Name: Ein Allelotyping PCR zur Identifizierung Salmonella enterica Serovare Enteritidis, Hadar, Heidelberg, und Typhimurium (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: Lernen Sie eine Multiplex-PCR-Methode zur schnellen Identifizierung von Salmonella enterica-Serovaren. Diese Technik ermöglicht die gezielte Detektion spezifischer Allele für Enteritidis, Hadar, Heidelberg und Typhimurium.

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Diese Arbeit wurde von USDA Grants 1999-35212-8680, 2005-01378 und 2010-04288-01, USDA Formula Funds und dem Staat Veterinärmedizin Georgiens Agricultural Research Grant unterstützt. Das Protokoll in dieser Publikation beschrieben wurde für den Einsatz von Studenten im Rahmen der gezielten Forschung Kurse entwickelt: MIBO 4900L, GENE 4960H, BCMB 4960L und BIOL 4960H an der University of Georgia und wird von den Schülern auf verschiedene molekulare Epidemiologie Forschungsprojekte in den Maurer Labor. Wir wollen die vielen Studenten, die Forschung geleistet haben, Maurer und Lee Labors und unserer Abteilung Stuhl, John Glisson für die Unterstützung unserer Bemühungen, Bachelor-Anweisung mit der Forschung zu integrieren danken.

