergesagt, betragen die Amplifikonsgrößen R 170 Basenpaare und Z zehn 360 Basenpaare. Sobald dies beherrscht ist.

Diese Technik kann bei korrekter Durchführung innerhalb von vier Stunden durchgeführt werden. Achten Sie beim Durchführen dieses Verfahrens darauf, die Vorbereitung der Vorlage, den PCR-Setup und die Gelelektrophorese räumlich voneinander zu trennen, um das Risiko einer PCR-Übertragungskontamination so gering wie möglich zu halten.