<ol><li>Dauga, C., Zabrovskaia, A., Grimont, P. A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+fragment+length+polymorphism+analysis+of+some+flagellin+genes+of+Salmonella+enterica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Restriction fragment length polymorphism analysis of some flagellin genes of Salmonella enterica.</a> J. Clin. Microbiol. 36, 2835-2843 Forthcoming.</li>
<li>Hong, Y., Liu, T., Lee, M. D., Hofacre, C. L., Maier, M., White, D. G., Ayers, S., Wang, L., Berghaus, R., Maurer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+screen+of+broth+enrichments+for+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis%2C+Hadar%2C+Heidelberg%2C+and+Typhimurium+using+an+allelotyping+multiplex+PCR+that+targets+O+and+H+antigen+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">A rapid screen of broth enrichments for Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium using an allelotyping multiplex PCR that targets O and H antigen alleles.</a> J. Food Prot. 72, 2198-2201 (2009).</li>
<li>Hong, Y., Liu, T., Lee, H. ofacre, Maier, C. L., White, M., Ayers, D. G., Wang, S., Berghaus, L., R, M. aurer <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((J.Rapid+screening+of+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis%2C+Hadar%2C+Heidelberg+and+Typhimurium+using+a+serologically-correlative+allelotyping+PCR+targeting+the+O+and+H+antigen+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">J.Rapid screening of Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg and Typhimurium using a serologically-correlative allelotyping PCR targeting the O and H antigen alleles.</a> BMC Microbiol. , (2008).</li>
<li>Liu, T., Liljebjelke, K., Bartlett, E., Hofacre, C. L., Sanchez, S., Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+nested+PCR+to+detection+of+Salmonella+in+poultry+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">Application of nested PCR to detection of Salmonella in poultry environments.</a> J. Food Prot. 65, 1227-1232 (2002).</li>
<li>Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+and+limitation+of+molecular+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Food+Sci.+Tech%22%5BJournal%5D)">Rapid detection and limitation of molecular techniques.</a> Ann. Rev. Food Sci. Tech. 2, 259-279 (2011).</li>
<li>Moscoso, H., Alvarado, I., Hofacre, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+infectious+bursal+disease+virus+from+bursal+tissues+collected+on+FTA+filter+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Avian+Dis%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of infectious bursal disease virus from bursal tissues collected on FTA filter paper.</a> Avian Dis. 50, 391-396 (2006).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory%22">Molecular cloning: a laboratory</a>. , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).</li>
<li>Wittwer, C. T., Fillmore, G. C., Hillyard, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+polymerase+chain+reaction+capillary+tubes+with+hot+air%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Automated polymerase chain reaction capillary tubes with hot air.</a> Nucleic Acids Res. 17, 4353-4357 (1989).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die meisten kommerziell verfügbaren PCR-Tests für den Nachweis von Salmonella Ziele Gene einzigartig für die Gattung (zB Invalidität). Allerdings sind nicht alle Salmonella gleich in ihrer Fähigkeit, Krankheiten an Menschen oder Prävalenz in Tierpopulationen verursachen. Frühzeitige Erkennung von antigenen Unterschiede in Salmonella LPS O-Antigen und flagellinH1 und H2-Antigene hat zur Differenzierung von Salmonella in mehr als 2.500 Serovare auf diesen antigene Unterschiede. Es gibt 46 verschiedene O-Antigene und 86 verschiedene Flagellin (H)-Antigene in der Gattung Salmonella identifiziert. Salmonella kann man (H1) oder zwei verschiedene (H1 &amp; H2) Flagellin besitzen. Die andere Kombination von O, H1, H2 und Antigenen für die 2.500 Salmonella-Serovare heute anerkannt. Ein Serovar wird auf Basis der antigenen Formel aus der Identifizierung der einzelnen O-und H-Antigene gewonnen zugeordnet. Die antigenen Formel ist wie O geschrieben: H1: H2, und wo &quot;-&quot;, bezieht sich auf das Fehlen von H1 oder H2 Flagellin und &quot;NT&quot; (nicht-typisierbaren) für Salmonellen negativ für die O-Antigen. Zum Beispiel ist der Serovar Typhimurium eine S. zugeordnet enterica Isolat mit der antigenen Formel B: i: 1,2, während Enteritidis eine mit der Formel D1 isolieren gegeben ist: g, m: -. Dieses Antigen-Variation in der Salmonella Bevölkerung ist die äußere Manifestation von Unterschieden bei der Nukleotid-Ebene, daher leicht durch PCR genutzt werden. Wir haben die genetischen Unterschiede mit spezifischen O-und H-Allele assoziiert zu einem allelotyping PCR zur ​​Identifizierung von S. zu entwickeln identifiziert enterica Serovare: Enteritidis, Hadar, Heidelberg, und Typhimurium (3). Die richtige Zuordnung und Berichterstattung von Salmonella Serovar erfordert die Prüfung für alle Allele, die mit O verbunden: H1: H2 antigenen Formeln für Enteritidis (D1: g, m: -), Hadar (C2: z10: e, n, x), Heidelberg (B : r: 1,2), und Typhimurium (B: i: 1,2). Ohne Kenntnis der O-Allels oder Antigen, die Feststellung des H1 g, hat m-Allels allein nicht unbedingt identifizieren Salmonella Enteritidis als andere Salmonella-Serovare isoliert: Agona, Kalifornien, und Montevideo, besitzen auch die gleiche Allel. Während die allelotyping PCR ursprünglich entworfen wurde, um zu erkennen in den Vordergrund genannten Salmonella-Serovare, kann dieser Test identifizieren zusätzliche 19 Serovare (Tabelle 3). Unsere allelotyping PCR wurde ursprünglich entwickelt, um O-und H-Allele zu erkennen. In der Praxis hat es sich mehr praktische und kostengünstige für uns die O-Antigen, das durch Objektträgeragglutination Test zu identifizieren, mit O-spezifischen Antiseren, anstatt die O allelotyping PCR bei der Arbeit mit isolierten Salmonella Kulturen. Aber wir empfehlen die Verwendung der O allelotyping PCR, wenn Ihr Labor verwendet diese PCR als Bildschirm (2) oder zur Eingabe von Salmonellen auf FTA-Karten (6) isoliert eingereicht, und verfügen über eine Salmonellen-spezifische PCR mit dem ersten Bildschirm von Proben (4 ). Begrenzen Sie die allelotyping PCRs, nur die Proben, die als Salmonella durch PCR oder biochemische / antigenen Tests identifiziert werden. Das Protokoll in diesem Artikel beschrieben wird ist für den Einsatz mit dem Idaho Technology Rapidcycler, ein Heißluft-Thermocycler, dass man zu verkleinern Reaktionsvolumina und läuft Reaktionsbedingungen in weniger Zeit als viele Heizblock Thermocycler ermöglicht optimiert. Zur Anpassung dieses Protokoll für die Verwendung mit einem Heizblock Thermocycler kann verlangen, Optimierung von Reaktionsbedingungen empirisch durch Absenken / Anheben Glühtemperaturen; Anpassung Primer-Konzentration oder Einstellung MgCl 2-Konzentrationen. Zum Beispiel mussten wir das Protokoll für die MJ Research PTC-200 Thermocycler wie folgt anzupassen. Arbeiten mit der gleichen Reaktion Bände in Tabelle 1 beschrieben, die Arbeiterklasse Lager concentrationof der i-Primer-Satzes auf 2,5 pM verdünnt war, wurde die Annealingtemperatur von 55 ° C bis 45 ° C und Inkubationszeiten bei der Denaturierung, Annealing und Extension Schritten gesenkt wurde auf 20 s für die i / g, m allelotyping PCR verlängert. Nach der entsprechenden positiven und negativen Kontrollen werden in der ersten Inbetriebnahme und Optimierung für jedes PCR, einschließlich veröffentlichten Protokollen von wesentlicher Bedeutung. Wir empfehlen den Erwerb bekannten Salmonella-Serovare, die speziell Anatum (E1: e, h: 1,6), Enteritidis (D1: g, m: -), Hadar (C2: z10: e, n, x), Heidelberg (B: r : 1,2), Montevideo (C1: g, m, s: 1,2,7) und Typhimurium (B: i: 1,2) sowie ein Labor Escherichia coli K12-Stamm (DH5a, LE393, JM109, etc. ) als positive und negative Kontrollen jeweils für die allelotyping PCR-Tests in diesem Artikel beschrieben. Mehrere dieser Salmonella-Serovare als entweder positiv oder negativ Kontrollen dienen, je nachdem, welches Allel getestet. Bestimmte Vorsichtsmaßnahmen und Richtlinien müssen befolgt während der Durchführung dieser und anderen diagnostischen PCR werden. Erstens die räumliche Trennungder Vorlage Vorbereitung, Aufbau PCR und Gelelektrophorese ist von entscheidender Bedeutung bei der Verhinderung möglich PCR carry-over Kontamination und fehlerhafte Berichterstattung der Falsch-Positiven. Darüber hinaus ist die Einbeziehung der entsprechenden Kontrollen notwendig in jeder Routine PCR wie diese Kontrollen Probleme zu identifizieren, wie sie entstehen und helfen bei der Interpretation der Ergebnisse (5). Am wichtigsten ist, ist die Konsistenz wichtig, insbesondere im Hinblick auf die elektrophoretische Bedingungen für Amplikons (PCR-Produkt) Detektion andestimation von Amplicongröße. Um dies zu verdeutlichen, haben wir absichtlich ausgesetzt Elektrophorese früher als in 1A gedacht. Das Molekulargewicht-Standards (Spuren 1 und 13) und der positiven Kontrolle (Spur 2) sind nicht ausreichend getrennt, um genau zu schätzen Größen oder beobachten Trennung von DNA-Fragmenten, wo es kleine Unterschiede (~ 50 bp) in den Größen. Ausreichende Trennung von DNA-Fragmenten, insbesondere das Molekulargewicht-Standards ist notwendig, da die Berichterstattung Positive ist abhängig von der genauen Schätzung der Amplikon Größe und die Unterscheidung zwischen &quot;richtig positiv&quot; aus nicht-spezifischen Amplikons, die manchmal in den täglichen Ablauf einer PCR (5 eingehalten werden ). Zum Beispiel gibt es eine nicht-spezifische Amplikon in Abbildung 1B, Spur 7 (~ 700 bp groß). Hätte Elektrophorese zu früh, abgesetzt werden, wenn der Farbstoff vor nur auf dem halben Weg Punkt im Agarosegel, gäbe es wenig Unterschied zwischen 500 bp und 700 bp DNA-Fragmente werden. Daher würde Probe in Spur 7 irrtümlich gemeldet haben, als positiv für beide i und g, m-Allele. Schließlich muss man die Grenzen bei jedem Test assoziiert zu erkennen. Mehrere der H1/H2 allelotyping PCR nicht die Trennschärfe, um subtile genetische Unterschiede in Allele aus der H2 1,2 erkennen; 1,5; 1,6; 1,7 Antigen-Komplex; e, n, x / e , n, z15 Antigen-Komplex und dem H1 G-Antigen-Komplex, der die g, m-Allel enthält. Ein oder zwei Aminosäure-Veränderungen Rechnung für die unterschiedliche Epitope in diesen Flagellen-Antigene zu präsentieren. Es war daher schwierig für uns, Grundierungen, dass diese manchmal einzigen Basenpaar Unterschiede in der Flagellin Gensequenz (3) ausgenutzt werden könnte, um Design. Zum Beispiel Salmonella-Serovare Dublin (D1: g, p: -) - sind auch PCR-positiv mit unserem g, mallelotyping Grundierungen und Berta (D1:: f, g, t). Die H2 allelotyping Primer nicht unterscheiden kann, Typhimurium (B: i: 1,2) aus Lagos (B: i: 1,5), Heidelberg (B: r: 1,2) aus Bradford (B: r: 1,5), Winneba (B: r: 1,6), oder Remo (B: r: 1,7), oder Hadar (C2: z10: e, n, x) aus Glostrup (C2: z10: e, n, z15). Zwar ist die Wahrscheinlichkeit der Begegnung mit einigen dieser Serovare: Lagos, Bradford, Winneba, Remo oder Glustrup remote ist, ist es eine Möglichkeit und erfordert entweder die Bereitstellung Disclaimer auf der Prüfungen &quot;Beschränkung oder anderen Bestätigungstest. Im Ergebnis dieser PCR-basierten Serotypisierung schnell identifiziert S. enterica Serovare Enteritidis, Hadar, Heidelberg und Typhimurium und O, H1 und H2-Allele mit 19 zusätzlichen Serotypen assoziiert. Dieser Assay ist eine schnelle, kostengünstige Alternative zu herkömmlichen mikrobiologischen Ansatz zur Serotypisierung Salmonella.

<table border="1"><tbody><tr><th> Material Name </th><th> Typ </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentar </th></tr><tr><td> Luria Bertani </td><td></td><td> Fischer </td><td></td><td> (Oder einem vergleichbaren Quelle) </td></tr><tr><td> Mikrozentrifugenröhrchen </td><td> 1,5 ml Kapazität </td><td> Fischer </td><td></td><td> (Oder einem vergleichbaren Quelle) </td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> 200 Proof </td><td> Fischer </td><td></td><td> (Oder einem vergleichbaren Quelle) </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> Molecular Biology Grade </td><td> Sigma </td><td></td><td> (Oder einem vergleichbaren Quelle; PCR nur) </td></tr><tr><td> 10 x PCR-Puffer: </td><td> 20 mM MgCl 2 </td><td> Idaho Technology </td><td></td><td> (Puffer wird mit BSA, Ficoll und Tartrazin) </td></tr><tr><td></td><td> 30 mM MgCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 40 mM MgCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PCR-Primer </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> dNTP </td><td></td><td> Roche </td><td></td><td> (Oder einem vergleichbaren Quelle) </td></tr><tr><td> Taq DNA Polymerase </td><td></td><td> Denville </td><td></td><td> (Oder einem vergleichbaren Quelle) </td></tr><tr><td> Kapillarpipetten </td><td> 10 pl Volumen </td><td> Idaho Technology </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Schnelle Cycler </td><td></td><td> Idaho Technology </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Low EBO; Molecular Biology Grade </td><td> BioRad </td><td></td><td> (Oder einem vergleichbaren Quelle) </td></tr><tr><td> 50 X TAE-Puffer oder 5X TBE Buffer </td><td></td><td> Fischer </td><td></td><td> (Oder einem vergleichbaren Quelle) </td></tr><tr><td> Ethidiumbromid </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Oder einem vergleichbaren Quelle) </td></tr><tr><td> Horizontal, Tauch-Gel-Elektrophorese Kammer mit Gelform </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Oder einem vergleichbaren Quelle) </td></tr><tr><td> Stromversorgung </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Oder einem vergleichbaren Quelle) </td></tr><tr><td> Molecular Imager Gel Doc-System </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Oder einem vergleichbaren Quelle) </td></tr></tbody></table> Tabelle 4. Materialien

ein allelotyping pcr zur identifizierung salmonella enterica serovare enteritidis, hadar, heidelberg, und typhimurium

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

Aktuelle kommerzielle PCRs Tests zur Identifizierung von Salmonella Zielgene einzigartig zu dieser Gattung. Allerdings gibt es zwei Arten, sechs Unterarten und über 2.500 verschiedene Salmonella Serovare, und nicht alle sind gleich in ihrer Bedeutung für die öffentliche Gesundheit. Zum Beispiel finden S. enterica Subspezies IIIa Arizona auf einem Tisch Ei-Schicht Betrieb ist unbedeutend im Vergleich zu der Isolierung von S. enterica Subspezies I Serovar Enteritidis, die führende Ursache von Salmonellose Zusammenhang mit dem Konsum von Konsumeiern. Serovare sind basierend auf antigene Unterschiede in Lipopolysaccharid (LPS) (O-Antigen) und Flagellin (H1 und H2-Antigene) identifiziert. Diese antigenen Unterschiede sind das äußere Erscheinungsbild der Vielfalt der Gene und Gen-Allele, die mit diesem Phänotyp assoziiert. Wir haben eine allelotyping entwickelt, Multiplex-PCR, die Tasten auf genetische Unterschiede zwischen vier großen S. enterica Subspezies I Serovare bei Geflügel gefunden und verbunden mit erheblichen menschlichen Erkrankungen in den USA. Die PCR-Primerpaare wurden die wichtigsten Gene oder Sequenzen nur an einem bestimmten Salmonella Serovar und entwickelt, um ein Amplikon mit einer Größe spezifisch für das Gen oder Allel produzieren ausgerichtet. Salmonella Serovar ist es, eine auf der Kombination von PCR-Test-Ergebnisse für spezifische LPS-Isolat zugeordnet und Flagellin-Gen-Allele. Die Multiplex-PCRs in diesem Artikel beschrieben werden für den Nachweis von S. spezifischen enterica Subspezies I Serovare Enteritidis, Hadar, Heidelberg, und Typhimurium. Hier zeigen wir, wie die Multiplex-PCRs zu verwenden, um Serovar für eine Salmonellen identifizieren, isolieren.

Wir beschreiben eine Multiplex-PCR zum schnellen Nachweis von Salmonella enterica Serovare Enteritidis, Hadar, Heidelberg, und Typhimurium. Spezifische Salmonella-Serovare können, indem sie auf einer Multiplex-PCR, um Gene und Sequenzen einzigartig für die O-Antigen-Biosynthese-Cluster und Flagellin eines bestimmten Serovar identifiziert werden. Serovar wird dann auf eine Salmonellen zugeordnet isolieren über das Auftreten von bestimmten, Größe Amplikons (PCR-Produkt), entsprechend dem Ziel Allel auf.

Ein Allelotyping PCR zur Identifizierung Salmonella enterica Serovare Enteritidis, Hadar, Heidelberg, und Typhimurium

Aktuelle kommerzielle PCR-Tests zum Nachweis von Salmonella zielen auf Gene ab, die für diese Gattung charakteristisch sind. Es gibt jedoch zwei Arten, sechs Unterarten und über ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, spezifische Salmonella-Antigenallele zu identifizieren. Dies wird erreicht, indem mittels PCR gezielt nach spezifischen Sequenzunterschieden gesucht wird, die mit diesen Allelen assoziiert sind. Die Probenvorlage wird einer PCR-Reaktionsmischung hinzugefügt, die allelespezifische Primer sowie die OH1- und H2-Alleltypisierung enthält.Die PCR wird im Thermocycler durchgeführt. Anschließend werden die PCR-Proben nach Größe mittels Gelelektrophorese getrennt, um die Größe des Amplikons zu bestimmen, falls eines in jeder Probe oder Isolat vorhanden ist. Die Amplikongröße wird dann mit der erwarteten Größe für jeden der verwendeten Primer-Sätze verglichen, sodass Ergebnisse erhalten werden, die die Identifizierung eines spezifischen Salmonellen-Antigens zeigen.Die Allele mittels PCR werden anschließend anhand der Ergebnisse für die OH-eins- und H-zwei-Multiplex-PCR-Assays der SEROVAR zugeordnet. Der Hauptvorteil des in diesem Video beschriebenen Protokolls gegenüber SYP liegt darin, dass es schneller, einfacher zu interpretieren und kostengünstiger ist. Diese Methode kann helfen, einige zentrale Fragen im Bereich der Epidemiologie zu beantworten, beispielsweise die Verteilung und das Überdauern von Salmonella-VARs innerhalb oder zwischen Geflügel- oder Milchviehbetrieben zu bestimmen.Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf die schnelle Diagnose von Salmonellose, die auf Salmonella-Serovare arius oder urian zurückgeht. Die visuelle Darstellung dieser Methode ist entscheidend, um zu verstehen, wie man diese PCR-basierte Methode zur Typisierung von Salmonella auf der Ebene der Serovare anwendet. Adriana Pedroso und Yin Chang, Wissenschaftlerinnen in den Lee-Mauer-Labors an der University of Georgia, werden dieses Verfahren demonstrieren, um eine Ganzzell-DNA-Vorlage für die anschließende PCR-Reaktion vorzubereiten.Inokulieren Sie zunächst ein Milliliter LB-Brühe mit Salmonella. Isolieren Sie aus einer einzelnen Kolonie. Inkubieren Sie die Kultur unter Schütteln bei 200 bis 250 Umdrehungen pro Minute und einer Inkubationstemperatur von 37 Grad Celsius.Am nächsten Tag die ein Milliliter große Kultur in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen und die Suspension etwa zwei Minuten bei 4.500 × g zentrifugieren, um die Zellen zu pelletieren; anschließend den Überstand abpipettieren und das bakterielle Pellet in einem Milliliter 100 % Ethanol resuspendieren. Die in Ethanol suspendierten Zellen 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und anschließend wie zuvor zentrifugieren. Das Pellet in einem Milliliter PBS resuspendieren. Nach der Zentrifugation den Überstand abpipettieren und das Pellet in einem Milliliter steriler destillierter Wasser resuspendieren. Schließlich die Zellsuspension verdünnen.Eins zu zwanzig mit destilliertem Wasser verdünnen und bis zur Durchführung der PCR-Vorbereitung bei minus 20 Grad Celsius bis zu einem Monat lagern. Die Vorbereitung und Abgabe der PCR-Reaktionsmischung muss in einem räumlich getrennten Bereich erfolgen und vorzugsweise in einer dedizierten PCR-Arbeitsstation mit UV-Licht durchgeführt werden. Zuerst die Arbeitsfläche mit UV-Licht desinfizieren und anschließend mit 10 %iger Bleiche abwischen. Danach eine Pipette verwenden, die ausschließlich für PCR-Arbeiten vorgesehen ist und mit einer Barrieren-Pipettenspitze ausgestattet ist.Stellen Sie einen Master-Primer-Stammlösung her, indem Sie die Primer zunächst mit destilliertem Wasser auf eine Konzentration von 5 × 10⁻⁴ M verdünnen. Verdünnen Sie diesen Ansatz anschließend 1:20 mit destilliertem Wasser, um die Arbeitskonzentration von 25 µM zu erreichen. Entnehmen Sie die PCR-Reagenzien und die Ganzzellvorlage aus dem Gefrierschrank und tauen Sie sie auf Eis auf. Lassen Sie die tac-DNA-Polymerase bis zur Verwendung im Gefrierschrank. Kombinieren Sie die PCR-Reagenzien gemäß Tabelle eins des schriftlichen Protokolls. Danach pipettieren Sie neun Mikroliter der PCR-Reaktion.Geben Sie die Proben in die Vertiefungen einer sterilen 96-Rundboden-Mikrotiterplatte aus Polystyrol. Beginnen Sie oben in der ersten Spalte und arbeiten Sie sich entlang der Spalte nach unten, dann zur nächsten Spalte. Geben Sie ein Mikroliter destilliertes Wasser in die erste Vertiefung, um eine negative Kontrolle anzusetzen. Geben Sie anschließend 0,5 Mikroliter der positiven Kontrollvorlagen in die PCR-Mischung in die zweite Vertiefung und ein Mikroliter E. coli K-12 DH5α in die dritte Vertiefung.Geben Sie ein Mikroliter der dritten Probenvorlage in die verbleibenden Vertiefungen für die H1I- und gyp-PCR. Salmonella enterica, CVaR, TYM und Enteritis dienen als positive Kontrollen für die I- und GM-Allele, jeweils. Salmonella CVaR, Heidelberg und Haar sind die positiven Kontrollen, die im zweiten H1-Allel-Typisierungs-PCR zur Detektion der r- und z10-Allele verwendet werden. Setzen Sie anschließend Glas-Kapillaren mit 10-Mikroliter-Kapazität in die dafür vorgesehenen Halterungen für die Idaho-Technologie ein.Wenn der schnelle Thermocycler sicher im Halter befestigt ist, füllen Sie jedes Glas-Kapillarrohr, indem Sie die Kapillaren auf den Boden der Vertiefungen aufsetzen, mit der PCR-Reaktionsmischung. Kippen Sie den Halter, um die Flüssigkeit im Rohr nach unten laufen zu lassen und so Platz zwischen den Enden und der PCR-Mischung zu schaffen. Bevor Sie die Glasröhrchen mit einer Butanflamme verschließen, um beide Enden der Kapillaren abzudichten, stellen Sie die Kapillarröhrchen zusammen mit dem Halter in den Idaho Technology Rapidcycler und verwenden Sie die im schriftlichen Protokoll in Tabelle eins beschriebenen Thermocycler-Programme für die verschiedenen ELO-Typen in den PCR-Ansätzen.Wenn das Programm des Thermocyclers abgeschlossen ist, fahren Sie mit dem Schritt der Gelelektrophorese für ein 15 mal 10 Zentimeter großes Gel fort, das 1,5 % molekularbiologische Qualität Agarose enthält und Bromid enthält, gemäß Standardverfahren. Sobald das Gel erstarrt ist, überführen Sie das Gel in eine tauchbare horizontale Elektrophoresekammer, die mit einemfachen TAE-Elektrophoresepuffer, vorgemischt mit 200 Mikrolitern einer 0,25 Milligramm pro Milliliter-Lösung, gefüllt ist.DNA-Molekulargewichtsmarker mit 40 Mikrolitern sechsfacher DNA-Ladefarbe beladen, 4,8 Mikroliter des vorgemischten DNA-Molekulargewichtsmarkers in die erste, mittlere und letzte Vertiefung geben. Danach eine Glaskapillare, die eine PCR-Probenreaktion enthält, aus dem Halter nehmen und beide Enden der Kapillare mit einem Glasstecher ritzen. Anschließend Daumen und Zeigefinger beider Hände an beiden Seiten der mit dem Glasstecher markierten Kapillare ansetzen und die Kapillare abbrechen. Den Kapillar-Dispenser an das dem PCR-Reaktionsgemisch gegenüberliegende Ende setzen und den Kolben langsam im Uhrzeigersinn drehen, bis die Flüssigkeit am untersten Ende des Röhrchens angekommen ist.Platzieren Sie die Kapillare in das zu beladende Loch und drehen Sie langsam den Kolben im Uhrzeigersinn, um die gewogene Probe in das Gel zu geben. Achten Sie darauf, das Loch nicht mit der Kapillare zu durchstechen oder eine Luftblase einzubringen, indem Sie weiterdrehen, nachdem die letzte Flüssigkeitsmenge die Kapillare verlassen hat. Sobald alle Proben und Standards beladen sind, stellen Sie die konstante Spannung des Netzteils auf 90 Volt ein.Nach Beendigung der Elektrophorese das Gel auf einen UV-Durchlichttisch übertragen, um DNA-Fragmente und Molekulargewichtsstandards sichtbar zu machen, und Bilder mit einem Gel-Dock-XR-System aufnehmen. Abschließend die Kapillarhalter in 10 %iger Bleiche 15 bis 30 Minuten lang einlegen, dreimal mit destilliertem Wasser spülen und anschließend zurück in den PCR-Aufbaubereich stellen, um sie trocknen zu lassen.Dieses erste Gel mit Atheriumbromid-Färbung zeigt die Ergebnisse einer Multiplex-PCR für das mit Salmonella enterica var. enteritidis, Serovar Heidelberg assoziierte O-Allel. In den Gelen 1 und 13 befindet sich eine 100-Basenpaar-DNA-Leiter. Lane zwei enthält die Multiplex-PCR-Kontrollen für die O-Allele B, C eins, C zwei, D eins und E. Die verbleibenden Lanes drei bis 12 enthalten Salmonella-Isolate. Jedem Salmonella-Isolat wird ein Allel zugeordnet, basierend auf der Übereinstimmung der Amplikonlänge mit der Größe der PCR-Kontrolle und entsprechend der für die verwendeten Allel-Primer-Sets vorhergesagten Größe von links nach rechts. Diese Amplikongrößen betragen wie folgt: D 1 620 Basenpaare, C zwei 400 Basenpaare, E 1 280 Basenpaare, C 1 340 Basenpaare und B 560 Basenpaare.Dieses Iridium-Bromid-Färbegel zeigt die Ergebnisse einer H-eins-Allel-Multiplex-PCR zur Identifizierung des FLA-Gels in den Allelen Augen und gm. Das Gel wurde in der gleichen Reihenfolge beladen wie zuvor gezeigt. Wiederum wird jedem Isolat ein H-eins-Allel zugewiesen, abhängig vom Vorhandensein eines Amplifikons, das in der Größe mit der PCR-Kontrolle übereinstimmt und wie für die vier von links nach rechts verwendeten H-eins-Allel-Primer-Sets vorhergesagt wurde.Die Amplifikonsgrößen betragen GM 310 Basenpaare und I 510 Basenpaare. Dieses Agarosegel mit Spinalatheriumbromid-Färbung zeigt die Ergebnisse einer H-eins-Allel-Multiplex-PCR zur Identifizierung der Gellin-Allele r und z 10. Auch hier wurde das Gel wie zuvor gezeigt beladen, und jedem Isolat wurde ein H-eins-Allel zugewiesen, abhängig vom Vorhandensein eines Amplifikons, das in der Größe mit der PCR-Kontrolle übereinstimmt. Wie für die vier verwendeten H-eins-Allel-Primer-Sets vorhergesagt, betragen die Amplifikonsgrößen R 170 Basenpaare und Z zehn 360 Basenpaare. Sobald dies beherrscht ist.Diese Technik kann bei korrekter Durchführung innerhalb von vier Stunden durchgeführt werden. Achten Sie beim Durchführen dieses Verfahrens darauf, die Vorbereitung der Vorlage, den PCR-Setup und die Gelelektrophorese räumlich voneinander zu trennen, um das Risiko einer PCR-Übertragungskontamination so gering wie möglich zu halten.

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Forschung

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Hier präsentieren wir ein Protokoll, um DNA-Proben von Lebensmitteln und ökologischen Mikrobiome abgestimmte Erkennung und Subtypisierung von Salmonellen durch Sequenzierung Quasimetagenomic vorzubereiten. Der kombinierte Einsatz von Kultur Bereicherung, Immunomagnetic Separation (IMS) und mehrfache Verschiebung Verstärkung (MDA) ermöglicht wirksame Konzentration der Salmonellen genomische DNA aus Lebensmitteln und Umweltproben.

Quasi-metagenomischen Analyse Salmonella aus Lebensmitteln und Umweltproben

Der hier vorgestellte Multi-Locus Variable-number Tandem-Repeat Analysis (MLVA)-Assay ermöglicht eine kostengünstige, robuste und tragbare hochauflösende Genotypisierung des fischpathogenen Bakteriums Yersinia ruckeri. Ausgehend von reinen Kulturen verwendet der Assay Multiplex-PCR- und Kapillarelektrophorese, um zehn Loci MLVA-Profile für nachgelagerte Anwendungen zu erstellen.

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analyse des Fischpathogenen Bakteriums Yersinia ruckeri durch Multiplex-PCR und Kapillarelektrophorese

Dieser molekulare Ansatz zur Bestimmung der bakteriellen Fitness ermöglicht die präzise und genaue Detektion von Mikroorganismen mithilfe einzigartiger genomischer DNA-Barcodes, die über digitale PCR quantifiziert werden. Das Protokoll beschreibt die  Berechnung des Wettbewerbsindex für Salmonellenstämme; Die Technologie ist jedoch leicht an Protokolle anpassbar, die eine absolute Quantifizierung jedes genetisch verformbaren Organismus erfordern.

Digitaler PCR-basierter Wettbewerbsindex für High-Throughput-Analyse der Fitness bei Salmonellen

Loop-vermittelte isotherme Amplifikation (LAMP) ist ein isothermer Nukleinsäure-Amplifikationstest (iNAAT), der ein breites Interesse am Nachweisvon Erreger geweckt hat. Hier präsentieren wir ein multilaboriertes Salmonella LAMP-Protokoll als schnelle, zuverlässige und robuste Methode zum Screening von Salmonellen in Tierfutter und zur Bestätigung mutmaßlicher Salmonellen aus der Kulturisolierung.

Loop-vermittelte isotherme Amplifikation zum Screening von Salmonellen in Tierfutter und Bestätigung von Salmonellen aus der Kulturisolierung

Dieser Artikel stellt eine Reihe von aufeinanderfolgenden Methoden zur Expression und Reinigung von Salmonella typhimurium tryptophan synthase vor, die dieses Protokoll zu einem schnellen System zur Reinigung des Proteinkomplexes an einem Tag machen. Abgedeckte Methoden sind ortsgerichtete Mutagenese, Proteinexpression in Escherichia coli,Affinitätschromatographie, Gelfiltrationschromatographie und Kristallisation.

PCR-Mutagenese, Klonierung, Expression, schnelle Proteinreinigungsprotokolle und Kristallisation des Wildtyps und der mutierten Formen der Tryptophan-Synthase

Die Machbarkeit von Gesamtgenomsequenzierungsstrategien (WGS) mit Tischgeräten hat die Genomabfrage jeder Mikrobe von Relevanz für die öffentliche Gesundheit in einer Laborumgebung vereinfacht. Eine methodische Anpassung des Workflows für bakterielle WGS wird beschrieben und eine bioinformatische Pipeline zur Analyse vorgestellt.

Charakterisierung eines pathogenen Escherichia coli-Stammes aus Oreochromis spp. Farmen mit Ganzgenomsequenzierung

Lernen Sie eine Multiplex-PCR-Methode zur schnellen Identifizierung von Salmonella enterica-Serovaren. Diese Technik ermöglicht die gezielte Detektion spezifischer Allele für Enteritidis, Hadar, Heidelberg und Typhimurium.

Ein Allelotyping PCR zur Identifizierung Salmonella enterica Serovare Enteritidis, Hadar, Heidelberg, und Typhimurium

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